橡子粉發(fā)酵檸檬酸

朱莉莉　李林強(qiáng)　張寶善　裴亞利　周琦　付軍偉　顏統(tǒng)晶

摘要：橡子含較多單寧等澀味物質(zhì)，導(dǎo)致其淀粉利用率低。本研究通過測定脫單寧、酶解及發(fā)酵過程中的關(guān)鍵指標(biāo)，探究70%乙醇對單寧脫除效果的影響。采用數(shù)碼生物顯微鏡及酸堿滴定法比較4種常見黑曲霉在發(fā)酵液中的形態(tài)及發(fā)酵產(chǎn)酸量。結(jié)果表明，70%乙醇脫單寧處理會顯著促進(jìn)橡子粉的液化和糖化作用，發(fā)液中黑曲霉的生物量和產(chǎn)酸量顯著提高（P<0.05）;黑曲霉SIIMM288在33C下的檸檬酸產(chǎn)量為37.30g/L，顯著高于其他3株菌（P<0.05），該菌在發(fā)酵液中以菌絲球形態(tài)分布，菌絲無色透明、短而粗分支少、稀疏著生。說明，脫單寧處理會促進(jìn)橡子粉的檸檬酸發(fā)酵，黑曲霉SIIMM288為橡子粉發(fā)酵檸檬酸的優(yōu)勢菌種，最佳發(fā)酵溫度為33C。

關(guān)鍵詞：橡子粉;脫單寧;檸檬酸;發(fā)酵;黑曲霉

中圖分類號：S789.7

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1000-4440（2019）02-0445-08

橡子是殼斗科櫟屬植物的種子[1]。中國有豐富的橡子資源，其種植面積達(dá)2.5x10°hm，橡子年產(chǎn)量約1.0x10t，主要分布在云南、陜西、湖南和蒙古等地，其中陜西省橡子年產(chǎn)量約占全國的1/3，主要集中在秦巴山區(qū)[2-3]。橡子富含淀粉，經(jīng)檢測脫殼的橡子仁含淀粉達(dá)50.00%～70.00%、可溶性糖2.00%～8.00%、蛋白質(zhì)1.17%～8.72%、單寧0.26%～17.74%、油脂1.04%～6.86%、粗纖維1.13%～5.89%、灰分1.30%～3.40%[4]。橡子雖然含有豐富的淀粉、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，但其加工利用率卻很低，原因是橡子中含有較多的單寧等抗?fàn)I養(yǎng)因子，并有很強(qiáng)的澀味，導(dǎo)致直接食用或加工受到限制[5]。因橡子淀粉含量高，有些食品加工者將橡子提取的粗淀粉加工成涼粉、面條，也有被用作飼料的，但并不普及，利用率很低，絕大多數(shù)成熟后從樹上墜落于地面腐爛，造成資源的大量浪費(fèi)。

檸檬酸作為一種最常用的添加劑，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品、化工等領(lǐng)域[6-8]，其產(chǎn)量和消費(fèi)量僅次于酒精，為世界上第二大發(fā)酵產(chǎn)品，且全球市場需求量以平均每年5%的速度增長[9]。工業(yè)上主要采用發(fā)酵法制備檸檬酸，常用的微生物有酵母和黑曲霉。酵母發(fā)酵過程中會產(chǎn)生較多的異檸檬酸，造成后續(xù)檸檬酸分離純化困難;而黑曲霉具有酶系豐富，發(fā)酵效率高、副產(chǎn)物少等優(yōu)勢，因此檸檬酸工業(yè)上多采用黑曲霉為發(fā)酵菌種[10-11]。工業(yè)上用于檸檬酸發(fā)酵的糖質(zhì)原料中，相比精制糖，淀粉質(zhì)原料因其經(jīng)濟(jì)性更具有競爭力。隨著檸檬酸需求量的增加，市場競爭壓力增大，尋找新型廉價(jià)的檸檬酸發(fā)酵原料是目前國際上普遍關(guān)注和研究的問題之一。

