HPLC—DAD法同時(shí)測(cè)定蒙藥森登—4湯散中7種抗風(fēng)濕活性成分的含量

蘇日塔拉圖 于佳琦 王曦?zé)?劉景林 徐寧 許良

中圖分類號(hào) R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）02-0221-05

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.02.16

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定蒙藥森登-4湯散中7種抗風(fēng)濕活性成分兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素和槲皮素含量的方法。方法：采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法（HPLC-DAD）。色譜柱為Sil Green C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為238 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素和槲皮素檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍分別為8.590～2 290、10.56～3 901、13.00～3 958、8.815～564.2、4.030～257.8、8.130～750.5、7.075～454.2 μg/mL（r≥0.999 1 ）；檢測(cè)限分別為0.429 5、0.264 0、0.325 0、0.220 4、0.201 5、0.203 2、0.176 9 μg/mL，定量限分別為 1.030、1.321、1.302、1.397、1.637、0.813 0、0.707 5 μg/mL；精密度、穩(wěn)定性（48 h）、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均小于2.0%（n=6）；平均加樣回收率分別為96.24%～99.28%，RSD分別為1.03%～1.63%（n=6）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性良好，可用于同時(shí)測(cè)定蒙藥森登-4湯散中兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素和槲皮素的含量。

關(guān)鍵詞 森登-4湯散；高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法；兒茶素；二氫楊梅素；花旗松素；梔子苷；蘆??；楊梅素；槲皮素；含量

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish a method for simultaneous determination of 7 kinds of anti-rheumatic active ingredients in Mongolian medicine Sendeng-4 decoction powder， such as catechin， jasminoidin， dihydromyricetin， texifolin， rutin， myricetin and quercetin. METHODS： HPLC-DAD method was adopted. The determination was performed on Sil Green C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 238 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 10 μL. RESULTS： The linear range of catechin， jasminoidin， dihydromyricetin， texifolin， rutin， myricetin and quercetin were 8.590-2 290， 10.56-3 901， 13.00-3 958， 8.815-564.2， 4.030-257.8， 8.130-750.5， 7.075-454.2 μg/mL （r≥0.999 1）， respectively； the limits of detection were 0.429 5， 0.264 0， 0.325 0， 0.220 4， 0.201 5， 0.203 2， 0.176 9 μg/mL， respectively； the limits of quantification were 1.030， 1.321， 1.302， 1.397， 1.637， 0.813 0， 0.707 5 μg/mL， respectively. RSDs of precision， stability （48 h） and repetition tests were all lower than 2.0% （n=6）. The average recoveries were 96.24%-99.28% （RSD=1.03%-1.63%， n=6）. CONCLUSIONS： The established method is simple， accurate and reproducible， and can be used for simultaneous determination of catechin， jasminoidin， dihydromyricetin， texifolin， rutin， myricetin and quercetin in Mongolian medicine Sendeng-4 decoction powder.

KEYWORDS Sendeng-4 decoction powder； HPLC-DAD； Catechin； Dihydromyricetin； Texifolin； Jasminoidin； Rutin； Myricetin； Quercetin； Content

蒙藥森登-4湯散是蒙醫(yī)臨床常用的抗風(fēng)濕成藥，于1881年收錄于蒙醫(yī)學(xué)家吉格木德丹金扎木蘇著作《觀者之喜》[1]，并收載于《傳統(tǒng)蒙藥與方劑》[2]。該藥由4味藥組成，其中文冠木15 g，川楝子9 g，梔子3 g，訶子3 g；具有清熱、燥黃水的功效，用于治療痛風(fēng)、關(guān)節(jié)炎、水腫等病癥。近年來(lái)對(duì)森登-4湯散的化學(xué)成分、藥理及毒理作用、含量測(cè)定、煎煮及提取工藝、指標(biāo)成分的藥動(dòng)學(xué)、譜效關(guān)系、抗風(fēng)濕作用機(jī)制的代謝組學(xué)、配伍機(jī)制等方面的研究已有報(bào)道[3-8]。為了進(jìn)一步闡明森登-4湯散藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及其抗風(fēng)濕作用機(jī)制及組方原理，內(nèi)蒙古民族大學(xué)許良課題組研究建立了同時(shí)測(cè)定[9]森登-4湯散中兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素和槲皮素7種活性成分的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法（HPLC-DAD）。

