芪蛭通絡膠囊及其9味活血化瘀藥拆方對腦缺血再灌注損傷模型大鼠的保護作用

武曉偉 劉聰 李佳 李祥 倪艷

摘 要 目的：研究芪蛭通絡膠囊及其9味活血化瘀藥拆方對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，為通過拆方的方法研究芪蛭通絡膠囊活性成分奠定基礎。方法：將60只SD大鼠隨機分為假手術組（0.5%羧甲基纖維素鈉）、模型組（0.5%羧甲基纖維素鈉）、芪蛭通絡膠囊缺活血化瘀藥味組[0.389 g/（kg·d）]、芪蛭通絡膠囊活血化瘀藥味組[0.253 g/（kg·d）]和芪蛭通絡膠囊成品組[0.500 g/（kg·d）]，每組12只;各組大鼠均灌胃給藥，每天1次，連續(xù)14 d;末次給藥2 h后，除假手術組外，其余各組大鼠均采用線栓法復制腦缺血再灌注損傷模型。缺血2 h再灌注24 h后，依據(jù)Bederson評分法對各組大鼠進行神經(jīng)功能評分，氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法計算其腦梗死面積，生化法測定大鼠腦組織中一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）、乳酸脫氫酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）的含量，酶聯(lián)免疫吸附法檢測大鼠腦組織中白細胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的含量。結(jié)果：與假手術組比較，模型組大鼠的神經(jīng)功能評分顯著升高（P<0.05），腦梗死面積和腦組織中NO、MDA、LDH、IL-1β、TNF-α含量均顯著增加（P<0.05），腦組織中SOD含量顯著減少（P<0.05）。與模型組比較，各給藥組大鼠神經(jīng)功能評分均顯著降低（P<0.05），腦梗死面積和腦組織中NO、MDA、LDH、IL-1β、TNF-α含量均顯著減少（P<0.05），腦組織中SOD含量顯著增加（P<0.05）。與芪蛭通絡膠囊成品組比較，芪蛭通絡膠囊活血化瘀藥味組和芪蛭通絡膠囊缺活血化瘀藥味組大鼠腦梗死面積和腦組織中NO、MDA、LDH、IL-1β、TNF-α含量均顯著增加（P<0.05），SOD含量均顯著減少（P<0.05）。結(jié)論：芪蛭通絡膠囊的全方及其9味活血化瘀藥（或不含9味活血化瘀藥）的拆方對大鼠腦缺血再灌注損傷均具有一定的保護作用，活血化瘀藥味拆方的保護作用雖不及全方，但全方缺活血化瘀藥味后其保護作用也明顯下降，表明活血化瘀藥在全方發(fā)揮保護腦缺血再灌注損傷功能中具有重要作用，將活血化瘀藥物拆分出來研究對闡明芪蛭通絡膠囊全方的作用具有一定的意義。

