復(fù)方鉤藤降壓片調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號通路對自發(fā)性高血壓大鼠炎癥狀態(tài)的影響

李霞 曾勇 張穩(wěn)

〔摘要〕 目的 研究復(fù)方鉤藤降壓片對TLR4/NF-κB信號通路以及血管緊張素II（angiotensinII， AngII）、血管緊張素（1-7）[angiotensin1-7， Ang（1-7）]、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1， MCP-1）相關(guān)炎癥因子表達(dá)的影響，探討復(fù)方鉤藤降壓片對自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensire rats， SHR）的可能降壓機(jī)制。方法 將21只7周齡雄性SHR隨機(jī)分為模型對照組（SHR組）、復(fù)方鉤藤降壓片治療組（SHR-G組）、纈沙坦片治療組（SHR-D組），另取7只雄性WKY大鼠為空白對照組（WKY組）。所有大鼠給予相應(yīng)干預(yù)，6周后采用ELISA方法檢測血清中AngII、Ang（1-7）和MCP-1的含量;采用免疫組織化學(xué)方法檢測胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中TLR4和NF-κB p65的蛋白水平。結(jié)果 （1）SHR組血漿促炎因子AngII、MCP-1的含量明顯高于WKY組（P<0.05），而抑炎因子Ang（1-7）的含量明顯低于WKY組（P<0.01）;經(jīng)復(fù)方鉤藤降壓片和纈沙坦片干預(yù)，可以明顯降低SHR血漿中AngII和MCP-1的含量（P<0.05），而增加血漿抑炎因子Ang（1-7）的含量（P<0.05 or P<0.01）。（2）SHR組胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中TLR4和NF-κB p65的蛋白水平明顯高于WKY組（P<0.01）;相對于SHR組，SHR-D和SHR-G組大鼠胸主動脈組織中TLR4和NF-κB p65的表達(dá)量顯著降低（P<0.05 or P<0.01）。結(jié)論 復(fù)方鉤藤降壓片可通過抑制胸主動脈組織內(nèi)皮細(xì)胞TLR4/NF-κB信號通路的活化，降低促炎因子AngII、MCP-1的水平，提高抑炎因子Ang（1-7）的水平，抑制機(jī)體的炎癥狀態(tài)。

〔關(guān)鍵詞〕 復(fù)方鉤藤降壓片;自發(fā)性高血壓;TLR4/NF-κB信號通路;血管緊張素II;血管緊張素（1-7）;單核細(xì)胞趨化蛋白-1

〔中圖分類號〕R28.5;R544.1? ? ? ?〔文獻(xiàn)標(biāo)志碼〕A? ? ? ?〔文章編號〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.02.005

高血壓病的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，如遺傳、高鈉飲食，腎素-血管緊張素-醛固酮學(xué)說等[1]，其中炎癥機(jī)制在高血壓病的發(fā)生及高血壓病對各靶器官的損害方面有越來越多的研究，逐步證實了炎癥是高血壓發(fā)生及發(fā)展的重要因素[2]。中醫(yī)藥在高血壓病的治療及其并發(fā)癥的防治方面發(fā)揮著重要的作用[3]，本課題組前期研究證實了中成藥復(fù)方鉤藤降壓片具有降壓，降低自發(fā)性高血壓大鼠（spontaneously hypertensive rats， SHR）血清急性期反應(yīng)蛋白、IL-6等炎癥因子，降低醛固酮、內(nèi)皮素含量及減輕對心臟、腎臟等靶器官損害的作用[4-5]。但具體的作用機(jī)制尚未深入探討，本文通過研究經(jīng)復(fù)方鉤藤降壓片干預(yù)后的自發(fā)性SHR血漿中血管緊張素II（angiotensinII， AngII）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemoattractant protein-1， MCP-1）、血管緊張素（1-7） [angiotensin1-7， Ang（1-7）]含量的變化，以及主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中TLR4、NF-κB p65蛋白的變化，進(jìn)一步探討復(fù)方鉤藤降壓片對SHR炎癥狀態(tài)的影響及其可能機(jī)制，為復(fù)方鉤藤降壓片的降壓作用提供新的實驗依據(jù)。

