靜寧雞PPARa基因克隆與生物信息學分析

楊妍梅　李玉　覃圣　蔣劉芽　趙金潭　陸曉東　熊杰　陳偉基　扎西英派

摘要：為闡明靜寧雞PPARa基因的結(jié)構(gòu)及功能，根據(jù)NCBI上登錄的原雞PPARc基因的CDS序列設計引物，以靜寧雞腎臟為材料采用PCR的方法，對目的基因進行克隆，并測序。根據(jù)測序的結(jié)果，采用各類分析軟件，對所獲得的DNA片段進行生物信息學分析。結(jié)果成功克隆了靜寧雞PPARa基因的全長CDS序列。生物信息學分析結(jié)果表明，該基因CDS全長1407 bp，所編碼的蛋白質(zhì)包含468個氨基酸。其分子量為52300，等電點為5.85。在二級和三級結(jié)構(gòu)上，a-螺旋和無規(guī)則卷曲為蛋白的主要結(jié)構(gòu)形式。PPARc蛋白是一個親水性蛋白質(zhì)，不存在跨膜區(qū)域，不含信號肽，沒有N-糖基化位點，但存在16個0-糖基化位點，存在25個絲氨酸（Ser）磷酸化位點、12個蘇氨酸（Thr）磷酸化位點和6個酪氨酸（Tyr）磷酸化位點。靜寧雞PPARa蛋白在第100～168個氨基酸之間有1個ZnF_C4結(jié)構(gòu)域，在第264～449個氨基酸之間有1個HOLI結(jié)構(gòu)域。同源性分析結(jié)果表明，靜寧雞PPARa基因與原雞的親緣關系最近。靜寧雞PPARa基因的成功克隆和功能預測為進一步研究PPARa基因在靜寧雞脂肪代謝中的作用提供了基礎。

關鍵詞：靜寧雞;過氧化物酶體增殖劑激活受體;生物信息學分析

中圖分類號：Q785

文獻標識碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0370-08

過氧化物酶體增殖劑激活受體（Peroxisome proliferators-activated receptors，PPARs）在1990年被英國科學家Isseman和Green首先發(fā)現(xiàn)"。它是一種新型的固醇類激素受體和配體依賴的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于核受體第一亞家族C群（NR1C）[2]。PPARs是一個由3種核受體組成的家族，目前已知有3種亞型：PPARa、PPARγ、PPARβ。這3種亞型由不同的基因編碼，在組織中的表達和功能也不同[34。PPARs基因在心臟，脂肪組織，腦，腸，肌肉，脾臟，肺臟，腎上腺和大鼠脊髓中普遍存在。PPARs基因可被長鏈脂肪酸激活，廣泛存在于體內(nèi)脂肪代謝旺盛的組織中。

近年來，國內(nèi)外學者對畜禽PPARs進行了深入研究，如Sundvold等[5]對豬10種組織PPARs的Northern blot檢測發(fā)現(xiàn)，PPARa較高表達于肝臟和腎臟，中等程度表達于心肌、骨骼肌和小腸。Diot等[6]對雞9種組織進行Northern blot檢測，結(jié)果顯示雞PPARa mRNA在肝臟、心臟和腎臟中高表達，在尾脂腺也有較高的表達。孟和等[7]的研究結(jié)果表明，PPARa mRNA只在雞心臟、肝臟、腎臟和胃這4種組織中表達，在肝臟雜交信號最強。田亞東等[8]的研究結(jié)果表明，PPARa基因影響雞體脂肪代謝。孟和等[9]的研究結(jié)果表明，PPARa基因已在AA肉雞中檢測到單堿基突變位點，在3種中國地方品種中也檢測到，如石岐雜雞、北京油雞和白耳雞。該突變位點顯著影響雞群的腹脂質(zhì)量和胴體性狀，推測該基因是影響雞體脂肪代謝的主效基因或與控制該性狀的主效基因連鎖，因此，它可作為雞脂肪性狀的標記輔助選擇的分子標記[9]，該研究結(jié)果與田亞東等[8]所得結(jié)果相似。

