溫湯殺雄后甘蔗花穗生物學(xué)特性觀察

常海龍　邱永生　方娜　張偉　郭育強　陳俊呂　吳建濤　劉壯　周峰　陳道勤　王勤南

摘要：【目的】跟蹤調(diào)查甘蔗花穗經(jīng)不同溫度水浴殺雄后的生物學(xué)特征變化，評價溫湯殺雄效果，為進(jìn)一步提高甘蔗雜交結(jié)實提供理論依據(jù)。【方法】以花粉較多的甘蔗品種ROC22和科5為試驗材料，設(shè)48、50和52 ℃溫水各處理 3 min 3個處理，以不進(jìn)行溫度處理為對照，對各處理2個甘蔗品種花穗的開花動態(tài)、雌蕊外部形態(tài)變化、單穗散粉量、花粉成熟度、花粉活力變化及授予外源花粉4 h后柱頭原位萌發(fā)情況和結(jié)實性進(jìn)行對比分析?！窘Y(jié)果】與對照相比，不同溫度處理下2個甘蔗品種的花穗均延遲開花，溫度越高，延遲時間越長;單穗散粉量和花粉活力顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01，下同）降低;隨著處理溫度的升高，單穗自交出苗數(shù)和異交出苗數(shù)極顯著降低，假雜種比例呈先降低后升高的變化趨勢，其中以50 ℃處理的假雜種比例最低（0.09～0.11），處理效果最佳。3種溫度處理對雌蕊外觀、柱頭可授性及成熟花粉影響較小。【結(jié)論】結(jié)合甘蔗雜交育種對實生苗后代選擇需要，以50 ℃溫水處理3 min的去雄效果較理想，可減少后代區(qū)分假雜種的人工投入，提高育種效率。

關(guān)鍵詞： 甘蔗;花穗;溫湯殺雄;花粉活力;柱頭可授性

中圖分類號： S566.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：2095-1191（2019）12-2665-08

Biological characteristics of sugarcane tassels treated with the emasculation technology by hot water

CHANG Hai-long， QIU Yong-sheng， FANG Na， ZHANG Wei， GUO Yu-qiang，

CHEN Jun-lü， WU Jian-tao， LIU Zhuang， ZHOU Feng， CHEN Dao-qin，WANG Qin-nan*

（Hainan Sugarcane Breeding Station of Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute/Guangdong Sugarcane Germplasm Resources and Utilization of Scientific Observation Test Station， Ministry of Agriculture and

Rural Affairs， Sanya， Hainan? 572025， China）

Abstract：【Objective】According to a follow-up research on the biological characteristics of sugarcane tassels treated with the emasculation technology by hot water through three different temperatures， the relative effects were assessed，which provided a theoretical basis for further enhancing the efficiency of sugarcane tassel hybridization. 【Method】After treating with 3 min at 48，50 and 52 ℃， the flower dynamics，morphological characteristics in pistils，amount of pollen in single tassel，pollen maturity，pollen activity，stigma receptivity and natural fecundity of sugarcane varieties ROC22 and Ke 5 tassels that were transferred exogenous pollens more than 4 h were used to conduct the research on stigma germination observation and natural fecundity systematically. 【Result】Compared to control groups， after treating with 3 min at different temperatures， ROC22 and Ke 5 tassels delayed flowering， and the higher the? temperature was，the longer delayed flowering time. In addition， the amount of pollen in single tassel and pollen activity were reduced significantly（P<0.05） or extremely（P<0.01， the same below）. With the increasing of temperature，the number of selfing and outcrossing seed germination seedlings in single tassels decreased at extremely significant level. Meanwhile，false hybrids ratio presented on a tendency of decreasing first and then increasing， the emasculation treatment with 3 min at 50 ℃ had the best effect and false hybrids ratio was the lowest（0.09-0.11）. The effects of three different temperatures on pistil appearance，stigma receptivity and mature pollen were small. 【Conclusion】 Considering the importance of sugarcane cross breeding to the selection of seedlings progenies， emasculation effects are the best after treating with 3 min at 50 ℃ water temperature， which reduces the labor efforts of distinguishing false hybrids and improves the breeding efficiency.