本研究以橡子為發(fā)酵原料，結(jié)合檸檬酸工業(yè)化生產(chǎn)工藝，主要研究橡子粉單寧脫除、橡子淀粉液化糖化、菌種篩選及發(fā)酵條件等關(guān)鍵技術(shù)參數(shù)和工藝過程。這對提高橡子資源利用率和改進(jìn)檸檬酸發(fā)酵技術(shù)有很好的指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 主要試劑-淀粉酶、馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）由北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，糖化酶由江蘇常州凱喬生物化學(xué)有限公司生產(chǎn)，無水乙醇、酒石酸鉀鈉、正丁醇、醋酸、溴酚藍(lán)等均為分析純。

1.1.2 發(fā)酵菌種黑曲霉SIIM M288（Aspergillus ni-ger SIIM M288）購自，上海市工業(yè)微生物研究所，黑曲霉CICC 2716（Aspergillus niger CICC 2716）和黑曲霉CICC 2160（Aspergillus niger CICC 2160）來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，黑曲霉QL-1（Asperillusniger QL-1）由齊魯大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.3 主要儀器可見分光光度計(jì)（722型）購自上海光譜儀器有限公司，臺式恒溫振蕩器購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司，掃描電子顯微鏡（S-3400N）購自日本日立公司，數(shù)碼生物顯微鏡ME21（MS-HOT）]購自奧林巴斯公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 橡子粉的制備及預(yù)處理成熟橡子采自秦嶺西麓，自然曬干，去殼后粉碎備用。參照文獻(xiàn)[12]選擇70%乙醇水溶液進(jìn)行脫單寧處理，按粉質(zhì)量和乙醇液體積比1：5加入，磁力攪拌作用下進(jìn)行單寧脫除，脫單寧后的橡子粉在1000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，除去上清液，自然晾干后備用。

1.2.2 菌種活化與孢子懸液的制備將保藏菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基，在霉菌培養(yǎng)箱28C活化5d，然后轉(zhuǎn)接于PDA平板固體培養(yǎng)基中，相同溫度條件下培養(yǎng)6～7d，用適量無菌水將孢子洗下，振蕩，制成均勻的孢子懸液，孢子數(shù)達(dá)每1 ml 9.60x10～1.33x10個(gè)。

1.2.3 橡子粉的糊化和液化對不同脫單寧時(shí)間（0 min、30 min、60 min、90 min、120 min）的橡子淀粉進(jìn)行糊化及液化。橡子粉與水按質(zhì)量比1：5進(jìn)行混合，在95C加熱糊化30 min，冷卻至60C，用氫氧化鈣調(diào)節(jié)pH至6.0～6.5，按37U/g加入-淀粉酶，酶解淀粉，用碘化鉀試劑檢測液化液的顏色，測定液化終了時(shí)的糖含量。

1.2.4 橡子粉的糖化將橡子粉液化液用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.2～4.5，調(diào)整溫度至60C，按250U/g加入糖化酶，在攪動狀態(tài)下保溫糖化10h，間隔一定時(shí)間測定糖化液的糖含量。

1.2.5 檸檬酸發(fā)酵取橡子酶解液于250 ml三角瓶中，105C下維持10 min進(jìn)行殺菌，冷卻后，接入1 ml孢子懸液，置于恒溫振蕩器中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度33C，搖床轉(zhuǎn)速200r/min，連續(xù)培養(yǎng)72h，每隔12h取樣測定還原糖及檸檬酸含量。

1.2.6 橡子粉糖化對檸檬酸發(fā)酵的影響取經(jīng)過60 min脫單寧的橡子粉，糊化后，1份用-淀粉酶進(jìn)行液化處理，另1份先經(jīng)-淀粉酶水解，再用糖化酶進(jìn)行糖化處理，將分別得到的液化液和糖化液接種1 ml孢子數(shù)達(dá)9.60x107～1.33x108個(gè)的黑曲霉SIIM M288菌懸液，其他發(fā)酵條件同方法1.2.5，進(jìn)行橡子粉糖化對檸檬酸發(fā)酵影響的研究。

1.3 測定方法

1.3.1 單寧測定采用酒石酸亞鐵法[13]，并稍作修改。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：吸取0.2 ml、0.4 ml、0.6 ml、0.8 ml和1.0 ml單寧酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/ml）于10ml容量瓶中，用蒸餾水補(bǔ)至1.0 ml，加2.0 ml酒石酸亞鐵溶液，用pH7.5磷酸鹽緩沖液定容，于540nm處測吸光值，以單寧酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得回歸方程（Y=10.4670x+0.0121，R2=0.997）。

