基于信息熵理論比較不同劑量雪上一枝蒿總生物堿對CIA模型大鼠的改善作用及其機制

楊曉梅　陳曉蘭 　張永萍　楊芳芳　謝浪　楊敬鴻　羅成月　查華

中圖分類號 R283.6;R285.5 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）16-2206-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.16.09

摘 要 目的：考察不同劑量雪上一枝蒿總生物堿（簡稱“雪總堿”）對膠原誘發(fā)關節(jié)炎（CIA）模型大鼠血清炎癥因子及關節(jié)滑膜組織中FOS蛋白表達的影響，并探討其抗類風濕關節(jié)炎（RA）的可能機制。方法：將雄性SD大鼠隨機分為空白組、模型組、陽性組（復方醋酸地塞米松軟膏，0.2 g/kg）以及雪總堿低、中、高劑量組（56.26、112.50、225.00 mg/kg，以提取物中雪總堿的質量計），每組10只。除空白組外，其余各組大鼠均于左足皮下注射經不完全費氏佐劑乳化的牛Ⅱ型膠原蛋白以復制CIA模型，并自造模當日起于其左足涂抹相應藥物，空白組和模型組大鼠涂抹等容65%乙醇，每日3次，連續(xù)28 d。于給藥第7、14、21、28天時用游標卡尺測量各組大鼠左后足趾厚度，并計算足腫脹度;于末次給藥后采用酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測各組大鼠血清白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）含量，采用免疫組化法檢測其關節(jié)滑膜組織中FOS蛋白的表達水平[以免疫組化評分（HIS）表示];借助熵權法計算綜合評分，并以此評價不同給藥劑量對CIA模型大鼠上述指標的影響。結果：與空白組比較，模型組大鼠各時間點的足腫脹度、血清炎癥因子含量以及HIS值均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠各時間點足腫脹度，陽性組和雪總堿高劑量組血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及HIS值，雪總堿中劑量組血清L-6、TNF-α含量以及雪總堿低劑量組血清TNF-α含量均顯著降低（P<0.05）。各給藥組上述指標的綜合評分分別為0.37（陽性組）、0.31（雪總堿高劑量組）、0.23（雪總堿中劑量組）、0.09（雪總堿低劑量組）。結論：雪總堿對CIA模型大鼠具有一定的改善作用，且有隨劑量升高而作用增強的趨勢。這種作用可能與降低大鼠血清中炎癥因子的含量以及抑制關節(jié)滑膜組織中FOS蛋白的表達有關。

關鍵詞 雪上一枝蒿;總生物堿;類風濕關節(jié)炎;膠原誘發(fā)關節(jié)炎模型;大鼠;炎癥因子;FOS蛋白;信息熵理論

Comparison of Improvement Effects and Its Mechanism of Different Doses of Total Alkaloids from Aconitum racemulosum on CIA Model Rats Based on Information Entropy Theory

YANG Xiaomei，CHEN Xiaolan，ZHANG Yongping，YANG Fangfang，XIE Lang，YANG Jinghong，LUO Chengyue，ZHA Hua（School of Pharmacy， Guizhou University of Traditional Chinese Medicine， Guiyang 550025， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of different doses of total alkaloids from Aconitum racemulosum （ARTA） on serum inflammation factors and FOS protein expression in synovial tissue of joint in collagen-induced arthritis （CIA） model rats， and to investigate its potential mechanism of anti-rheumatoid arthritis （RA）. METHODS： Male SD rats were randomly divided into blank group， model group， positive group （Compound dexamethasone acetate ointment， 0.2 g/kg）， ARTA low-dose， medium-dose and high-dose groups （56.26， 112.50， 225.00 mg/kg， by the weight of ARTA in the extract）， with 10 rats in each group. Except for blank group， other groups were given subcutaneous injection of Bovine collagen Ⅱ emulsified with incomplete Freund’s adjuvant into the left foot to establish CIA model; the left foot were smeared with relevant medicine from the day of modeling. Blank group and model group were smeared with constant volume of 65% ethanol， 3 times a day， for consecutive 28 days. On the 7th， 14th， 21st and 28th day of administration， the thickness of left hind toe was measured with vernier caliper， and the degree of foot swelling was calculated. The serum contents of IL-1β， IL-6 and TNF-α in rats were measured by ELISA after last administration. The expression of FOS protein in synovial tissue was determined by immunohistochemical method [expressed by HIS]. The comprehensive score was conculated by entropy weight method. Effects of each dosage on above indexes of CIA model rats were evaluated with the comprehensive score. RESULTS： Compared with blank group， the degree of foot swelling， serum content of inflammatory factors and HIS value were increased significantly in model group （P<0.05）. Compared with model group， the degree of foot swelling in each administration group， serum contents of IL-1β， IL-6 and TNF-α， HIS in positive group and ARTA high-dose group， serum contents of IL-6 and TNF-α in ARTA medium-dose group as well as serum content of TNF-α in ARTA low-dose group were decreased significantly（P<0.05）. Comprehensive score of above indicators were 0.37（positive group）， 0.31（ARTA high-dose group）， 0.23（ARTA medium-dose group） and 0.09（ARTA low-dose group）. CONCLUSIONS： ARTA can improve CIA model rats， and the effect tends to increase with the increase of dose. Above effect may be associated with reducing serum content of inflammatory factors and inhibiting the expression of FOS protein in synovial tissue.