1 材料

1.1 儀器

600型高效液相色譜儀，配有2996型光電二極管檢測(cè)器、717型自動(dòng)進(jìn)樣器、600型四元泵（美國(guó)Waters公司）；AB-135S型電子天平（瑞士Mettler-Toledo 公司）；HH-S26S型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市金壇大地自動(dòng)化儀器廠）；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；2B型玻璃儀器氣流烘干器（山東華魯電熱儀器有限公司）；SHZ-CB型循環(huán)水式多用真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；B-220型恒溫水浴鍋、RE-52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 藥材、藥品與試劑

4種蒙藥材文冠木（批號(hào)：20150812）、訶子（批號(hào)：20161002）、梔子（批號(hào)：20151101）、川楝子（批號(hào)：20160108）均購(gòu)自通遼市北方藥材市場(chǎng)，由內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院蒙藥制劑室蘇日塔拉圖副主任蒙藥師鑒定，其中文冠木藥材為無(wú)患子科植物文冠木（Xanthoceras sorbifolia Bunge.）的干燥莖干；川楝子藥材為楝科植物川楝（MeLia toosendan Sieb.et Zucc.）的干燥成熟果實(shí)；梔子藥材為茜草科植物梔子（Gardenia jasminoides Ellis.）的成熟果實(shí)；訶子藥材為使君子科植物訶子（Terminalia chebula Retz.）的成熟果實(shí)。按文冠木15 g、川楝子9 g、梔子3 g、訶子3 g的處方比例，制成粗粉，過(guò)篩，混勻，即得6批樣品（批號(hào)分別為20160115、20160130、20160215、20160228、20160302、20160510）。

花旗松素對(duì)照品（批號(hào)：A0082，純度：99.2%）由成都曼思特生物科技有限公司提供；槲皮素對(duì)照品（批號(hào)：110081-200907，純度：98.6%）、梔子苷對(duì)照品（批號(hào)：110749-200511，純度：98%）、兒茶素對(duì)照品（批號(hào)：110877-201203，純度：98.5%） 、蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：00809705，純度：99%）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；楊梅素對(duì)照品（批號(hào)：100504，純度：>98%）、二氫楊梅素對(duì)照品（批號(hào)：101206，純度：98.9%）均購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，乙醇為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Sil Green C18（250 mm×4.6 mm，5 μm ）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～4 min，8%A→9%A；4～13 min，9%A→10%A；13～33 min，10%A→14%A；33～45 min，14%A→16%A；45～48 min，16%A→20%A ；48～70 min，20%A→21%A；70～80 min，21%A→30%A ；80～90 min，30%A→32%A；90～100 min，32%A→100%A；100～105 min，100%A；105～106 min，100%A→8%A ；106～110 min，8%A ）；流速：1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品及混合對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品楊梅素1.876 5 mg、兒茶素1.792 5 mg、槲皮素1.690 0 mg、 花旗松素3.257 5 mg、二氫楊梅素2.725 0 mg、 梔子苷1.077 5 mg、蘆丁1.327 5 mg，分別置于5 mL量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得單一對(duì)照品溶液。精密稱取單一對(duì)照品楊梅素3.753 mg、兒茶素11.45 mg、 槲皮素2.271 mg、花旗松素2.821 mg、二氫楊梅素19.79 mg、梔子苷19.50 mg、蘆丁1.289 mg，置于同一5 mL量瓶中，以甲醇定容，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。根據(jù)所需將混合對(duì)照品溶液用甲醇稀釋不同的倍數(shù)，即得到7種濃度的混合對(duì)照品溶液。

