超高效液相色譜法測(cè)定蘋(píng)果汁飲料中的展青霉素及其不確定度分析

房志杰 王玨

摘要 ?為了在測(cè)量數(shù)據(jù)的處理、測(cè)定結(jié)果的表達(dá)和測(cè)量結(jié)果質(zhì)量評(píng)定等方面與國(guó)際接軌，根據(jù)測(cè)量不確定度評(píng)定和表示（GB/T 27418-2017），食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中展青霉素的測(cè)定（GB 5009.185-2016）中第二法高效液相色譜法測(cè)定展青霉素含量的不確定度的測(cè)定和評(píng)定，分析了使用外標(biāo)法單點(diǎn)定標(biāo)測(cè)定樣品的不確定度計(jì)算方法和步驟，建立了高效液相色譜法測(cè)定方法的評(píng)定方式。通過(guò)對(duì)測(cè)量結(jié)果的不確定度評(píng)定，了解了測(cè)定過(guò)程中不確定度的主要來(lái)源，從而對(duì)在檢測(cè)過(guò)程中易產(chǎn)生不確定度的環(huán)節(jié)加以重視，確保檢驗(yàn)結(jié)果的可靠性。

關(guān)鍵詞 超高效液相色譜;展青霉素;蘋(píng)果汁飲料;不確定度

中圖分類(lèi)號(hào)：O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：2095-3305（2019）02-008-03

DOI： 10.19383/j.cnki.nyzhyj.2019.02.004

Abstract In order to be in line with international standards in the processing of measurement data， the expression of measurement results and the quality evaluation of measurement results， the uncertainty of determination of paeonillin in food safety national standard GB 5009.185-2016 by second?method high performance liquid chromatography was determined and evaluated according to the evaluation and expression of measurement uncertainty （GB/T 27418-2017）. The uncertainty of determination of paeonillin in food safety national standard GB 5009.185-2016 was analyzed. The methods and steps of calculating the uncertainty of single?point calibration of samples by external standard method were used to establish the evaluation method of high performance liquid chromatography method. By evaluating the uncertainty of measurement results， the main sources of uncertainty in the determination process were understood， and the links that easily produce uncertainty in the detection process were paid attention to， so as to ensure the reliability of the test results.

Key words ? Ultra High Performance Liquid Chromatography;Penicillin;Apple Juice Beverage; Uncertainty

測(cè)量不確定度在檢測(cè)、校準(zhǔn)和合格評(píng)定中具有重要作用。中國(guó)實(shí)驗(yàn)室國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)（CNAL）要求經(jīng)CNAL認(rèn)可的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室必須建立測(cè)定不確定度的評(píng)定程序，并有能力對(duì)每項(xiàng)數(shù)值要求的測(cè)量結(jié)果進(jìn)行不確定評(píng)定 。食品檢驗(yàn)工作是從最基本的稱(chēng)量到通過(guò)各種復(fù)雜理化方法，最終確定某種成分含量的測(cè)量過(guò)程。測(cè)量結(jié)果會(huì)受到諸多因素的影響和限制，如儀器精度、人員技術(shù)熟練水平、操作條件等。為了客觀評(píng)價(jià)測(cè)量結(jié)果的可靠性，引入了“測(cè)量不確定度”這一概念。

1 材料與方法

1.1 材料

供試樣品為市場(chǎng)隨機(jī)抽查的蘋(píng)果汁飲料。

展青霉素標(biāo)準(zhǔn)品純度≥99.5%，1 mg;乙腈、冰乙酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters UPLC 高效液相色譜儀（二極管陣列檢測(cè)器）;MycoSep228凈化柱，氮?dú)獯蹈?測(cè)定的環(huán)境條件：溫度（20±5）℃，相對(duì)濕度≤75%。

1.3 樣品處理

參照GB 5009.185-2016 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中展青霉素的測(cè)定中第二法高效液相色譜法進(jìn)行。

1.4 色譜條件

色譜柱：C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）;流動(dòng)相：乙腈+水（10∶90，體積比）;檢測(cè)波長(zhǎng)：276 nm;流速：0.8 ml/min;柱溫：35℃，進(jìn)樣量：10 μl。

2 結(jié)果與分析

2.1 數(shù)學(xué)模型

X=

式中，X為試樣中展青霉素的殘留量（ng/g）;A為樣液中展青霉素的色譜峰面積;cs為標(biāo)準(zhǔn)工作液中展青霉素的濃度（ng/ml）;V為樣液最終定容體積（ml）;AS為標(biāo)準(zhǔn)工作液中展青霉素的色譜峰面積;m為最終樣液所代表的試樣量（g）。