關鍵詞 芪蛭通絡膠囊;拆方;活血化瘀;腦缺血再灌注損傷;大鼠

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the protective effects of Qizhi tongluo capsules and their 9 ingredients decomposed recipes for promoting blood circulation and removing blood stasis （PBCRBS） on cerebral ischemia-reperfusion injury model rats， and to lay a foundation for studying the active components of Qizhi tongluo capsules through decomposed recipes. METHODS： Totally 60 SD rats were randomly divided into sham operation group （0.5% CMC-Na）， model group （0.5% CMC-Na）， Qizhi tongluo capsules without the ingredients for PBCRBS group [0.389 g/（kg·d）]， the ingredients of Qizhi tongluo capsules for PBCRBS group [0.253? g/（kg·d）] and Qizhi tongluo capsules group [0.500 g/（kg·d）]， with 12 rats in each group. The rats were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 14 d. 2 h after last medication， except for sham operation group， cerebral ischemia- reperfusion injury model was induced by suture method in each group. The neurological function score was measured according to Bederson score 2 h after ischemia and 24 h after reperfusion. The area of cerebral infarction was calculated by TTC staining. The contents of NO， MDA， LDH and SOD in cerebral tissue of rats were measured by biochemical method. The contents of IL-1β and TNF-α in cerebral tissue of rats were detected by ELISA. RESULTS： Compared with sham operation group， the neurological function score， the infarct area and the contents of NO， MDA， LDH， IL-1β and TNF-α in cerebral tissue were significantly increased in model group （P<0.05）. The content of SOD in cerebral tissue were decreased significantly （P<0.05）. Compared with model group， the neurological function score of rats was decreased significantly in each administration group （P<0.05）; the area of cerebral infarction， the contents of NO， MDA， LDH， IL-1β and TNF-α in cerebral tissue were decreased significantly （P<0.05）， while the content of SOD in cerebral tissue was increased significantly （P<0.05）. Compared with Qizhi tongluo capsules group， the area of cerebral infarction， the contents of NO， MDA， LDH， IL-1β and TNF-α in cerebral tissue were increased in the ingredients of Qizhi tongluo capsules for PBCRBS group and Qizhi tongluo capsules without the ingredients for PBCRBS group （P<0.05）， the content of SOD was decreased significantly （P<0.05）. CONCLUSIONS： The formulation of Qizhi tongluo capsules and their 9 ingredients decomposed recipes for PBCRBS （without 9 ingredients for PBCRBS） have protective effects on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats. Although the protective effects of decomposed recipes for PBCRBS is not as good as that of the whole prescription， the protective effects of whole formulation were decreased significantly. It shows that the drugs for PBCRBS play an important role in protecting the function of cerebral ischemia reperfusion injury. It is of certain significance to separate the ingredients for PBCRBS to clarify the effect of Qizhi tongluo capsules.

KEYWORDS Qizhi tongluo capsules; Decomposed recipes; Promoting blood circulation and removing blood stasis; Cerebral ischemia reperfusion; Rat

芪蛭通絡膠囊全方由黃芪、水蛭、人參等26味藥組成，兼顧氣、血、風、痰、虛、瘀等多個病理因素，配伍攻補兼施，寒溫并用，集氣血津液同治于一方，諸藥合用，共奏補氣活血、化痰通絡之功，適用于中風恢復期后遺癥的治療[1]。該藥在臨床上有近20年的應用史，已開展了多項臨床研究，證明了其對高血脂、心肌梗死、腦中風等多種心腦血管疾病均具有良好的輔助治療作用，且在同類產(chǎn)品中具有明顯的優(yōu)勢[2-4]，但缺乏藥效物質(zhì)基礎的研究。而藥效物質(zhì)基礎是實現(xiàn)中藥現(xiàn)代化、國際化的關鍵，通過藥效物質(zhì)基礎研究能夠在一定程度上科學解釋芪蛭通絡膠囊的功效，促進其進一步的開發(fā)利用。

拆方研究是目前中藥復方研究的常用方法，通過拆方能夠簡化復方研究的難度，可為發(fā)現(xiàn)復方的活性部位和活性成分奠定基礎[5]。腦中風病因雖多而復雜，但血瘀為其發(fā)展的決定主因，貫穿于疾病的各個階段，活血化瘀乃中風的基本治法[6-7]。腦中風又有缺血性腦中風和出血性腦中風兩種形式，其中以缺血性腦中風最為常見。在缺血性腦中風再灌注的治療過程中，會生成大量的氧自由基，誘發(fā)腦細胞的凋亡和壞死，加重腦損傷[8]。因此，能否對治療過程中氧自由基損傷起到保護作用，是中風藥是否具有良好療效的關鍵因素。本研究依據(jù)各味藥功效，將芪蛭通絡膠囊中9味活血化瘀藥單獨拆分出來，通過觀察芪蛭通絡膠囊全方、芪蛭通絡膠囊活血化瘀藥組方、芪蛭通絡膠囊全方缺活血化瘀藥組方對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，為9味活血化瘀藥拆方提供理論依據(jù)，并為后續(xù)通過拆方研究芪蛭通絡膠囊藥效物質(zhì)奠定基礎。