1.3.2 還原糖及總糖含量測定參照文獻(xiàn)[14]。準(zhǔn)確吸取0.25 ml 、0.50 ml、0.75 ml、1.00 ml、1.25ml和1.50 ml葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 mg/ml）于試管中，用蒸餾水補(bǔ)至1.50 ml，加入1.50 ml DNS試劑和1.50 ml蒸餾水，沸水浴5 min，冷水冷卻，定容至25.00ml，于550nm處測吸光值，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得回歸方程：Y=9.1919x+0.0034，R2=0.992。

還原糖和總糖含量測定參照文獻(xiàn)[15]，并稍作修改。取10.0 ml發(fā)酵液，5000 r/ min離心10 min，取出上清液，DNS比色法測定還原糖含量。準(zhǔn)確量取0.5 ml上清液，加入0.4 ml 濃硫酸，沸水浴5min，在冰水中迅速冷卻，用40% NaOH中和，調(diào)節(jié)pH至7.0～9.0，定容至100.0 ml，采用DNS比色法測定總糖含量。

1.3.3 檸檬酸測定和鑒定采用酸堿滴定法，用0.1429 mol/L氫氧化鈉溶液進(jìn)行滴定[16]，檸檬酸含量以發(fā)酵液中總酸計(jì)算。用紙層析色譜法進(jìn)行檸檬酸的鑒定[17]。展開劑：正丁醇：醋酸：水=12：3：5（體積比）;顯色劑：400mg溴酚藍(lán)溶于1L體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.5。

1.3.4 生物量測定生物量的測定參照文獻(xiàn)[18]。

1.3.5 橡子淀粉的超微結(jié)構(gòu)觀察將不同脫單寧時(shí)間的橡子粉用掃描電子顯微鏡觀測并拍攝顆粒形態(tài)。

1.3.6 發(fā)酵液菌絲形態(tài)顯微鏡觀察挑取橡子發(fā)酵液中的黑曲霉，用生物顯微鏡在放大倍數(shù)為400倍下直接進(jìn)行形態(tài)觀察。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以平均值x標(biāo)準(zhǔn)差（x+SD）的形式表示，采用LSD法檢驗(yàn)組間差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫單寧對橡子粉液化的影響

用乙醇水溶液脫除橡子單寧，處理時(shí)間不同，單寧脫除量不同。脫單寧時(shí)間對橡子粉成分及液化影響結(jié)果見表1。隨脫單寧時(shí)間的延長，單寧含量下降，同時(shí)蛋白質(zhì)含量也在下降。脫除時(shí)間為60min，與對照相比，單寧含量降低了56.31%;脫單寧時(shí)間為120min，單寧含量下降了67.23%，蛋白質(zhì)含量由29.31 mg/g降為24.31 mg/g。說明70%乙醇對橡子粉中單寧有良好的脫除效果，但同時(shí)橡子粉中蛋白質(zhì)會有一定損失。

從表1可以看出，隨單寧脫除量的增加，-淀粉酶完全液化橡子淀粉的時(shí)間縮短，液化液中的總糖和還原糖也有所變化，說明單寧對橡子淀粉的酶法液化有一定抑制作用。當(dāng)脫除時(shí)間為60 min時(shí)，橡子粉中的單寧含量下降為5.64 mg/g，淀粉液化完全的時(shí)間縮短為40 min，總糖含量提高至99.02g/L，還原糖含量上升為63.77 g/L，其總糖含量顯著高于原料（P<0.05），但和脫除時(shí)間為120 min的相比，總糖含量無明顯差異（P>0.05），還原糖含量顯著高于原料和脫單寧時(shí)間為120 min橡子粉（P<0.05）。說明橡子粉在液化時(shí)，較高的單寧含量會影響淀粉液化和還原糖的生成，當(dāng)單寧含量減低到一定值時(shí)，不再成為液化的限制因素。因此，橡子粉發(fā)酵檸檬酸時(shí)脫單寧不必脫除徹底。