2.2 不確定度的來(lái)源分析

從測(cè)定過(guò)程和確定的數(shù)學(xué)模型分析，展青霉素含量測(cè)定的不確定度主要來(lái)源于：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)U（S）、標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)進(jìn)樣Urel（AS）、樣品峰面積的測(cè)定Urell（A）、樣品稱(chēng)量Urel（m）、定容體積Urel（V）、樣品處理操作過(guò)程Urel（P）的差異等幾個(gè)方面。

2.3 不確定度計(jì)算公式

Urel（X）=[U（cs）/cs]2+[U（A）/A]2+[U（V）/V]2+[U（m）/m]2+[U（As）/As]2

即：UC2（X）rel=UC2（cs）rel+UC2（A）rel+UC2（V）rel+UC2（m）rel+UC2（As）rel

2.4 不確定度的評(píng)定

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度包含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程引入的不確定度。

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度評(píng)定。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書(shū)提供的信息，展青霉素胺的不確定度為±0.5%，按正態(tài)分布考慮，包含因子k=3，屬B類(lèi)評(píng)定，則有相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

U標(biāo)物=0.5%/3=1.67×10-4。

（2）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制過(guò)程引入的不確定度評(píng)定。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有僅1 mg，用5 ml（V1）分度吸量管（A級(jí)）取乙酸乙酯溶解，其溶液為200 μg/ml。再用2 ml（V2）分度吸量管（A級(jí)）取200 μg/ml溶液吹干用乙酸水溶液定容至100 ml，濃度為4 μg/ml。最后用1 ml（V3）分度吸量管（A級(jí)）取4 μg/ml溶液吹干用乙酸水溶液定容至100 ml，濃度為40 ng/ml。

該過(guò)程使用的玻璃量具，按照J(rèn)JG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》的要求，均有相應(yīng)的最大容量允差，按矩形分布考慮，k=。標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液不確定度來(lái)源為：5 ml（V1）分度吸量管（A級(jí)）

由5 ml A級(jí)單標(biāo)移液管引起的不確定度[U（V1）]：

①校準(zhǔn)。A級(jí)5 ml單標(biāo)移液管的容量允許誤差為±0.02 ml，取k=，則U（V11）=0.02/=0.012 ml;

②重復(fù)性。A級(jí)5 ml單標(biāo)移液管讀數(shù)重復(fù)性為±0.01 ml，取k=，則U（V12）=0.01/=0.006 ml;

③ 溫度。實(shí)驗(yàn)室的溫度波動(dòng)范圍一般為±5℃，20℃玻璃膨脹系數(shù)為2.5×10-5/℃，乙酸乙酯體積膨脹系數(shù)為1.39×10-3/℃，容量瓶校準(zhǔn)溫度與使用溫度不同引起的體積不確定值：

ΔV=V1-V2=（α-α玻璃）×V×ΔT=（1.39×10-3-2.5×10-5）×100×5=0.682 5（ml）

按照矩形分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

ΔV/k=0.682 5/=0.393 9（ ml）

Urel（t）=0.393 9 ml/5 ml=0.078 78

以上3項(xiàng)合成得出Urel（V）==0.079 87

因此，標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制過(guò)程的相對(duì)不確定度：

Urel（儲(chǔ)備液）==0.079 87

（3）標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過(guò)程產(chǎn)生的不確定度評(píng)定。標(biāo)準(zhǔn)工作液是由三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋得到的質(zhì)量濃度分別為40 ng/ml。標(biāo)準(zhǔn)工作液制備過(guò)程使用了一系列玻璃量具，按照J(rèn)JG 196-2006的要求，均有相應(yīng)的最大允差，按照矩形分布考慮，k=，相對(duì)不確定度分量見(jiàn)表1 。

因此，標(biāo)準(zhǔn)工作液配制產(chǎn)生的不確定度：Urel標(biāo)曲==0.006 2

由上述不確定度分量，得到展青霉素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：Urell（S）==0.080 11。

2.5 由重復(fù)進(jìn)樣引起的不確定度U（As）與U（A）

由儀器給出標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差為U（As）與U（A），是隨機(jī)測(cè)量，屬A類(lèi)不確定度。

2.5.1 標(biāo)液溶液重復(fù)進(jìn)樣5次測(cè)定峰面積 分別為：43 125、43 598、42 999、43 189、43 345，平均值A(chǔ)S=43 251。

標(biāo)液溶液峰面積的標(biāo)準(zhǔn)不確定度按貝塞爾公式計(jì)算：

U（As）==103

Urel（As）=U（As）/As=0.002 4;

2.5.2 樣品溶液重復(fù)進(jìn)樣5次測(cè)定峰面積 分別為：33 221、33 602、32 621、33 344、33 541，平均值A(chǔ)=33 266。