1 材料

1.1? 實驗動物

SPF級大鼠28只購至北京維通利華實驗技術(shù)有限公司，SHR21只，正常血壓對照大鼠（Wistar-Kyoto，WKY）7只，年齡：7周，雄性，體質(zhì)量210～230 g，SHR血壓160～190 mmHg，WKY大鼠血壓110～130 mmHg。

1.2? 試劑

復(fù)方鉤藤降壓片（批號20160324，0.4 g/片）（湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑產(chǎn)品）;纈沙坦片，批號20160557 80 mg/片，（北京諾華制藥有限公司）。多聚甲醛、水合氯醛、PBS液、anti-NF-κB p65抗體、anti-TLR4抗體（eBioscience公司）;辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（H+L）以及DAB顯示液（北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3? 儀器

LKB-Ⅲ型超薄切片機(jī)（瑞典LKB公司）;病理組織包埋機(jī)（深圳永年科技）;組織攤片機(jī)機(jī)（德國SLEE公司）;倒置顯微鏡及拍照裝置（OLYMPUS公司）;biocell2010型酶標(biāo)儀（Biocell公司）;Motie Images Advaneed 3.2 彩色圖像分析系統(tǒng)（MotiC公司）。

2 方法

2.1? 實驗分組及干預(yù)

將24只SHR隨機(jī)分為模型對照組（SHR組）、復(fù)方鉤藤降壓片治療組（SHR-G組）和纈沙坦治療組（SHR-D組）;將8只WKY大鼠作為空白對照組（WKY 組）。每天在固定時間對SHR組和WKY組大鼠進(jìn)行蒸餾水灌胃;SHR-G組用由蒸餾水配制的濃度為43.2 mg/mL的復(fù)方鉤藤降壓片按0.432 g/（kg·d）灌胃;SHR-D組用蒸餾水將纈沙坦配制成濃度0.72 mg/mL的液體后按7.2 mg/（kg·d）灌胃，每天1次，共干預(yù)6周。干預(yù)期間每周測1次血壓并稱量體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整復(fù)方鉤藤降壓和纈沙坦的劑量。

2.2? ELISA法測定AngⅡ、Ang（1-7）、MCP-1

按照ELISA試劑盒的步驟檢測各組大鼠血漿中AngⅡ、Ang（1-7）、MCP-1的含量：使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下檢測樣品的吸光度值（OD值），然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出血清中炎癥因子的含量。

2.3? 免疫組化法檢測大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中TLR4及NF-ΚB p65蛋白的表達(dá)

將各組大鼠胸主動脈組織制備成石蠟切片，經(jīng)免疫組化染色處理后，用400倍的高倍鏡對免疫組織化學(xué)結(jié)果拍取5個不重疊視野，采用Motie Images Advanced 3.2彩色圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析，陽性信號為胞質(zhì)或胞核呈現(xiàn)棕黃色顆粒，測定陽性顆粒的平均光密度（AOD）值表達(dá)組織中蛋白的含量。AOD值越大陽性越強(qiáng)，AOD值越小陽性越弱。

2.4? 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量資料以“x±s”形式表示， 組間兩兩比較采用最小顯著差值法（LSD），各組間比較采用方差分析（ANOVA）。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.01表示差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1? 復(fù)方鉤藤降壓片對SHR大鼠血清炎癥因子AngⅡ、Ang（1-7）和MCP-1濃度的影響

與WKY組比較，SHR組大鼠血漿AngⅡ和MCP-1的濃度明顯升高（P<0.05）;與SHR組比較，SHR-G組和SHR-D組血清炎癥因子AngⅡ和MCP-1的濃度顯著降低（P<0.05）;與WKY組比較，SHR組大鼠血液Ang（1-7）濃度明顯降低（P<0.01）;與SHR組比較，SHR-D組Ang（1-7）濃度明顯升高（P<0.01）;與SHR組比較，SHR-G組Ang（1-7）濃度明顯升高（P<0.05）。結(jié)果表見表1。

3.2? 復(fù)方鉤藤降壓片對SHR胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中TLR4及NF-ΚB p65表達(dá)量的影響