7種混合對(duì)照品溶液中，楊梅素質(zhì)量濃度分別為0.008 130、0.032 50、0.130 0、0.260 0、0.404 5、0.509 9、0.750 5 mg/mL；兒茶素質(zhì)量濃度分別為0.008 590、0.034 44、0.137 5、0.275 0、1.038、1.600、2.290 mg/mL；梔子苷質(zhì)量濃度分別為0.010 56、0.042 25、0.169 0、0.338 0、0.975 1、1.950、3.901 mg/mL；二氫楊梅素質(zhì)量濃度分別為0.013 00、0.052 00、0.104 0、0.416 0、0.989 5、1.980、3.958 mg/mL；花旗松素質(zhì)量濃度分別為0.008 815、0.017 63、0.035 26、0.070 53、0.141 1、0.282 1、0.564 2 mg/mL；蘆丁質(zhì)量濃度分別為0.004 03、0.008 060、 0.016 11、0.032 23、0.064 45、0.128 9、0.257 8 mg/mL；楊梅素質(zhì)量濃度分別為0.008 130、0.032 50、0.130 0、0.260 0、0.404 5、0.509 9、0.750 5 mg/mL；槲皮素質(zhì)量濃度分別為0.007 075、0.014 19、0.028 39、0.056 78、0.113 6、0.227 1、0.454 2 mg/mL。以上溶液均于4 ℃冷藏、備用。

2.2.2 供試品溶液 精密稱取森登-4樣品1.000 0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇10 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：300 W，頻率：50 kHz）2次，每次20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用95%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照品溶液 精密稱取缺文冠木和梔子的森登-4樣品1.000 0 g，按“2.2.2”項(xiàng)下方法處理和操作，得陰性對(duì)照品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照品溶液各10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，在該色譜條件下，各被測(cè)成分之間、被測(cè)成分與雜質(zhì)峰均基線分離，7種成分的分離度均大于1.5，理論板數(shù)按梔子苷峰計(jì)大于5 000，詳見(jiàn)圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液 10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并行進(jìn)樣6次，取平均值。以待測(cè)成分質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，線性關(guān)系考察 結(jié)果詳見(jiàn)表1。

結(jié)果表明，7種成分在一定濃度范圍內(nèi)，其質(zhì)量濃度與峰面積之間具有良好的線性關(guān)系。

2.5 檢測(cè)限與定量限考察

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液適量，倍比稀釋，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)得檢測(cè)限；當(dāng)信噪比10 ∶ 1時(shí)得定量限。結(jié)果，兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素、槲皮素的檢測(cè)限分別為0.429 5、0.264 0、0.325 0、0.220 4、0.201 5、0.203 2、0.176 9 μg/mL，定量限分別為 1.030、1.321、1.302、1.397、1.637、0.813 0、0.707 5 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素、槲皮素峰面積的RSD值分別為0.82%、0.64%、1.22%、0.90%、0.38%、1.71%、0.84%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液（批號(hào)：20160130）10 μL，分別于室溫下放置0、 2、4、12、 24、 48 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素、槲皮素的峰面積RSD值分別為0.67%、0.89%、1.00%、1.31%、0.51%、0.29%、1.90%（n=6），表明供試品溶液在室溫下放置48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批森登-4湯散樣品（批號(hào)：20160130）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算樣品平均含量。結(jié)果，兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素、槲皮素峰面積RSD值分別為0.16%、0.18%、0.12%、0.007 5%、0.005 2%、0.004 8%、0.006 3%（n=6），含量的平均值分別為1.592、3.978、3.866、0.367 8、0.125 4、0.543 3、0.187 6 mg/g，表明本方法重復(fù)性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取森登-4湯散樣品（批號(hào)：20160130） 適量，共6份，每份約1.000 0 g，共6份，精密稱定，分別置于25.00 mL量瓶中，分別精密加入兒茶素（0.358 5 mg/mL）、梔子苷（0.215 5 mg/mL）、二氫楊梅素（0.545 0 mg/mL）、花旗松素（0.651 5 mg/mL）、蘆?。?.265 5 mg/mL）、楊梅素（0.375 3 mg/mL）和槲皮素（0.338 0 mg/mL）單一對(duì)照品溶液，其中低濃度組加1.00 mL、中濃度組加2.00 mL、高濃度組加3.00 mL。按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，詳見(jiàn)表2。