Key words： sugarcane; tassels; emasculation technology by hot water; pollen activity; stigma receptivity

0 引言

【研究意義】甘蔗為無性繁殖作物，花穗雜交仍是目前甘蔗種質(zhì)創(chuàng)新和新品種選育的主要方法（李奇?zhèn)ィ?000;劉少謀等，2011;經(jīng)艷芬等，2019），該方法主要是利用甘蔗有性雜交的雜種優(yōu)勢。甘蔗花為頂生的大型圓錐花序，1個花穗上有小穗6000～18000個，每個小穗內(nèi)含有1個子房、2個柱頭、3～4個花藥，為雌雄同花（常海龍等，2017a）。由于甘蔗花穗的小穗極小，難以人工去雄，通常以少花粉親本作為母本、多花粉親本作為父本進(jìn)行雜交選育（王麗萍和馬麗，2005;吳建濤等，2017），雜交后代不可避免會有假雜種產(chǎn)生，有的高達(dá)40%以上，導(dǎo)致一些優(yōu)異親本可能未被有效利用，而大量不適宜的自交種被保留下來頻繁組配雜交，嚴(yán)重影響了甘蔗選育種的效率（李奇?zhèn)サ龋?000;張躍彬等，2008）。因此，很有必要在甘蔗進(jìn)行有性雜交前對母本進(jìn)行去雄處理?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】雌雄同花作物常用的花穗去雄方法有化學(xué)法殺雄（Adugna et al.，2004;Yu et al.，2006，2009;趙彩霞等，2013）、徒手去雄（詹永發(fā)等，2008）、水分敏感性殺雄、溫湯去雄和輻射誘導(dǎo)殺雄。趙桂琴（2000）研究表明，草地早熟禾溫湯去雄的最佳處理為47 ℃、2 min，扁稈早熟禾溫湯去雄的最佳處理為48 ℃、1 min或47 ℃、3 min。樊龍江等（2003）研究認(rèn)為，露水或噴水可使水稻花粉吸水漲破，達(dá)到去雄目的，將秈稻穎殼剪去2/3后，經(jīng)過露水或噴水去雄的套袋自交結(jié)實率分別為2.1%和2.8%，異交結(jié)實率為34.2%和29.2%，可作為快速簡單的去雄方法，具有一定的應(yīng)用價值。范瑞等（2014）研究表明，在向日葵花蕾直徑為1 cm時噴施0.035 mg/g赤霉素后可顯著降低花粉活力，降低自交結(jié)實率而提高異交結(jié)實率。陶麗等（2015）研究表明，澳洲堅果盛花期采用切管連被去雄后48 h授粉，可避免偽雜種產(chǎn)生，提高雜交種純度，顯著提高澳洲堅果的雜交育種效率。耿雷躍等（2015）對比了10份水稻材料分別采用溫湯殺雄和剪穎殺雄的效果，發(fā)現(xiàn)45 ℃溫水中浸泡5 min較剪穎殺雄雜交結(jié)實率更高，自交結(jié)實率更低，是相對高效的水稻殺雄方式。鄭建敏等（2018）研究認(rèn)為，施用小麥化學(xué)殺雄劑SC2011 30 L/ha時，小麥雄性不育度大于98%，且對柱頭活力無影響，可顯著提高雜交小麥的育種效率。關(guān)于甘蔗花穗去雄的研究，本課題組前期試驗發(fā)現(xiàn)，用50 ℃溫水浸泡甘蔗花穗5 min可達(dá)到一定的去雄效果（周峰等，2016）?！颈狙芯壳腥朦c】本課題組前期借鑒其他作物去雄方法嘗試對甘蔗花穗進(jìn)行人工去雄、化學(xué)去雄和溫湯殺雄，發(fā)現(xiàn)以溫湯殺雄法效果較好，但關(guān)于甘蔗花穗去雄后整個花穗形態(tài)變化及自交不育的原理仍需進(jìn)一步探究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過跟蹤調(diào)查甘蔗花穗經(jīng)不同溫度水浴殺雄后整個花期的開放特征、雌蕊外部形態(tài)、散粉量、花粉活力、花粉管在柱頭的生長動態(tài)及雜交結(jié)實性，探討不同溫度處理對花穗生長結(jié)實的影響，為進(jìn)一步提高甘蔗花穗雜交結(jié)實提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