靜寧雞主產(chǎn)區(qū)分布在甘肅省靜寧縣和寧夏回族自治區(qū)固原市，甘肅省莊浪、通渭、華亭、秦安和會寧，寧夏回族自治區(qū)隆德、涇源和西吉等也有分布，靜寧雞以靜寧縣的雞源多和品質(zhì)好而得名。靜寧雞以低脂肪、高蛋白、肉質(zhì)鮮嫩、雞汁鮮美而聞名[10]。由于在實際生產(chǎn)中，靜寧雞生長速度較緩，在一定程度上影響了該品種的開發(fā)利用，以致靜寧雞日趨減少且表現(xiàn)出混雜退化的趨勢。隨著人們消費水平的提高，對低脂肪高蛋白質(zhì)肉質(zhì)的需求也逐漸提升。目前，PPARo的研究主要集中在嚙齒動物和人體上，并且在家禽中也有PPARc的報道，但是沒有關于靜寧雞PPARa的報道。因此，本研究以靜寧雞為研究對象，利用PCR獲得PPARa基因序列，然后利用生物信息學手段對該基因的結(jié)構(gòu)及功能進行分析和預測，以期為進一步研究靜寧雞脂質(zhì)代謝中PPARa的調(diào)控作用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

6月齡靜寧雞購于靜寧綠洲生態(tài)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司。

1.2 試劑

Reverse Transcriptase M-MLV（RNase H-）等反轉(zhuǎn)錄相關試劑、TaKaRaExTaq等PCR反應相關試劑、pMD18-T Vector均購自寶生物工程（大連）有限公司，Trizol購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司，氨芐青霉素購自北京索萊寶科技有限公司，Axyen膠回收試劑盒購自Axyen公司，BL2感受態(tài)細胞購于上海碧云天生物技術有限公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 組織總RNA的提取和eDNA合成利用Trizol法提取靜寧雞腎臟的總RNA，以ddH2O溶解總RNA，-80°C保存?zhèn)溆?參考RTase M-MLV（RNaseH-）反轉(zhuǎn)錄操作步驟合成eDNA，-20°C保存?zhèn)溆谩?.3.2引物的設計及PPARa基因的克隆根據(jù)NCBI公布的原雞的PPARa基因的CDS序列（NM_001001464），用Primer 5.0軟件進行引物設計。所設計的引物序列為：PPARa-F：5'-AGTGACCGCTC-TACTTGACCAA-3';PPARo-R：5'-CTCCGAAC-CGAGTGAACAGC-3 '，引物由寶生物工程（大連）有限公司合成。

以合成的eDNA第一鏈為模板，進行PCR擴增。反應體系為：TaKaRa Ex Taq （5 U/μl）0.5 μl，10xExTaq Buffer（mg2+ Plus）（20 mmol/L）2.5 μl，dNTPMixture（2.5 mmol/L）2.0 μl，引物PPARa-F（10μmol/L）0.5 μl，引物PPARa-R（10 μmol/L）0.5 μl，eDNA2.0μl，添加滅菌水至25.0μl。擴增反應程序為：95°C預變性5 min;95°C變性3 min，62.3°C退火45s，72°C延伸80s，35個循環(huán)，最后在72°C條件下進行10 min的延伸，4°C保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切膠回收目的片段。與pMD18-T Vector載體16°C恒溫連接0.5 h后，利用熱激法轉(zhuǎn)BL2感受態(tài)細胞，挑出陽性克隆進行培養(yǎng)，然后提取質(zhì)粒進行PCR驗證，并將質(zhì)粒送至寶生物工程（大連）有限公司進行測序。測序結(jié)果用DNAStar、MegAlign和Editseq軟件比對和拼接獲得靜寧雞PPARa基因CDS序列。