1 材料

1.1 儀器

Synergy H1全功能微孔板檢測儀（美國Bio-Tek公司）;KDC-2046低速冷凍離心機（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）;754紫外-可見分光光度計（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）;RE5298A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）;DZF-6050真空干燥箱（南京沃環(huán)科技實業(yè)有限公司）;FW-100高速萬能粉碎機（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）;SE402F電子分析天平[奧豪斯儀器（上海）有限公司];HH-1電熱恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

水蛭、川芎、土鱉蟲、丹參、郁金、紅花、雞血藤、姜黃、澤蘭、黃芪、人參、麥冬、五味子、何首烏、當歸、赤芍、毛冬青、全蝎、天麻、膽南星、豬牙皂、冰片、羌活、肉桂、地龍、僵蠶共26味藥均購自山西省中醫(yī)院藥房，經(jīng)山西省中醫(yī)藥研究院倪艷教授鑒定均符合2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定;芪蛭通絡膠囊（山西振東制藥股份有限公司，批號：20171101，規(guī)格：0.5 g）;考馬斯亮藍試劑盒（批號：20181119）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒（批號：20181119）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（批號：20181119）、一氧化氮（NO）檢測試劑盒（批號：20181119）均購自南京建成生物工程研究所;白細胞介素1β（IL-1β）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（批號：201809）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA檢測試劑盒（批號：201809）、乳酸脫氫酶（LDH）ELISA檢測試劑盒（批號：201809）均購自黃石市艾恩斯生物科技有限公司;羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，天津市光復精細化工研究所）;2%氯化三苯基四氮唑（TTC）染液（北京索萊寶科技有限公司，批號：20180710）。

1.3 動物

清潔級健康成年SD大鼠60只，♂，體質(zhì)量250～280 g，8～10周齡，購自斯貝福（北京）生物技術有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2016-0002，動物批號：11401500037956。清潔級動物飼養(yǎng)環(huán)境由山西省中醫(yī)藥研究院提供，飼養(yǎng)溫度維持在（25±2） ℃，噪音≤60 dB，相對濕度維持在（50±10）%，晝夜溫差≤2 ℃，晝夜交替時間為12 h/12 h。實驗動物用水為純化水，每天更換1次;墊料為混合型木屑，每周更換2次;飼養(yǎng)籠經(jīng)清洗滅菌后，每周更換1次。本實驗所有研究均符合中國倫理委員會有關動物研究指導原則。

2 方法

2.1 藥液的制備

（1）芪蛭通絡膠囊活血化瘀組：包括水蛭、川芎、土鱉蟲、丹參、郁金、紅花、雞血藤、姜黃、澤蘭9味藥，依據(jù)芪蛭通絡膠囊制備工藝制備后，用0.5%CMC-Na溶液制備成質(zhì)量濃度為25.3 g/L的溶液。（2）芪蛭通絡膠囊缺活血化瘀藥味組：包括黃芪、人參、麥冬、五味子、何首烏、當歸、赤芍、毛冬青、全蝎、天麻、膽南星、豬牙皂、冰片、羌活、肉桂、地龍、僵蠶17味藥，依據(jù)芪蛭通絡膠囊制備工藝制備后，用0.5%CMC-Na溶液制備成質(zhì)量濃度為38.9 g/L的溶液。（3）芪蛭通絡膠囊成品組：取成品芪蛭通絡膠囊，用0.5%CMC-Na溶液制備成質(zhì)量濃度為50 g/L的溶液。