2.2 脫單寧對橡子粉糖化的影響

在經(jīng)不同時(shí)間脫單寧的橡子粉液化液中加入糖化酶，進(jìn)行糖化處理，觀察單寧對橡子粉糖化的影響，結(jié)果見圖1。隨糖化時(shí)間的延長，還原糖含量不斷增加，6h后趨于穩(wěn)定;當(dāng)糖化時(shí)間相同時(shí)，經(jīng)過不同時(shí)間脫單寧處理的橡子粉，糖化時(shí)還原糖含量也不盡相同，脫單寧時(shí)間超過60min，還原糖含量明顯高于未處理和處理30 min的（P<0.05）。同時(shí)糖化6 h，脫單寧時(shí)間120 min的還原糖含量為92.42g/L，顯著低于脫單寧時(shí)間60min和90 min的（P<0.05），其原因可能與脫單寧時(shí)淀粉中蛋白質(zhì)變化有關(guān)[12]。

2.3 脫單寧對橡子淀粉顆粒的影響

單寧會抑制橡子粉的酶解，但當(dāng)其不再是限制因素時(shí)，隨脫除時(shí)間的繼續(xù)延長，反而酶解效率有所降低，這可能與橡子淀粉及蛋白質(zhì)的變化有關(guān)。不同脫除時(shí)間橡子粉的形貌見圖2，橡子淀粉顆粒主要是球形或卵形，這與Stevenson等[19]的報(bào)道一致，而其顆粒直徑與報(bào)道的3～17 μm有一定差異，這可能與橡子品種有關(guān)。橡子淀粉被包裹在膠狀物質(zhì)中并通過其相互連接，該物質(zhì)可能是蛋白質(zhì);經(jīng)過脫單寧處理的橡子淀粉與膠狀物質(zhì)粘連程度不大，顆粒間的連接較疏松甚至分離，這在一定程度上使橡子粉更易被酶水解。

2.4 脫單寧對黑曲霉生長的影響

單寧會與蛋白質(zhì)及其他氮源結(jié)合，螯合金屬離子，影響橡子粉發(fā)酵液中黑曲霉生長。在不同脫除時(shí)間的橡子粉液化液中接入黑曲霉孢子懸浮液，培養(yǎng)72h后的生物量見圖3，脫除時(shí)間為60min的生物量是18.63 g/L，顯著高于原料和脫除時(shí)間30min、120min的（P<0.05），Chao等[20]報(bào)道，當(dāng)單寧質(zhì)量濃度低于1 g/L時(shí)，單寧對菌體生長就會失去抑制作用。

2.5 脫單寧對檸檬酸發(fā)酵的影響

圖4結(jié)果顯示，在0～12 h，黑曲霉孢子處于休眠調(diào)整和萌發(fā)并形成營養(yǎng)菌絲期，檸檬酸幾乎沒有積累。發(fā)酵液還原糖質(zhì)量濃度在0～24 h有上升趨勢，說明黑曲霉分泌的糖化酶將發(fā)酵液中一些高分子糖水解為還原糖;在24～60 h還原糖急劇下降，檸檬酸大量積累;當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過60 h，檸檬酸質(zhì)量濃度趨于穩(wěn)定，可能由于此時(shí)發(fā)酵液中還原糖質(zhì)量濃度過低。脫單寧時(shí)間601min的檸檬酸產(chǎn)量是37.85 g/L，顯著高于原料和脫單寧時(shí)間30 min的（P<0.05），說明單寧會抑制檸檬酸積累。

2.6 橡子粉發(fā)酵產(chǎn)物

在檸檬酸發(fā)酵過程中，由于烏頭酸酶、a-酮戊二酸脫氫酶和異檸檬酸脫氫酶的活性受到抑制，使得檸檬酸開始積累[21]，發(fā)酵液中除大量檸檬酸外，還有草酸、烏頭酸等雜酸。用紙層析色譜對發(fā)酵液中的有機(jī)酸進(jìn)行鑒別，結(jié)果見圖5。黑曲霉SIIMM288發(fā)酵橡子粉液化液，產(chǎn)物主要為檸檬酸，其次還檢出少量草酸，其他酸未檢測到。