以種植在海南甘蔗育種場親本圃內(nèi)花粉較多的ROC22和科5為試驗材料。

1. 2 試驗方法

2017年12月上旬起，試驗前1 d選取長勢一致、包莖長根，且第2 d可開花的親本，靠發(fā)根底部整齊砍斷，帶回溫室大棚將其養(yǎng)植于充氧的水槽中。翌日上午8：00將花穗上部1/5處花藥即將成熟的枝條及下部1/5處未散開的枝條全部剪去，僅留中間的3/5處花穗，以保證試驗材料一致性。將水浴鍋溫度設(shè)定為48、50和52 ℃，不同溫度下花穗處理時間均為3 min（前期試驗過程中發(fā)現(xiàn)許多材料花穗經(jīng)50 ℃處理5 min后結(jié)實極差甚至死亡而無法完成雜交授粉，所以本研究中處理時間減少至3 min），每處理各6株，每品種設(shè)6株對照，對照花穗修剪后不設(shè)溫度處理。將處理后的甘蔗及對照分別放置在獨立的單元格中，防止串粉。每日觀察甘蔗花穗，記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。

1. 3 測定項目及方法

1. 3. 1 開花生物學(xué)特性 自處理翌日開始每天上午8：00對花穗進(jìn)行觀察取樣，統(tǒng)計其開花所需天數(shù)及開花程度，并在體視顯微鏡下觀察花穗各部分的形態(tài)特征。每次隨機取開花植株10個小穗，在體視顯微鏡下用鑷子和針頭將外穎殼剝開觀察柱頭、子房的形態(tài)，并拍照記錄比較。

1. 3. 2 單穗花粉量及花粉活力測定 自處理翌日開始，每處理選取3株花穗，上午8：00對其單穗取粉，用5 mm方孔篩去掉花藥等雜質(zhì)，天平稱重后迅速裝入離心管中，帶回實驗室，利用碘化鉀染色法檢驗花粉成熟度，用花粉質(zhì)量分析儀（Ampha Z30）檢驗花粉活力。

所選試驗材料花粉量較多，單穗取粉后還會繼續(xù)散粉，穎花開放持續(xù)至9：30左右，同時通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，花穗柱頭沾滿花粉，且許多花粉均已萌發(fā)，花粉管深入到子房底部，完成受精過程，故每天取一次花粉不影響其正常結(jié)實。

1. 3. 3 柱頭可授性原位萌發(fā)檢測 每處理選取另外3株花穗自開花日起，上午8：00人工授予ROC22新鮮花粉，每日授粉一次，直至開花結(jié)束。授粉4 h后取樣，每株花穗采取當(dāng)日授粉的10個柱頭，在體視顯微鏡下用鑷子挑出其完整的柱頭和子房，將其保存在FAA固定液（50 %乙醇89 mL、冰乙酸6 mL和甲醛溶液5 mL混合）中，固定時間在24 h以上。經(jīng)水洗、軟化透明、苯胺藍(lán)染色等處理，最后對處理好的材料進(jìn)行鏡檢。鏡檢時將甘蔗子房和柱頭置于載玻片上，加入1滴緩沖液，蓋上蓋玻片后用鑷子輕輕壓實，利用熒光顯微鏡（OLYMPUS BX53+DP80）將玻片在近紫外光315～380 mm的波長下鏡檢拍照記錄。

1. 3. 4 花穗結(jié)實出苗情況統(tǒng)計 試驗結(jié)束后，所有試驗材料花穗套袋移出單元格放在陽光充足的溫室內(nèi)，等待成熟。收獲后在陽光下晾曬5～7 d，促其后熟，然后在低溫干燥環(huán)境下放置15～30 d，誘導(dǎo)種子復(fù)蘇。2018年3月將處理后的甘蔗種子播種于40 cm×30 cm帶孔育苗盤中，每穗播種1盤。育苗盤底部平鋪一層3 cm厚營養(yǎng)土（泥炭土∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1），甘蔗花穗平鋪到營養(yǎng)土上，蓋上一層薄薄的蛭石，澆透水后育苗盤蓋上薄膜，置于28～30 ℃溫室內(nèi)，5 d左右即可出苗。待實生苗長至高8 cm后統(tǒng)計其出苗情況。以測定花粉活力的花穗出苗數(shù)定為自交出苗數(shù)，以人工授粉ROC22花粉的花穗定為異交出苗數(shù)，假雜種比例=自交出苗數(shù)/異交出苗數(shù)。