2.2 分組與給藥

將60只SD大鼠適應性飼養(yǎng)1周后隨機分為5組，即假手術組[灌胃等量0.5%CMC-Na溶液]、模型組（0.5%CMC-Na溶液）、芪蛭通絡膠囊活血化瘀藥味組[0.253? ?g/（kg·d）]、芪蛭通絡膠囊缺活血化瘀藥味組[0.389? ? ? ? g/（kg·d）]和、芪蛭通絡膠囊成品組[0.500 g/（kg·d）]，每組12只，其中6只用于腦梗死率的測定，6只用于實驗室指標的檢測。藥物組大鼠灌胃劑量均根據(jù)該方的組成換算的等效劑量，每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥14 d。末次給藥2 h后，復制腦缺血再灌注損傷大鼠模型。

2.3 造模

參照文獻方法[9-10]復制腦缺血再灌注損傷大鼠模型。術前禁食不禁水12 h，適量戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉后，將大鼠固定于鼠板上，剃除頸部毛，酒精消毒頸部皮膚，頸部正中作約2.5 cm的切口，使大鼠左側(cè)頸動脈三角暴露，然后采用鈍性分離法逐層分離組織，找出左側(cè)頸總動脈（CCA）、頸外動脈（ECA）和頸內(nèi)動脈（ICA）。在CCA下插入兩根長度約10 cm的縫合線，在ECA和ICA下分別插入一根長度約10 cm的縫合線備用。分別結(jié)扎CCA和ECA下一根縫合線（注意不要結(jié)扎到白色的迷走神經(jīng)），用動脈夾封閉ICA，在CCA近心端用眼科剪剪開一小口（注意不要剪斷CCA）。用手拉扯CCA下未結(jié)扎的縫合線，通過導線針將魚線從缺口內(nèi)插入（體質(zhì)量為260～280 g的大鼠選用直徑為0.254 mm的魚線，體質(zhì)量為280～300 g的大鼠選用直徑為0.286 mm的魚線，將魚線剪成6 cm的長度，分別在2、3、4、5 cm處用黑色標記筆作一標記，插入前浸泡在生理鹽水中，于95 ℃烘箱中烘干，使魚線具有一定的硬度，并在魚線前端沾適量石蠟，避免魚線前端上的毛刺劃傷大鼠大腦），放開ICA上的動脈夾，輕推魚線，使之由CCA通過分叉部進入ICA，直至大腦中動脈的起點，阻斷大腦中動脈的血液供應，插入深度由分叉處計算約20 mm（魚線上2 cm標記大致位于分叉處），結(jié)扎ICA下的魚線，固定魚線的位置。手術完成后，逐層縫合頸部切口，用碘酒消毒。注意在手術過程中和手術結(jié)束后都要維持大鼠的體溫在37 ℃左右。缺血2 h后拔除魚線，再灌注24 h。假手術組大鼠手術過程與模型組相同，但不插入魚線。

2.4 檢測指標

2.4.1 神經(jīng)功能評分 待大鼠清醒后，參照Bederson評分方法[11]對各組大鼠的神經(jīng)功能進行評分。評分標準如下：無神經(jīng)損傷癥狀，0分;懸尾試驗中不能完全伸展對側(cè)前爪，1分;前肢抵抗對側(cè)推力能力下降，2分;自由行走時向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈，3分。得分越高表明神經(jīng)功能受損程度越高。

2.4.2 腦梗死率測定 手術結(jié)束后大鼠斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，將取出的鼠腦用4 ℃生理鹽水沖洗后放在腦模上，連同腦模一起放入-20 ℃冰箱中冷凍。20 min后取出鼠腦及腦模，用刀片連續(xù)冠狀切片（約2 mm），將腦切片置于2%TTC染液中，于37 ℃烘箱中避光溫育15 min，染色后，正常組織呈現(xiàn)紅色，梗死組織呈現(xiàn)白色。將腦片放在深藍色的背景上，數(shù)碼相機拍照，照片用Image Pro Plus 6.0軟件處理分析，計算大鼠腦梗死率：腦梗死率（%）=Σ梗死面積/Σ全腦片面積×100%。