2.7 橡子粉糖化對檸檬酸發(fā)酵的影響

由于黑曲霉可以分泌糖化酶，將發(fā)酵液中高分子糖水解為可發(fā)酵性糖，因此可以利用黑曲霉進(jìn)行同步糖化發(fā)酵。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黑曲霉SIIM M288發(fā)酵橡子粉液化液的檸檬酸產(chǎn)量為37.85 g/L，而發(fā)酵糖化液的檸檬酸產(chǎn)量為39.62 g/L，這可能因?yàn)楹谇狗置诘奶腔覆蛔慊蛎富钚缘汀ｋm然橡子粉糖化液的檸檬酸產(chǎn)量略高于液化液，但糖化會大大增加時(shí)間及設(shè)備成本，因此在實(shí)際生產(chǎn)中不進(jìn)行糖化處理，直接將黑曲霉接種于液化液中進(jìn)行發(fā)酵。

2.8 橡子粉發(fā)酵檸檬酸菌種的選擇

黑曲霉菌種對橡子粉發(fā)酵有很大影響，不同菌株，其生長條件各異，產(chǎn)酸量也不盡相同。試驗(yàn)選用檸檬酸生產(chǎn)常用的4株菌，分別接種于橡子粉液化液中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，篩選最佳菌株。菌株在發(fā)酵液中的形態(tài)見圖6，產(chǎn)酸量見圖7。

由圖6可見，黑曲霉SIIM M288在發(fā)酵液中以菌絲球形態(tài)分布，菌落呈不規(guī)則皺褶，中央隆起，菌絲無色透明，短而粗分支少、稀疏著生，這種形態(tài)的菌有利于產(chǎn)酸，且有研究報(bào)道，菌絲球直徑越小，對產(chǎn)酸越有利[8，22];CICC 2716在發(fā)酵液中產(chǎn)生大量菌絲，分支較多，而CICC 2160和QL-1的菌絲遠(yuǎn)比CICC 2716致密，這對產(chǎn)酸極其不利，過密的菌絲會限制溶氧及營養(yǎng)與細(xì)胞之間的傳輸速率。黑曲霉CICC 2716發(fā)酵的產(chǎn)酸量顯著高于CICC 2160和QL-1，同時(shí)顯著低于SIIM M288（P<0.05）。結(jié)果表明菌絲稀疏、分支少、短而粗有利于產(chǎn)酸，而菌絲致密，對產(chǎn)酸極其不利。從圖7可知，黑曲霉SIIMM288在33C產(chǎn)酸量達(dá)37.30 g/L，顯著高于其他菌株（P<0.05）。說明用橡子粉發(fā)酵檸檬酸時(shí)黑曲霉SIIM M288是優(yōu)勢菌種。

2.9 黑曲霉SIIM M288發(fā)酵檸檬酸的溫度

發(fā)酵溫度是影響檸檬酸產(chǎn)生的關(guān)鍵因素之一，將黑曲霉SIIM M288接種于脫單寧時(shí)間為60min的橡子粉液化液中，結(jié)果見圖8。黑曲霉SIIM M288在339C的產(chǎn)酸量為37.30g/L，顯著高于其他發(fā)酵溫度（P<0.05）。說明黑曲霉SIIM M288對發(fā)酵溫度比較敏感，過高或過低均會較大程度地抑制檸檬酸的積累。

3 討論

3.1 脫單寧對橡子粉液化、糖化及發(fā)酵的影響

橡子單寧含量豐富，其與蛋白質(zhì)結(jié)合，抑制黑曲霉分泌糖化酶和其他與代謝有關(guān)的酶的生物活性[23]本研究結(jié)果表明，單寧會抑制橡子粉的酶解及黑曲霉產(chǎn)酸能力。當(dāng)單寧不再是限制因素時(shí)，發(fā)酵液中其他營養(yǎng)物質(zhì)的變化對橡子粉的酶解及發(fā)酵產(chǎn)酸量均有一定影響，這是由于處理時(shí)間過長會影響淀粉的平均分子質(zhì)量，蛋白質(zhì)的變化會影響淀粉凝膠的酶解能力[12，24];因?yàn)榈磁c蛋白質(zhì)、核酸、維生素等的合成密切相關(guān)，因此氮源不足會影響菌體生長，降低檸檬酸積累[25]