1. 4 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2010進(jìn)行整理并制表，以SPSS 22.0對花穗散粉量、花粉活力和出苗數(shù)進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2. 1 溫湯殺雄后甘蔗花穗開花動態(tài)變化

由表1可知，2個甘蔗品種的花穗經(jīng)溫湯殺雄處理后，開花始期較對照均有所延遲，且去雄溫度越高，延遲天數(shù)越長，2個品種間開花動態(tài)略有差異。ROC22的花穗經(jīng)不同溫度處理后第1 d均未開花，對照組第2 d有少量穎花開放，開花高峰期在第3 d和第4 d，第5 d開花全部結(jié)束，整個開花期持續(xù)4 d; 48 ℃處理的花穗在第3 d開始開花，高峰期在第4 d，第6 d開花結(jié)束，整個開花期持續(xù)4 d;50 ℃處理的花穗開放情況與48 ℃處理相似，但開花始期相對延遲1 d，至第7 d全部開花結(jié)束;52 ℃處理的花穗在處理后第5 d開始開花，整個開花期持續(xù)3 d?？?的花穗開花情況與ROC22相似，但不同處理的開花始期均較ROC22花穗提前1 d，對照組第1 d穎花已開放1/3，第4 d開花全部結(jié)束，48和50 ℃處理的花穗均在處理后5 d內(nèi)全部開花結(jié)束， 52 ℃處理的花穗第4 d起穎花有少許開放，至第7 d開花結(jié)束。

2. 2 溫湯殺雄后甘蔗花穗雌蕊動態(tài)變化

2個甘蔗品種的花穗經(jīng)溫湯處理后，不同處理花穗穎花開放時間存在差異，跟蹤調(diào)查整個花期開放過程，并于穎花開放的當(dāng)天上午8：00及時采集剛裸露的柱頭在體視顯微鏡下觀察其外部形態(tài)，結(jié)果見圖1、圖2和表2。2個甘蔗品種不同處理間柱頭外觀差異不明顯，均為深紅色或紫紅色的羽狀柱頭，呈蓬松狀態(tài)，顏色鮮艷，子房相對于柱頭較小，呈橢圓形，顏色亮麗，富有光澤（圖1和圖2）。ROC22對照組花穗柱頭羽狀鱗片上沾滿花粉，各溫度處理的花穗柱頭上也沾有少許花粉，且總體來看處理溫度越高，柱頭沾染花粉越少，說明ROC22花穗經(jīng)溫湯處理后散粉量降低，但仍有部分花粉沾染到柱頭上（圖1）。科5對照組和48 ℃處理的花穗柱頭沾染花粉量明顯高于ROC22花穗柱頭，50 ℃處理的花穗柱頭沾染花粉量明顯減少，52 ℃處理花穗柱頭在連續(xù)觀察的4 d中柱頭沾染花粉量均較少（圖2）。由此可知，2個甘蔗品種經(jīng)不同溫度去雄后柱頭粘粉量明顯減少，但雌蕊外部形態(tài)無明顯變化。