免疫組化結(jié)果顯示：與WKY組比較，SHR組胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)量明顯升高（P<0.01）;與SHR組比較，SHR-D組胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.05）;與SHR組比較，SHR-G組大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)量明顯降低（P<0.01）。與SHR-D組比較，SHR-G組大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中TLR4和NF-κB p65蛋白表達(dá)量明顯降低（P<0.05）。結(jié)果見表2。

4 討論

腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（reninangiotensin-aldosteronstem， RAAS）的激活在高血壓的發(fā)生以及對高血壓靶器官的損害方面是一種極其重要的機(jī)制，其重要成員血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）除了調(diào)節(jié)血壓及維持血容量外，還能激發(fā)炎癥反應(yīng)活性和氧化活性。諸多研究表明AngⅡ介導(dǎo)的血管炎癥反應(yīng)在心肌纖維化、肺纖維化、血管平滑肌生長以及肝纖維化的過程中起著重要的作用[6]，AngⅡ可以刺激血管平滑肌細(xì)胞產(chǎn)生TNF-a、IL-6、IL-8、VCAM-1、MCP-1等炎癥因子[7-11]。

Toll樣受體（toll-like receptors， TLRs）是一類表達(dá)于細(xì)胞表面，介導(dǎo)細(xì)胞信號傳導(dǎo)的重要受體，TLRs在慢性炎癥、免疫應(yīng)答和脂質(zhì)代謝的過程發(fā)揮重要的作用，其中TLR4是研究最多的受體之一。AngⅡ可以激活TLR4信號通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，參與高血壓病、心肌纖維化等心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展[8-13]。TLR4通過上調(diào)其下游因子NF-kB的表達(dá)調(diào)控多種炎性因子的釋放，包括IL-1β、TNF-a、IL-12/23、IL-8、趨化因子（MIP-1a、MCP-1）、一氧化氮、黏附分子（ICAM-κB、VCAM、E-選擇素）等，從而使機(jī)體產(chǎn)生損傷。研究發(fā)現(xiàn)AngⅡ可直接結(jié)合到心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的TLR上，促進(jìn)TLR下游NF-κB信號通路的活化，分泌細(xì)胞因子和趨化因子，招募并激活單核/巨噬細(xì)胞，引起更大的炎癥反應(yīng)[14]。NF-κB信號通路活化介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在原發(fā)性高血壓、自發(fā)性高血壓和血管緊張素Ⅱ引起的高血壓的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[15-16]。

RAAS系統(tǒng)中除了AngII外，還發(fā)現(xiàn)了血管緊張素系統(tǒng)新成員：血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE2）-血管緊張素Ang（1-7）-MAS受體軸，ACE2通過直接降解AngⅡ或AngI依次生成Ang（1-9）和Ang（1-7）。Ang（1-7）可以與G蛋白耦聯(lián)受體Mas結(jié)合，通過Mas受體發(fā)揮抑制AngⅡ的作用[17]。Ang（1-7）在體內(nèi)主要分布在血液，心臟，腎臟血管等多處，發(fā)揮著抗炎、保護(hù)血管、延緩心室重構(gòu)、延緩腎臟纖維化、穩(wěn)定內(nèi)皮細(xì)胞等多重作用。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）2-血管緊張素Ang （1-7）-MAS受體軸對于經(jīng)典的ACE-AngⅡ-Ang1型受體軸具有反向調(diào)節(jié)作用，國內(nèi)外諸多研究表明，Ang（1-7）可通過Ang-（1-7）-Mas軸下調(diào)NF-κB信號通路途徑來抑制AngⅡ引起的炎癥反應(yīng)達(dá)到降壓、保護(hù)心臟，延緩心室重構(gòu)、延緩動脈粥樣硬化，以及減輕高血壓對心、腦、腎等靶器官的損害，逆轉(zhuǎn)肺纖維化、肝纖維化等作用[18-27]。