KEYWORDS? ?Aconitum racemulosum; Total alkaloids; Rheumatoid arthritis; Collagen-induced arthritis model; Rat; Inflammatory factors; FOS protein; Information entropy theory

雪上一枝蒿為毛茛科植物短柄烏頭（Aconitum brachypodum Diels）、鐵棒錘（A. pendulum Busch）和宣威烏頭（A. subrosullatum H-M.）的干燥塊根，具祛風除濕、通利關節(jié)之功效，是貴州、云南等地的民間用藥，收載于《貴州省中藥材、民族藥材質量標準》[1]。生物堿類成分是該藥材的有效組分，也是其毒性成分，故其治療量與中毒量十分相近[2]。經皮給藥為含有毒性成分藥材的常用給藥方式，具有無肝臟首關效應、生物利用度高、給藥方便等優(yōu)勢。本課題組前期藥理研究表明，雪總堿具有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎作用[3]，但尚未見其對類風濕關節(jié)炎（RA）治療作用的相關報道。為此，本研究以膠原誘發(fā)關節(jié)炎（CIA）模型大鼠為對象，通過檢測其足腫脹度以及血液中相關炎癥因子的含量和關節(jié)滑膜組織中c-fos基因表達產物FOS蛋白的表達水平，從炎癥因子和分子蛋白水平等方面探討雪總堿對CIA模型大鼠的改善作用及可能機制，并借助信息熵理論綜合評價不同劑量雪總堿對上述指標的影響，以期為其外用新劑型的研發(fā)和臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Multlskan Mk3型酶標儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司];BX51T-PHD-J11型顯微鏡（日本Olympus公司）;CMIA98A型圖像分析儀（美國Media Cybermetics公司）;HC-2062型高速離心機（安徽中科中佳科學儀器有限公司）;AUY220型分析天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

雪總堿提取物（本實驗室自制;每100 g藥材共提取雪總堿1.32 g，提取率為1.32%）;復方醋酸地塞米松軟膏（陽性對照，華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，批號：1718004H，規(guī)格：復方）;不完全弗氏佐劑、牛Ⅱ型膠原蛋白（北京博蕾德生物科技有限公司，批號分別為150514、150374）;鼠源C-FOS抗體（圣克魯斯生物技術有限公司，批號：00058736）;大鼠白細胞介素1β（IL-1β）、IL-6、腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（批號：1218E18）和蘇木精染色劑均購自南京賽博生物科技有限公司;DAB顯色劑（北京索萊寶科技有限公司）;其余試劑均為分析純，水為蒸餾水。

1.3 動物

SPF級SD大鼠60只，雄性，體質量（200±20）g，購自長沙市天勤生物技術有限公司，動物生產許可證號：SCXK（湘）2014-0011。所有大鼠均分籠飼養(yǎng)，自由攝食、飲水。

2 方法

2.1 大鼠造模

將牛Ⅱ型膠原蛋白溶于醋酸溶液中，4 ℃攪拌過夜，待其充分溶解后，加入等體積的不完全弗氏佐劑，充分混勻、乳化，制成質量濃度為2.5 mg/mL的牛Ⅱ型膠原蛋白乳劑。于大鼠左足皮下注射上述乳劑0.1 mL進行免疫，14 d后避開上次免疫部位再以相同劑量注射1次以加強免疫。