2. 3 溫湯殺雄后甘蔗單穗散粉量及活力變化

由表3可知，隨著處理溫度的升高，單穗散粉量快速降低，尤其是經(jīng)52 ℃溫湯處理后2個品種的單穗散粉量僅0.01 g，且僅在第一次開花時能采集到少許花粉，同一天內(nèi)多數(shù)處理間花穗散粉量有極顯著差異（P<0.01，下同）。從花粉成熟度來看，ROC22花穗48和50 ℃處理的花粉成熟度與對照組差異不顯著（P>0.05），三者花粉成熟度均在75%以上，且極顯著高于52 ℃處理;科5的花粉成熟度隨溫湯處理溫度的升高呈波浪式變化，對照組和50 ℃處理的花粉成熟度較高，均極顯著高于48和52 ℃處理。經(jīng)溫湯處理后，2個品種的花粉活力均極顯著低于對照，其中52 ℃處理花粉活力降至21%以下，其余處理的花粉活力仍在60%以上，理論上在花穗雜交授粉中均具有極高的結(jié)實性。綜上所述，經(jīng)溫湯處理后，2個甘蔗品種花穗的散粉量均有明顯降低，去雄溫度為52 ℃時對花粉成熟度及花粉活力影響極顯著。

2. 4 柱頭可授性原位萌發(fā)檢測

甘蔗花穗穎花開放時間一般為晴朗天氣的上午7：00—10：00，為準(zhǔn)確跟蹤溫水處理后花穗穎花開放程度，每日上午8：00仔細(xì)查看花穗的開花情況，穎花開放后及時授予外源花粉并做好標(biāo)記，4 h后取柱頭，熒光顯微鏡下觀察其花粉萌發(fā)情況，每日授于新開放柱頭花粉，直至開花結(jié)束，結(jié)果見圖3和圖4。由圖3可看出，ROC22柱頭羽狀鱗片上沾滿花粉，且花粉均處于萌發(fā)生長狀態(tài)，萌發(fā)長出的花粉管鉆入柱頭內(nèi)部分支結(jié)構(gòu)的細(xì)胞間隙內(nèi)，向內(nèi)生長，水溶性苯胺藍(lán)染色后柱頭上萌發(fā)的花粉管在熒光下顯示出強烈的綠色熒光。甘蔗花柱較長，位于2個羽狀柱頭基部，花粉管在花柱內(nèi)迅速伸長匯總于子房頂部，在該區(qū)域可見多條花粉管。甘蔗為單子房、單胚珠，子房腔較狹窄，珠孔由內(nèi)珠被構(gòu)成，在子房底部為成熟胚囊的珠孔端。部分花粉管穿出子房壁后，便在子房壁與外珠被間向底部生長，最后進(jìn)入珠孔，此時花粉管綠色熒光有所減弱，4 h內(nèi)大部分花粉管均已深入子房底部到達(dá)珠孔附近。溫湯殺雄后柱頭沾染花粉量明顯少于對照組，且處理溫度越高柱頭沾染花粉越少，但花粉管在花柱內(nèi)伸長速度未受影響，如A3、A5、A6、B5、B6、C5、C6和C7等花粉管均已達(dá)子房底部?？?花穗柱頭花粉萌發(fā)情況（圖4）與ROC22相似，但柱頭沾染花粉量明顯增多，4 h內(nèi)花粉管也基本到達(dá)子房底部。柱頭沾染花粉數(shù)量取決于柱頭羽狀鱗片的粘著力，說明花穗經(jīng)溫湯殺雄后可不同程度地影響柱頭粘著力。

落到羽狀柱頭上的花粉數(shù)量非常多，萌發(fā)長出花粉管并進(jìn)入柱頭分支結(jié)構(gòu)組織中的數(shù)量有所減少，匯總于子房頂部長端花柱內(nèi)的數(shù)量明顯減少，而進(jìn)入子房腔后，位于子房壁與外珠被間生長的花粉管更少，僅有幾條，真正進(jìn)入珠孔的通常只有一條。種子結(jié)實是由一個花粉中精細(xì)胞沿花粉管進(jìn)入胚珠中與2個極核和卵細(xì)胞結(jié)合完成受精過程，說明柱頭上過多花粉對種子結(jié)實影響有限。綜上所述，本研究3個處理溫度對甘蔗柱頭可授性影響極小。

2. 5 甘蔗花穗溫湯處理效果結(jié)實性檢測

由表4可知，經(jīng)溫湯處理后，2個甘蔗品種花穗自交出苗數(shù)遠(yuǎn)低于對照組，品種內(nèi)各處理間花穗自交出苗數(shù)和異交出苗數(shù)隨處理溫度升高降低明顯，呈顯著（P<0.05）或極顯著差異。假雜種比例隨著處理溫度的升高呈波浪式變化，以50 ℃處理效果最好，ROC22和科5的花穗假雜種分別為0.09和0.11，自交出苗數(shù)分別為15.67和21.00株/穗，異交出苗數(shù)分別為172.67和187.00株/穗，出苗量可滿足甘蔗花穗雜交選育種對種苗數(shù)量要求。