2.10 樣品含量測(cè)定

取6批樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并行測(cè)定3次，記錄峰面積并計(jì)算樣品平均含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法的選擇

本試驗(yàn)分別用95%乙醇回流提取法（回流提取2次，每次1.5 h）和超聲提取法提?。üβ剩?00 W，頻率：50 kHz，超聲2次，每次20 min）供試品中7種成分，對(duì)所得到的提取物的HPLC譜圖做了比較，從中選擇供試品提取方法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用超聲提取法制備供試品溶液的HPLC譜圖中7種成分的干擾成分少，色譜峰形和分離度均優(yōu)于乙醇回流提取方法所提取物。因此，本試驗(yàn)選擇超聲提取法制備供試品溶液。

3.2 檢測(cè)指標(biāo)的選擇

內(nèi)蒙古民族大學(xué)許良課題組對(duì)森登-4湯散血液中檢測(cè)到的成分研究表明，蘆丁、槲皮素和梔子苷等成分為該方中的抗風(fēng)濕藥效成分，該結(jié)論在這3種成分的抗炎鎮(zhèn)痛藥理作用研究中得到佐證[10-11]；二氫楊梅素、楊梅素和兒茶素具有抗炎等多種生物活性[12-14]；花旗松素有增強(qiáng)免疫力功效[15]。因此，森登-4湯散中上述7種成分含量的同時(shí)測(cè)定對(duì)森登-4湯散的質(zhì)量控制具有現(xiàn)實(shí)意義，也能對(duì)后續(xù)復(fù)方藥物提取工藝優(yōu)化中用多指標(biāo)評(píng)價(jià)工藝提供方法依據(jù)。

3.3 色譜條件的選擇

3.3.1 流動(dòng)相 色譜條件考察中，筆者曾分別采用甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，并梯度洗脫。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用乙腈-0.1%磷酸溶液作流動(dòng)相時(shí)，7種待測(cè)成分的色譜峰形、分離度均良好，最終選用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相[16]。

3.3.2 檢測(cè)波長(zhǎng) 本研究采用DAD檢測(cè)器對(duì)供試品溶液在200～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素和槲皮素在238 nm波長(zhǎng)處具有較強(qiáng)的紫外吸收，均能檢測(cè)到良好的色譜信號(hào)，在此波長(zhǎng)處7種待測(cè)成分色譜峰均無(wú)干擾峰。因此選擇238 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3.3 柱溫 本試驗(yàn)表明，室溫（25 ℃）下槲皮素的保留時(shí)間不夠穩(wěn)定，而柱溫控制在30 ℃時(shí)其保留時(shí)間穩(wěn)定，其余6種成分未受柱溫影響，故最終選用30 ℃為柱溫。

3.4 含量測(cè)定結(jié)果分析

森登-4湯散中兒茶素、梔子苷、二氫楊梅素、花旗松素、蘆丁、楊梅素和槲皮素的平均含量分別為1.598、3.981、3.870、0.367 9、0.126 8、0.548 6、0.186 9 mg/g，即梔子苷含量最高，二氫楊梅素含量次之，而蘆丁含量最低。森登-4湯散中某種成分的含量高低由原藥材中該成分的相對(duì)含量、組方中該藥材的比例、藥材來(lái)源、貯藏以及配伍之后該成分的溶出度等因素有關(guān)。6批樣品中7種成分含量之間無(wú)明顯差異（RSD<2.0%），說(shuō)明生產(chǎn)6批蒙藥森登-4湯散所用的4種藥材質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定。

綜上，本研究所建立森登-4湯散中7種成分含量的測(cè)定方法專屬性強(qiáng)、穩(wěn)定、精密度和準(zhǔn)確度良好，可用于森登-4湯散中上述7種成分含量的同時(shí)測(cè)定。

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（收稿日期：2018-04-30 修回日期：2018-12-04）

（編輯：余慶華）