1.3.3 PPARa基因的生物信息學分析采用在線軟件Protparam（http：//www.expasy.ch/tools/prot-param.html）預測PPAR蛋白的理化性質(zhì)，采用Protscal（http：//www.expasy.ch/tools/pr-otscale.ht-ml）預測PPARa蛋白的疏水性，采用SignalP4.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）預測PPARa蛋白的信號肽，采用NetNGlye 1.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）預測PPARa蛋白的N-糖基化位點，采用NetOGlye 4.0Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetOGlyc/）預測PPARa蛋白的0-糖基化位點，采用NetPhos-3.1（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/）預測PPARo蛋白的磷酸化位點，采用TMpred（http：//ch.embnet.org/software/TMPRED-form.html）預測PPARa蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，采用PSORT II Prediction（http：//psort.hge.jp/form.html）預測PPARo蛋白的亞細胞定位，采用APSSP2（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_gor4.html）預測PPAR&蛋白二級結(jié)構(gòu)，采用SWISS-MODEL（http：//swissmodel.Expasy.org/）預測PPARa蛋白三級結(jié)構(gòu)，采用HMMER（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/hmmer/search/jackhm-mer）預測PPARa蛋白保守結(jié)構(gòu)，采用NCBI中BLAST進行PPARa蛋白同源性分析，最后，通過CLUSTALX對PPARo氨基酸序列進行比對，然后采用MEGA 5.10軟件基于NJ（Neighbor-joining）法構(gòu)建PPARa蛋白的系統(tǒng)進化樹，距離校正使用泊松模型，計算時將空位完全刪除，自舉分析通過1000次循環(huán)實現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 靜寧雞PPARa基因的克隆

采用TRIzol法對靜寧雞腎臟的總RNA進行提取，并進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果表明，總RNA條帶清晰，無拖尾，整體質(zhì)量較高，符合基因克隆的要求。目的基因的PCR擴增產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，在1500 bp左右有明亮的條帶，如圖1所示。分析測序結(jié)果表明PPARa基因CDS區(qū)的24 bp處是起始密碼子ATG，1430 bp處是終止密碼子TAA。該序列BLAST的結(jié)果顯示目的片段與NCBI上登錄的原雞PPARa基因的CDS序列（NM_001001464）99%相同，說明靜寧雞PPARa基因已被成功克隆出來。

2.2 靜寧雞PPARa蛋白的生物信息學分析

2.2.1 PPARx蛋白的氨基酸序列及理化性質(zhì)分析通過在線軟件Protparam分析PPARo蛋白的理化性質(zhì)，結(jié)果表明，PPARo的CDS區(qū)包含1407個核苷酸，編碼468個氨基酸，氨基酸組成見圖2，分子量為52300，理論等電點為5.85，含強酸性氨基（Asp+Glu）61個，強堿性氨基酸（Arg+Lys）52個，PPARa蛋白的分子式為C2301H3661 N6250gS3z2，組成的原子總數(shù)為7317個。預測該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為44.20，表明該蛋白質(zhì)為一個不穩(wěn)定蛋白質(zhì)。在哺乳動物細胞中的半衰期為30 h，在酵母中的半衰期大于20 h，在細菌中的半衰期大于10 h。

2.2.2 靜寧雞PPARa蛋白的疏水性和跨膜結(jié)構(gòu)域分析利用在線軟件Protscal預測靜寧雞PPARa蛋白氨基酸序列的親水性/疏水性，結(jié)果如圖3所示，第381位賴氨酸（Lys）疏水性最強（+3.156），第150位的丙氨酸（Ala）親水性最強（-3.078），Z值為-0.225，表明PPARo蛋白為親水性蛋白質(zhì)。使用TMpred跨膜結(jié)構(gòu)預測服務器對PPARa蛋白的氨基酸序列進行預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PPARo蛋白不存在跨膜區(qū)域，結(jié)果如圖4所示。

2.2.3 靜寧雞PPARa蛋白的信號肽和糖基化位點分析采用在線軟件SignalP 4.1 Server進行信號肽預測，結(jié)果顯示，PPARa蛋白不包含信號肽。使用NetNGlyc1.0 Server和NetOGlyc 4.0 Server分別預測PPARa蛋白N-糖基化位點和0-糖基化位點，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PPARo蛋白沒有N-糖基化位點，但是在56、66、69、71、73、75、77、79、80、85、89、93、95、167、179、233處發(fā)現(xiàn)了O-糖基化位點。