U（A）==175

Urel（A）=U（A）/A=0.005 3

2.6 儀器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)引入的不確定度

根據(jù)儀器說(shuō)明書(shū)和積分儀的一般性能指標(biāo)分析，目前液相色譜儀峰面積積分處理的最大誤差為0.2%～1.0%，取1.0%，按均勻分布考慮，B 類(lèi)評(píng)定，峰面積的相對(duì)不確定度分量U1=1%/3= 5.77×10-3。

液相色譜儀測(cè)定用微量進(jìn)樣器進(jìn)樣（不確定度1%），按均勻分布考慮，B 類(lèi)評(píng)定，則此項(xiàng)相對(duì)不確定度分量U2=1%/3=5.77×10-3。

儀器數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)引入的不確定度：U儀==0.008 2

由此，得到樣品峰面積測(cè)量的不確定度評(píng)定：U/rel（A）==0.009 8

得到標(biāo)液峰面積測(cè)量的不確定度評(píng)定：U/rel （AS）==0.008 5

2.7 稱(chēng)樣量的不確定度評(píng)定

根據(jù)稱(chēng)量使用的電子天平檢定證書(shū)，其最大允許誤差±0.01 mg，其置信水平99%，按正態(tài)分布考慮，包含因子k=3，則標(biāo)準(zhǔn)不確定度為U（m）=0.01 mg/3= 0.003 33 mg。

樣品稱(chēng)樣量為4.00 g，則其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：Urel（m）=0.003 33 mg/4.00 g =8.25×10-4。

2.8 樣品處理液定容體積的不確定度評(píng)定

樣品經(jīng)稱(chēng)提取、凈化預(yù)處理后，氮?dú)獯蹈桑瑲埩粑镉? ml 流動(dòng)相定容。

2.8.1 定容體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度定容采用1 ml 單標(biāo)線吸量管（A級(jí)），按照檢定規(guī)程JJG 196-2006要求，其最大容量允許誤差為±0.00 7 ml，即相對(duì)允許誤差為±0.7%，按矩形分布考慮，B 類(lèi)評(píng)定，則定容體積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為Urel（V）=0.7%/3=0. 004 04。

2.8.2 ?1 ml單標(biāo)線吸量管校準(zhǔn)溫度與使用溫度不同引起的體積不確定度

ΔV=V1-V2=（α水-α玻璃）×V×ΔT=1.8×10-4×1×5=9.0×10-4（ml）

按照均勻分布換算成標(biāo)準(zhǔn)偏差為：

ΔV/k=9.0×10-4/=5.2×10-4（ml）

Urel（Vt）=5.2×10-4 ml/1 ml=0. 000 52

由以上2項(xiàng)合成得出Urel（V）==0.004 07

2.9 加標(biāo)回收率的不確定度

因樣品前處理不完全或處理過(guò)程中展青霉素的損失，通過(guò)添加三聚氰胺（質(zhì)量濃度50 μg/L）計(jì)算加標(biāo)回收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果得到，該法加標(biāo)回收率為96.5%～101.1%。加標(biāo)回收率的不確定度按JJF 1059-1999的規(guī)定，得到：U2R=。

式中，b+=（101.1-100）%=1.1%，b-=（100-96.5）%=3.5%。

加標(biāo)回收率的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：UR==0.013 28

所以，前處理過(guò)程引起的相對(duì)不確定度為：Uel（P）==0.013 46

2.10 重復(fù)性測(cè)量的不確定度

該不確定度屬A類(lèi)評(píng)定，采用同一樣品進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估，步驟覆蓋實(shí)驗(yàn)方法的全過(guò)程。

測(cè)量重復(fù)性的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：Ux==0.057

通過(guò)表3計(jì)算可得試樣中展青霉素含量的最佳估計(jì)值為X=25.4 μg/kg，則測(cè)量重復(fù)性的相對(duì)不確定度為：Urel X=Ux/X=0.057/25.4=0.002 2

2.11 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度各分量匯總

2.12 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度評(píng)定

由表4中各相對(duì)不確定度合成：

Urel（X）==0.082

2.13 擴(kuò)展不確定度評(píng)定

擴(kuò)展不確定度可由合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度乘以包含因子，取置信水平95%，則k=2。試樣中展青霉素含量測(cè)定的相對(duì)擴(kuò)展不確定度U=Urel（X）×k=0.164。試樣中展青霉素含量的最佳估計(jì)值（X）=25.4 μg/kg，其擴(kuò)展不確定度U=25.4 μg/kg ×0.164=4.17 μg/kg。

3 結(jié)論

高效液相色譜法測(cè)定展青霉素含量，當(dāng)取樣量為4.0 g，k=2（95% 置信度），測(cè)量蘋(píng)果汁中展青霉素的含量為（25.4 ±4.17） μg/kg。

參考文獻(xiàn)

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[4] JJF 1059-1999，測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S]. 1999-01-11.

責(zé)任編輯：劉赟