本實驗研究從炎癥穩(wěn)態(tài)失衡可能導(dǎo)致高血壓發(fā)生的角度探討復(fù)方鉤藤降壓片的作用機(jī)制。實驗結(jié)果顯示SHR血漿中炎癥因子MCP-1和AngⅡ的含量以及胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中TLR4、NF-κB p65的表達(dá)量顯著增加，而血漿中抑炎因子Ang（1-7）含量明顯降低，說明SHR體內(nèi)炎癥反應(yīng)明顯高于正常大鼠。復(fù)方鉤藤降壓片具有與高血壓治療藥物纈沙坦類似的作用，可以降低SHR血漿中炎癥因子MCP-1和AngⅡ的含量以及胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中TLR4、NF-κB p65的表達(dá)，而增加血漿中抑炎因子Ang（1-7）的含量，可以減輕SHR的炎癥狀態(tài)。此外，相對于纈沙坦治療組，復(fù)方鉤藤降壓片干預(yù)組大鼠胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞中TLR4、NF-κB p65的蛋白表達(dá)量明顯降低，說明相對于纈沙坦，復(fù)方鉤藤降壓片作用更明顯。

團(tuán)隊前期研究結(jié)果[5]和本文研究結(jié)果均表明，復(fù)方鉤藤降壓片能夠降低胸主動脈內(nèi)皮細(xì)胞TLR4和NF-κB p65蛋白的表達(dá)，可通過抑制TLR4/NF-κB p65信號通路的活化，抑制AngII和MCP-1的促炎作用，調(diào)節(jié)Ang1-7的抑炎癥作用，減少機(jī)體的炎癥反應(yīng)來達(dá)到降壓效果。

參考文獻(xiàn)

[1] 陳灝珠，林果為.實用內(nèi)科學(xué)[M].13版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：1525-1526.

[2] TSOUNIS D， BOURAS G， GIANNOPOULOS G， et al. Inflammation markers in essential hypertension[J]. Medical Chemistry Chem， 2014，10（7）：72-81.

[3] 嚴(yán)亞鋒，劉緒銀，張學(xué)文，等.國醫(yī)大師張學(xué)文教授治療原發(fā)性高血壓病肝熱血瘀證用藥規(guī)律研究[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2017，37（11）：1176-1180.

[4] 黃娟娟，譚元生.復(fù)方鉤藤降壓片治療原發(fā)性高血壓陰虛陽亢挾瘀證療效及對cys C、hs-CRP的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2013，7（33）：72-75.

[5] 曾? 勇，譚? 超，葉舒婷，等.復(fù)方鉤藤降壓片對自發(fā)性高血壓大鼠血壓及炎癥水平的影響[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2014，32（12）：2983-2985.

[6] MARCHESI C， PARADIS P， SCHIFFRIN E L. Role of the renin-angiotensin system in vascular inflammation[J]. Trends in Pharmacological Sciences， 2008，29（7）：367-374.

[7] ALVAREZ A， CERDá-NICOLáS M， NAIM ABU NABAH Y. Direct evidence of leukocyte adhesion in arterioles by angiotensin II[J]. Blood， 2004，104：402–408.

[8] PIQUERAS L， KUBES P， ALVAREZ A. Angiotensin II induces leukocyte-endothelial cell interactions in vio via AT （1） and AT（2）receptor-mediated P-selectin upregulation[J]. Circulation， 2000，

104（2）：2118-2123.

[9] NOBUHIKO A， SUGANUMA E， BABAEV V R. Angiotensin II amplifies macrophage-driven atherosclerosis[J]. Arteriosclerosis， Thrombosis and Vascular Biology， 2004，24（11）：2143-2148.

[10] HAN C， LIU J， LIU X， et al. Angiotension II induces C-reactive protein expression through ERK1/2 and JNK signaling in human aortic cells[J]. Atherosclerosis， 2010，212（1）：206-212.

[11] WANG C H， LI S H， WEISEL R D. C-reactive protein upregulates angiotensin type 1 receptors in vascular smooth muscle[J]. Circulation， 2003，107（13）：1783-1790.

[12] DANDONA P， KUMAR V， ALJADA A. Angiotensin II receptor blocker valsartan suppresses reactive oxygen species generation in leukocytes， nuclear factor-kappa B， in mononuclear cells of normal subjects： evidence of an anti-inflammatory action[J]. Jonrnal of Clinical Endocrinology & Metabolism， 2003，88（9）：4496-4501.