2.2.4 靜寧雞PPARa蛋白磷酸化位點分析利用在線軟件NetPhos-3.1 Server預測PPARa蛋白磷酸化位點，結(jié)果顯示，有25個絲氨酸（Ser）磷酸化位點，分別在21、24、38、40、45、50、56、63、66、73、76、77、79、80、89、93、95、110、163、179、198、293、323、346和452位;有12個蘇氨酸（Thr）磷酸化位點，分別在12、71、129、246、253、279、283、285、288、307、438和450位;有6個酪氨酸（Tyr）磷酸化位點，分別在9、194、214、314.464和468位，結(jié)果如圖5所示。

2.2.5 靜寧雞PPARa蛋白的亞細胞定位預測利用PsortlIProtein Sorting Prediction軟件對靜寧雞PPARa蛋白進行亞細胞定位預測，結(jié)果顯示，靜寧雞PPARa蛋白主要定位于細胞質(zhì)（47.8%），其他定位于細胞核（26.1%）、線粒體（17.4%）、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（4.3%）和高爾基體（4.3%）。由此預測靜寧雞PPARa蛋白可能為胞質(zhì)蛋白。

2.2.6 靜寧雞PPARa蛋白保守結(jié)構(gòu)域預測利用在線軟件HMMER預測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)靜寧雞PPARa蛋白在第100～168個氨基酸之間有1個核激素受體中的C4鋅指結(jié)構(gòu)（ZnF_C4結(jié)構(gòu)域），在第264～449個氨基酸之間有1個核激素受體配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（HOLI結(jié)構(gòu)域）。

2.2.7 靜寧雞PPARa蛋白二級結(jié)構(gòu)預測使用在線軟件NPSA對靜寧雞PPARa蛋白二級結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果如圖6所示，176個氨基酸參與ax-螺旋，占比為37.61%;83個氨基酸參與β_折疊，占比為17.74%;209個氨基酸參與無規(guī)則卷曲，占比為44.66%。由此說明，在靜寧雞PPARa蛋白二級結(jié)構(gòu)中，a-螺旋和無規(guī)則卷曲是主要的結(jié)構(gòu)形式。

2.2.8 靜寧雞PPARa蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測利用在線軟件SWISS-MODEL的自動建模功能，對靜寧雞PPARx蛋白三級結(jié)構(gòu)進行預測，三維模型如圖7所示。用于建立該模型的氨基酸殘基范圍為101～419位，該模型以3e00.1.B（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma）蛋白為模板，序列同源性為64.39%。應用NCBI網(wǎng)站中Conserved domainsearch工具分析，證明PPARa蛋白是過氧化物酶體增殖劑激活受體。

2.2.9 靜寧雞PPARa多序列比對分析及系統(tǒng)進化樹對靜寧雞PPARa核苷酸序列和其他從NCBI下載的PPARa 核苷酸序列進行多序列比對。經(jīng)BLAST在線分析，與靜寧雞PPARa核苷酸序列同源性高達99%的為原雞（Gallus gallus，NM001001464.1），同源性高達98%的分別為火雞（Meleagris gallo-pavo，XM_010716016.2）和吐綬雞（Numida melea-gris，XM_0213932-56.1），同源性高達97%的為鵪鶉（Coturnix japonica，XM_015870635.1），同源性高達96%的分別為綠頭鴨（Anasplatyrhynchos，XM_021273687.1）、阿德利企鵝（Pygoscelis adeliae，XM009323646.1）、卷羽鵜鶘（Pelecanus crispus，XM.009484690.1）、帝企鵝（Aptenodytes forsteri，XM_009283535.2）、倉鶚（Tyto alba，XM_009965270.1）、鴻雁（Anser cygnoides，KJ010765.1）、灰雁（Anseranser，AF481797.1）、白尾鷚（Phaethon lepturus，XM_010290610.1）、白鷺（Egretta gaettar，XM_009648790.1）、灰冠鶴（Balearica regulorum gibbericeps，XM_010300944.1）、朱鸚（Nipponia Nippon，XM_009465045.1）和加拿大金雕（Aquila chrysaetos Cana-densis，XM_011583046.1）。靜寧雞與原雞相比，PPARa基因編碼的氨基酸在98（亮氨酸/谷氨酸）和186（脯氨酸/亮氨酸）處發(fā)生突變，結(jié)果如圖8所示。利用MEGA6.10軟件構(gòu)建NJ進化樹，如圖9所示。分析結(jié)果表明靜寧雞與原雞，火雞，吐綬雞和鵪鶉的PPARa基因親緣關系較近，其中與原雞的親緣關系最近。