2.4.3 腦組織中NO、LDH、MDA、SOD和炎癥因子IL-? 1β、TNF-α含量的測定 大鼠缺血2 h再灌注24 h后，適量烏拉坦麻醉，斷頭取腦，稱定全腦的質(zhì)量，用4 ℃生理鹽水沖洗后，將全腦放入勻漿管中，加入全腦質(zhì)量9倍體積的4 ℃生理鹽水進行勻漿，制成10%的組織勻漿。將組織勻漿在4 ℃下以3 000 r/min離心20 min，取上清液，備用。按照相應試劑盒說明操作，分別對腦組織勻漿中NO、LDH、MDA、SOD、IL-1β和TNF-α的含量進行測定。

2.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。計量資料以x±s表示，先進行方差齊性檢驗，若方差齊性，組間比較采用LSD-t檢驗;若方差不齊性，則組間比較采用秩和檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠神經(jīng)功能評分結(jié)果

與假手術組比較，模型組大鼠的神經(jīng)功能評分顯著升高（P<0.05），表明模型復制是成功的（評分在2分以上即可說明模型復制成功）。與模型組比較，芪蛭通絡膠囊成品組、芪蛭通絡膠囊活血化瘀藥味組以及芪蛭通絡膠囊缺活血化瘀藥味組大鼠的神經(jīng)功能評分均顯著降低（P<0.05），但三組間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），說明各組對腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能均具有改善作用。各組大鼠神經(jīng)功能評分結(jié)果見表1。

3.2 大鼠腦梗死率測定結(jié)果

與假手術組比較，模型組大鼠腦梗死率顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，芪蛭通絡膠囊成品組、芪蛭通絡膠囊活血化瘀藥味組和芪蛭通絡膠囊缺活血化瘀藥味組大鼠的腦梗死率均顯著降低（P<0.05），說明各組對腦缺血再灌注大鼠腦梗死均具有改善作用。其中，芪蛭通絡膠囊活血化瘀藥味組大鼠腦梗死率降低程度雖不及芪蛭通絡膠囊成品組（P<0.05），但芪蛭通絡膠囊全方缺活血化瘀藥味后的保護作用顯著減弱（腦梗死率顯著升高）（P<0.05），減弱到與單獨使用活血化瘀藥味的效果相近，這表明活血化瘀藥對芪蛭通絡膠囊全方發(fā)揮降低腦梗死率功效具有重要作用。各組大鼠TTC染色結(jié)果見圖1，腦梗死率測定結(jié)果見表2。

3.3 大鼠腦組織中NO、LDH、MDA及SOD含量測定結(jié)果

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中NO、LDH、MDA含量顯著增加（P<0.05），SOD含量顯著減少（P<0.05）。與模型組比較，芪蛭通絡膠囊成品組、芪蛭通絡膠囊活血化瘀藥味組和芪蛭通絡膠囊缺活血化瘀藥味組大鼠腦組織中NO、LDH、MDA含量均顯著減少（P<0.05），SOD含量均顯著增加（P<0.05）。其中，芪蛭通絡膠囊活血化瘀藥味組大鼠腦組織中上述指標的增加/減少程度雖不及芪蛭通絡膠囊成品組（P<0.05），但芪蛭通絡膠囊全方缺活血化瘀藥味后對腦組織中上述指標的增加/減少作用明顯減弱（P<0.05），其效果減弱至與單獨使用活血化瘀藥味相近，表明了活血化瘀藥對芪蛭通絡膠囊全方發(fā)揮抗腦組織氧化功效具有重要作用。各組大鼠腦組織中NO、LDH、MDA和SOD含量測定結(jié)果見表3。