[13] YOUNG C N， LI A， DONG F N. et al， Endoplasmic reticulum? and oxidant stress mediate nuclear factor-kB activation in the subfornical organ during angiotensin II hypertension[J]. American Journal of Physiology-Cell Physiology， 2015，308（10）：803-812.

[14] WU K I， SCHMID-SCHONBEIN G W. Nuclear factor kappa B and matrix metalloproteinase induced receptor cleavage in the spontaneously hypertensive rat[J]. Hypertension， 2011，57（2）：261-268.

[15] BADER M. ACE2， angiotensin-（1-7）， and Mas： the other side of the coin[J]. Pflügers Archiv-European Journal of Physiology， 2013，

465（1）：79-85.

[16] FRAGA-SILVA R A， FERREIRA A J， DOS SANTOS R A. Opportunities for targeting the angiotensin-converting enzyme 2/angiotensin-（1-7）/mas receptor pathway in hypertension[J]. Current Hypertension Reports， 2013，15（1）：31-38.

[17] FERRARIO C M， CHAPPELL M C， TALLANT E A， et al. Counterregulatory actions of angiotensin-（1-7）[J]. Hypertension，1997，30（3Pt2）：535-541.

[18] FRAGA-SILVA R A， SAVERGNINI S Q， MONTECUCCO F， et al. Treatment with angiotensin-（1-7） reduces inflammation in carotid atherosclerotic plaques[J]. Thrombosis and Haemostasis， 2014， 111（4）：736-747.

[19] SKIBA D S， NOSALSKI R， MIKOLAJCZYK T P， et al. Anti-atherosclerotic effect of the angiotensin1-7 mimetic AVE0991 is mediated by inhibition of perivascular and plaque inflammation in early atherosclerosis[J]. British Journal of Pharmacology， 2017，174（22）：4055-4069.

[20] SANTIAGO N M， GUIMARAES P S， SIRVENTE R A， et al. Lifetime overproduction of circulating Angiotensin-（1-7） attenuates deoxycorticosterone acetate-salt hypertension-induced cardiac dysfunction and remodeling[J]. Hypertension， 2010，55（4）：889-896.

[21] BERTAGNOLLI M， CASALI K R， DE SOUSA F B， et al. An orally active angiotensin-（1-7） inclusion compound and exercise training produce similar cardiovascular effects in spontaneously hypertensive rats[J]. Peptides， 2014，51：65-73.

[22] LU W， KANG J， HU K， et al. Angiotensin-（1-7） relieved renal injury induced by chronic intermittent hypoxia in rats by reducing inflammation， oxidative stress and fibrosis[J]. Brazilian Journal of Medical and Biological Research， 2017，50（1）：55-94.

[23] ALMEIDA P W M D， MELO M B， LIMA R F， et al. Beneficial effects of angiotensin-（1-7） against deoxycorticosterone acetate-induced diastolic dysfunction occur independently of changes in blood pressure[J]. Hypertension， 2015，66（2）：389-395.

[24] GUO L， YIN A， ZHANG Q， et al. Angiotensin-（1-7） attenuates angiotensin II-induced cardiac hypertrophy via a Sirt3-dependent mechanism[J]. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology， 2017，12（5）：H980-H991.

[25] LIN L， LIU X， XU J， et al. Mas receptor mediates cardioprotection of angiotensin-（1-7） against angiotensin II-induced cardiomyocyte autophagy and cardiac remodelling through inhibition of oxidative stress[J]. Journal of Cellular and Molecular Medicine， 2016， 20（1）：48-57.

[26] REGENHARDT R W， MECCA A P， DESLAND F， et al. Centrally administered angiotensin-（1-7） increases the survival of stroke-prone spontaneously hypertensive rats[J]. Experimental Physiology， 2014，9（2）：442-453.

[27] 劉? 娟，楊志明，邊云飛，等.血管緊張素-（1-7）通過ERK1/2、NF-κB信號通路對泡沫細(xì)胞形成的影響[J].中國動脈硬化雜志，2012，20（7）：593-599.