2.2 大鼠分組與給藥

所有大鼠均適應性飼養(yǎng)1周后，隨機分為空白組、模型組、陽性組（復方醋酸地塞米松軟膏，0.2 g/kg）和雪總堿低、中、高劑量組（56.26、112.50、225.00 mg/kg，以提取物中雪總堿的質量計），每組10只。各給藥組給藥劑量經查閱相關文獻[4]并參照本課題組前期急性毒性試驗[5]確定。除空白組外，其余各組大鼠均按“2.1”項下方法復制CIA大鼠模型。自造模當日（即第1次注射后，下同）起，各給藥組大鼠均于左足涂抹相應藥物（陽性組藥物為直接涂抹，雪總堿各劑量組藥物以65%乙醇稀釋后涂抹），空白組和模型組大鼠均于左足涂抹等容65%乙醇，每日3次，連續(xù)28 d。

2.3 大鼠足腫脹度檢測

分別于造模前和給藥第7、14、21、28天時用游標卡尺測量各組大鼠左后足趾厚度并計算足腫脹度，足腫脹度=（給藥后足趾厚度-造模前足趾厚度）/給藥后足趾厚度。

2.4 大鼠血清炎癥因子含量檢測

末次給藥1 h后，于大鼠腹主動脈取血適量，以5 000 r/min離心10 min，分離血清。使用ELISA法以酶標儀檢測各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的含量。嚴格按照相應試劑盒說明書操作。

2.5 大鼠滑膜組織中FOS蛋白表達水平檢測

取血后，將大鼠固定，用75%乙醇擦拭膝關節(jié)后，沿膝關節(jié)正中切開皮膚，暴露并打開關節(jié)腔，用眼科鑷將滑膜組織輕輕夾住，用刀片將其完整切下，置于4%多聚甲醛溶液中固定72 h后，包埋、切片（3～5 μm）、脫蠟。切片滴加鼠源C-FOS抗體適量，經DAB顯色、蘇木精復染后，封片，于顯微鏡下觀察。在滑膜組織切片中分別選取左上、左下、右上、右下、中央等5個視野，采用圖像分析儀進行FOS陽性顆粒計數(shù)（陽性顆粒呈淺棕色或深棕色），并以免疫組化評分（HIS）表示FOS蛋白的表達水平（HIS=陽性顆粒評分×陽性細胞染色程度，式中，陽性顆粒評分標準——0分為陰性，1分為弱陽性，2分為陽性，3分為強陽性;染色程度量化標準（以染色面積百分比計）——0分為染色面積百分比0～1%，1分為>1%～10%，2分為>10%～50%，3分為>50%～80%，4分為>80%～100%[6]）。

2.6 統(tǒng)計學方法

2.6.1 方差分析 采用SPSS 19.00軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料均以x±s表示，多組間比較采用單因素方法分析，兩組間比較采用LSD分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2.6.2 熵權法分析 采用Excel 2003對數(shù)據(jù)進行熵權法分析。將各試驗組數(shù)據(jù)的均值（V）進行標準化處理后，進一步計算各考察指標的信息熵（H），并賦予相應權重（W），最終計算綜合評分（M），根據(jù)M值評價不同劑量雪總堿對各指標的影響（M值越大，表示其對相應指標的影響越大）[7]。

3 結果

3.1 各組大鼠足腫脹度檢測結果

與空白組比較，模型組大鼠各時間點的足腫脹度均顯著增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，各給藥組大鼠各時間點的足腫脹度均顯著減小，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。其中，模型組和各給藥組大鼠足腫脹度均于給藥第14天達到峰值，并于給藥第21天開始下降，詳見表1。

3.2 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量檢測結果

與空白組比較，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，陽性組和雪總堿高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量，雪總堿中劑量組大鼠血清IL-6、TNF-α含量以及雪總堿低劑量組大鼠血清TNF-α含量均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），詳見表2。

3.3 各組大鼠關節(jié)滑膜組織中FOS蛋白表達水平檢測結果

與空白組比較，模型組大鼠HIS值顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;與模型組比較，陽性組、雪總堿高劑量組大鼠HIS值均顯著降低，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），詳見表2。

3.4 基于熵權法的雪總堿抗RA效應評價

取模型組和各給藥組實驗數(shù)據(jù)的V值進行標準化處理，空白組不作分析。其中，當指標較模型組升高時，按V標準化值=V給藥組-V模型組計算;當指標較模型組降低時，按V標準化值=V模型組-V給藥組計算[8-10]，足腫脹度以給藥第28天的數(shù)據(jù)進行分析，結果見表3。