3 討論

PPARx是脂肪酸氧化酶基因的主要轉(zhuǎn)錄調(diào)控子，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝平衡中起主要作用”。在本研究中，基于NCBI公布的原雞的PPARa基因的CDS序列，通過Primer 5.0軟件設計特異性引物，從靜寧雞腎臟中成功克隆了該基因的全長CDS序列。該CDS序列全長1407 bp，所編碼的蛋白質(zhì)包含468個氨基酸。其分子量為52300，理論等電點為5.85，分子式為C2301H3661N625O698S32，組成的原子總數(shù)為7317個。馬云等研究發(fā)現(xiàn)鴨PPARa基因的cDNA全長1430 bp[13]，最長開放閱讀框為1407 bp，共編碼468個氨基酸[12]孟和等研究發(fā)現(xiàn)鵝PPARa基因的cDNA序列長度為1407 bp[13]林森等從藏雞肝臟組織中成功克隆得到PPARa基因，該基因編碼區(qū)大小為1404 bp，編碼468個氨基酸[14]。因此本研究結(jié)果與查閱的文獻結(jié)果一致，說明已經(jīng)成功克隆出靜寧雞PPARa基因。

磷酸化是蛋白質(zhì)最常見和最重要的一種蛋白翻譯后的修飾[15]，并在許多生物反應中通過磷酸基團的變化，即添加或去除，發(fā)揮著“開關”作用[16]。糖基化具有調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)功能的作用，例如改善凝膠性和水合性等[17]。本研究中，靜寧雞PPARa蛋白為親水性蛋白質(zhì)，且不存在跨膜區(qū)域，不包含信號肽，沒有N-糖基化位點，但存在16個0-糖基化位點，存在25個絲氨酸（Ser）磷酸化位點、12個蘇氨酸（Thr）磷酸化位點和6個酪氨酸（Tyr）磷酸化位點，靜寧雞PPARa蛋白主要位于細胞質(zhì)中。據(jù)報道，PPARa通過鋅指結(jié)構(gòu)域與視黃酸受體形成異源二聚體，然后與配體結(jié)合區(qū)（HOLI）連接。配體激活后的異源二聚體與靶基因啟動子上的PPARa反應元件結(jié)合以激活靶基因活化，調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄表達，然后調(diào)節(jié)脂類的氧化[18-19]。本研究中，利用在線分析軟件預測結(jié)果顯示靜寧雞PPARx蛋白在第100～168個氨基酸之間有1個ZnF_C4結(jié)構(gòu)域，在第264～449個氨基酸之間有1個HOLI結(jié)構(gòu)域，與查閱的文獻結(jié)果[4]一致。

在靜寧雞PPARo蛋白的二級和三級結(jié)構(gòu)中，a-螺旋和無規(guī)則卷曲是其主要的結(jié)構(gòu)形式，β-折疊占比相對較少。多系列比對分析及系統(tǒng)進化樹結(jié)果表明，靜寧雞PPARa基因與原雞，火雞，吐綬雞和鵪鶉的PPARa基因親緣關系較近，其中與原雞的親緣關系最近。

家禽PPARo基因調(diào)節(jié)脂肪代謝，影響家禽脂肪的沉積，從而影響腹脂率和胴體品質(zhì)[2]，因此，靜寧雞PPARo基因的成功克隆和功能預測為進一步研究PPARo基因在靜寧雞脂代謝中的作用和揭示PPARo基因功能提供了基礎，為低脂高質(zhì)量雞育種提供基礎研究資料。

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