3.4 大鼠腦組織中炎癥因子IL-1β和TNF-α含量測定結(jié)果

與假手術組比較，模型組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α含量顯著增加（P<0.05）。與模型組比較，芪蛭通絡膠囊成品組、芪蛭通絡膠囊活血化瘀藥味組、芪蛭通絡膠囊缺活血化瘀藥味組大鼠腦組織中IL-1β、TNF-α含量均顯著減少（P<0.05），其中芪蛭通絡膠囊活血化瘀藥味組大鼠腦組織中IL-1β和TNF-α含量的減少程度雖不及芪蛭通絡膠囊成品組（P<0.05），但芪蛭通絡膠囊全方缺活血化瘀藥味后其減少腦組織中IL-1β、TNF-α含量的作用明顯減弱（P<0.05），減弱至與單獨使用活血化瘀藥味相近，這表明活血化瘀藥對全方發(fā)揮抗腦組織炎性反應功效中具有重要作用。各組大鼠腦組織中炎癥因子IL-1β、TNF-α含量測定結(jié)果見表4。

4 討論

芪蛭通絡膠囊是由26味藥組成的大復方，想要一次闡明其藥效物質(zhì)基礎是很難實現(xiàn)的。拆方研究是目前研究中藥復方時較為常用的一種方法，通過拆方的手段，能夠在一定程度上減輕復方研究的難度。本實驗研究的是芪蛭通絡膠囊拆分后的活血化瘀藥味組。通過評價芪蛭通絡膠囊活血化瘀藥味組對大鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用，能夠在一定程度上為芪蛭通絡膠囊的拆分分組提供理論依據(jù)，從而為在芪蛭通絡膠囊復雜的大組方中找尋藥物活性部位和活性成分奠定基礎。

腦缺血再灌注后的一段時間內(nèi)，氧自由基大量生成[12-13]，而自由基清除功能下降，過量的自由基能夠破壞細胞膜的結(jié)構和功能，從而加重腦損傷。MDA是自由基脂質(zhì)過氧化反應的中間產(chǎn)物，SOD是機體是最重要的自由基清除劑之一，當腦組織中自由基含量上升時，腦組織中MDA的含量會增加，而SOD會被大量消耗，導致腦組織中SOD含量的減少。此外，有研究發(fā)現(xiàn)[14]，腦缺血再灌注損傷能夠?qū)е律锬X組織內(nèi)NO含量增加，而過量的NO會損害線粒體功能，影響細胞能量供應，加重腦損傷。因此，通過測定腦組織中MDA、SOD以及NO含量能夠間接反映腦組織受自由基損害的程度。LDH在腦細胞中廣泛存在，其與機體的自動代償性保護機制有關，當腦缺血再灌注損傷發(fā)生時，受傷的腦組織會釋放出LDH，導致腦組織中LDH含量的增加[15]。腦缺血再灌注損傷發(fā)生的另一重要原因是腦組織局部過度的炎癥反應[16]，而IL（主要是IL-1β）和TNF-α是體內(nèi)最為重要的炎癥因子，其表達水平的高低是腦缺血再灌注損傷的一個重要指標。

綜上所述，本研究在文獻基礎上成功復制了大鼠腦缺血再灌注損傷模型，通過比較芪蛭通絡膠囊全方、芪蛭通絡膠囊全方中活血化瘀藥組、芪蛭通絡膠囊全方缺活血化瘀藥組對模型大鼠腦缺血梗死率、神經(jīng)功能評分以及腦組織中MDA、SOD、NO、LDH、IL-1β、TNF-α含量的影響，成功證明了活血化瘀藥在全方發(fā)揮保護腦缺血再灌注損傷功能中具有重要作用。將其拆分出來研究，能夠在一定程度上降低全方研究的困難，為闡明全方的作用機制及藥效物質(zhì)奠定基礎，也為中藥在腦血管疾病方面的應用提供了實驗依據(jù)。

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（收稿日期：2019-04-08 修回日期：2019-06-17）

（編輯：林 靜）