根據(jù)上述概率矩陣計算第i個指標的熵值（Hi），得Hi=[0.92 0.93 0.98 0.99 0.86]。參考文獻方法[8-9]計算Wi，得Wi=[0.256 0.214 0.069 0.021 0.441]。按公式計算m組n個指標的Mm=P1mW1+P2mW2+……+PnmWn計算，得各組的M值分別為0.37（陽性組）、0.31（雪總堿高劑量組）、0.23（雪總堿中劑量組）、0.09（雪總堿低劑量組）。

4 討論

雪上一枝蒿是云南、貴州等地民間用于治療風濕疼痛、關節(jié)炎、跌打損傷的要藥之一[11]?，F(xiàn)有研究表明，雪總堿有顯著的鎮(zhèn)痛、抗炎作用[3]，但其對RA的治療作用尚未見相關報道。CIA誘導關節(jié)炎動物模型的病理特征為關節(jié)滑膜慢性炎癥增生、關節(jié)軟骨及骨侵蝕破壞，與RA發(fā)病過程類似[12]。為此，本研究考察了雪總堿對CIA模型大鼠的改善作用及可能機制。復方醋酸地塞米松軟膏是臨床治療RA的常用外用制劑，療效顯著[13]，故本研究以其作為陽性對照藥物。

本研究在考察大鼠足腫脹度基礎上，對其血清炎癥因子的含量和關節(jié)滑膜組織中FOS蛋白的表達情況進行了檢測。其中，IL-1β、IL-6、TNF-α作為免疫調節(jié)介質，在RA的發(fā)展過程中具有重要作用。研究表明，IL-1β可在RA早期誘導中性粒細胞、單核細胞和淋巴細胞趨化，同時誘導IL-6的產生[14];IL-6可使滑膜炎癥加劇，并誘導B淋巴細胞轉化為漿細胞，其在RA患者血清中的含量顯著高于健康者[15]。TNF-α的含量與RA患者血清中類風濕因子滴度、紅細胞沉降率和C反應蛋白等指標呈正相關，是反映病情嚴重程度的重要指標之一[16-17]。此外，RA的病理表現(xiàn)以滑膜組織異常增生為主，是一種自身免疫功能下降的慢性疼痛性疾病，疼痛可誘發(fā)c-fos基因在中樞神經內的異常表達，使得FOS蛋白的表達明顯上升[13，18]。本研究結果顯示，模型組大鼠足腫脹度（給藥第7、14、21、28天）、血清炎癥因子含量、HIS值均較空白組顯著升高，提示大鼠血清炎癥因子及關節(jié)滑膜組織中FOS蛋白的表達均明顯升高，表明模型復制成功。與模型組比較，各給藥組大鼠各時間點足腫脹度，陽性組和雪總堿高劑量組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α含量以及HIS值，雪總堿中劑量組大鼠血清IL-6、TNF-α含量以及雪總堿低劑量組大鼠血清TNF-α含量均顯著降低，提示雪總堿可明顯緩解大鼠的足腫脹情況，其機制可能與降低其血清炎癥因子的含量以及抑制關節(jié)滑膜組織中FOS蛋白的表達有關。

信息熵是系統(tǒng)不確定和無序性的度量，信息熵理論可將每個因素作為一個隨機變量，計算其對應的H值，并賦予相應權重，以評價各受試因素的綜合影響[19]。熵權法以信息熵理論為依據(jù)，客觀地對各因素進行賦權，并進行綜合評分，可為多指標研究數(shù)據(jù)分析提供依據(jù)[20]。本研究嘗試借助信息熵理論建立綜合評價度量指標，探討不同劑量雪總堿對大鼠足腫脹度、血清中炎癥因子及關節(jié)滑膜組織中FOS蛋白表達水平的影響。結果顯示，高劑量雪總堿對CIA模型大鼠各考察指標的綜合影響最大、中劑量次之、低劑量最弱，提示雪總堿改善RA的作用有隨劑量升高而增強的趨勢，但整體均弱于陽性對照藥物。

綜上所述，雪總堿對RA具有一定的改善作用，其作用機制可能與降低血清中炎癥因子的含量以及抑制關節(jié)滑膜組織中FOS蛋白的表達有關。但本研究并未對與抑制RA炎癥反應的相關信號通路進行研究，有待后續(xù)實驗予以完善。

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（收稿日期：2019-01-06 修回日期：2019-06-10）

（編輯：張元媛）