3 討論

溫湯處理在水稻雜交中應(yīng)用較多，用45 ℃溫水浸泡5 min即可獲得較好效果（耿雷躍等，2015）。甘蔗屬于雌雄同花，穎花極小，僅3～5 mm，人工去雄速度慢、易損傷柱頭且不易去除干凈，而溫湯處理為較適宜的去雄方法。本研究結(jié)果表明，甘蔗花穗經(jīng)溫水浸泡去雄后，花穗較對照會延遲開放，處理溫度越高延遲時間越長;各處理間的柱頭和子房外觀變化不明顯，蓬松狀柱頭均呈深紅色或紫紅色，顏色亮麗，橢圓形子房為淺綠色且富有光澤?；ㄋ虢?jīng)溫湯處理后散粉量明顯降低，各處理間與對照呈極顯著差異，各處理間的散粉量在開花第1 d較多，之后迅速減少，特別是52 ℃處理僅在開花第1 d采集到極少量花粉。通過對采集到的花粉成熟度和活力進(jìn)行鑒定，發(fā)現(xiàn)48和50 ℃處理的花粉成熟度與對照相比差異不顯著，花粉活力雖達(dá)極顯著差異，但仍在60%以上，不影響其正常雜交授粉，52 ℃處理效果顯著，但仍有15%以上活力。說明花穗在溫湯處理前已經(jīng)成熟或即將成熟的花藥通過溫湯處理方式并不能將其完全殺死，去雄前一定要將即將開放的小花穗剪掉。

關(guān)于柱頭可授性的研究已有較多報道（Honsho et al.，2007;Germain，2013），不同作物的可授性檢驗基本采用聯(lián)苯胺—過氧化氫法測定柱頭可授性。本課題組也曾用此方法對甘蔗柱頭進(jìn)行可授性檢驗，活的柱頭含有過氧化氫酶可與過氧化氫反應(yīng)，使聯(lián)苯胺變色，根據(jù)變色程度判斷強弱（常海龍等，2017b）。本研究通過原位萌發(fā)方式，將有活力花粉授于柱頭上，熒光顯微鏡下觀察其花粉萌發(fā)情況，結(jié)果表明，溫湯處理后柱頭粘著性有所降低，羽狀柱頭粘著花粉量明顯低于對照，但不影響花粉在柱頭正常萌發(fā)，花粉管通過花柱仍能到達(dá)子房底部珠孔附近，且與對照無明顯差異。說明本研究中3個處理溫度對甘蔗柱頭可授性影響有限。

溫湯處理效果最終要反映在雜交結(jié)實性上，以低自交結(jié)實高異交結(jié)實為目的。余波等（2014）在研究水稻溫湯處理效果試驗中發(fā)現(xiàn)，43～45 ℃、3～5 min條件下殺雄效果較好，水稻自交結(jié)實率在12%以下，異交結(jié)實率最高達(dá)32%。本研究結(jié)果表明，甘蔗花穗經(jīng)溫湯處理后自交出苗量遠(yuǎn)低于對照，異交出苗量也存在明顯差異。說明甘蔗花穗經(jīng)溫湯處理后雜交結(jié)實性受到極大影響，本研究結(jié)果也證明雌蕊柱頭外部形態(tài)和可授性未受影響，但出苗率顯著降低，具體原因有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

甘蔗花穗經(jīng)溫湯處理后，穎花開放時間略有延遲，雌蕊外觀和柱頭可授性變化不明顯，花穗散粉量隨溫度的升高和時間的延長顯著降低。結(jié)合甘蔗雜交育種對實生苗后代選擇需要，以50 ℃溫水處理3 min的去雄效果較理想，假雜種比例在0.11以下，可減少后代區(qū)分假雜種的人工投入，提高育種效率。

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（責(zé)任編輯 王 暉）