3.2 糖化對橡子粉檸檬酸發(fā)酵的影響

在檸檬酸工業(yè)化生產(chǎn)中，原料采用精制糖能夠獲得較高產(chǎn)量，但生產(chǎn)成本高，相比而言，淀粉質(zhì)原料更具有競爭力，但淀粉不能被直接利用，需經(jīng)液化、糖化等工藝，才能獲得可發(fā)酵性糖[26，27]。利用黑曲霉進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，基于其自身的糖化能力，可以將液化處理的淀粉質(zhì)原料進(jìn)行同步糖化發(fā)酵[10-11]。本研究結(jié)果表明，橡子粉液化液中低分子量的糊精及寡糖，可以被黑曲霉分泌的糖化酶水解成可發(fā)酵性糖，因此可以邊糖化邊發(fā)酵。淀粉質(zhì)原料同步糖化發(fā)酵的檸檬酸產(chǎn)量與淀粉質(zhì)原料糖化后再發(fā)酵的檸檬酸產(chǎn)量無明顯差異，還節(jié)省了時(shí)間及設(shè)備成本，因此在實(shí)際生產(chǎn)中可對淀粉質(zhì)原料不進(jìn)行糖化處理。

3.3 檸檬酸產(chǎn)量及發(fā)酵中雜酸的產(chǎn)生

本研究結(jié)果表明，黑曲霉發(fā)酵檸檬酸的產(chǎn)酸量與菌種有密切聯(lián)系，菌絲稀疏、分支少、短而粗有利于產(chǎn)酸，而過密的菌絲會限制溶氧以及營養(yǎng)與細(xì)胞之間的傳輸速率，對產(chǎn)酸極其不利，與Papagianni等[28]的研究結(jié)果一致。產(chǎn)酸量還受發(fā)酵液中營養(yǎng)成分及發(fā)酵條件的影響，因此需要對發(fā)酵液成分進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)還需控制溫度、溶氧及初始pH值等培養(yǎng)條件，以期獲得最高的檸檬酸產(chǎn)量[25，29-30]，本研究結(jié)果也表明溫度會顯著影響黑曲霉產(chǎn)酸。因此利用橡子粉進(jìn)行檸檬酸發(fā)酵，后期還應(yīng)對發(fā)酵液成分進(jìn)行優(yōu)化，補(bǔ)充對產(chǎn)酸有利的營養(yǎng)因素，還需要進(jìn)一步研究溫度、溶氧及初始pH值等培養(yǎng)條件對產(chǎn)酸的影響，以達(dá)到檸檬酸產(chǎn)量最大化，提高橡子資源利用率。

檸檬酸是三羧酸循環(huán)的中間代謝產(chǎn)物，在檸檬酸積累過程中，會產(chǎn)生一些雜酸。劉辰[16]報(bào)道誘變株A.niger Wml-016只產(chǎn)生草酸1個(gè)雜酸，與本研究結(jié)果一致。徐凱[31]報(bào)道含量最高的雜酸為草酸，還有一些其他雜酸，且隨著溫度的升高，雜酸含量有所上升，但上升幅度不大。代真真[32]通過HPLC檢測出發(fā)酵液中有草酸、順烏頭酸及反烏頭酸等雜酸，但雜酸的含量非常小。雜酸的存在一方面降低了轉(zhuǎn)化率，另一方面對檸檬酸的提取工藝不利，因此在生產(chǎn)中應(yīng)通過菌種的篩選或馴化及調(diào)控發(fā)酵條件來控制雜酸的產(chǎn)生。

過多單寧對橡子粉的酶解及發(fā)酵產(chǎn)酸均有抑制作用，當(dāng)單寧不再是限制因素時(shí)，發(fā)酵液中的營養(yǎng)物質(zhì)在一定程度上影響發(fā)酵產(chǎn)酸。由于黑曲霉在生長時(shí)會分泌糖化酶，可以同步糖化發(fā)酵檸檬酸。黑曲霉SIIMM288是橡子粉檸檬酸發(fā)酵的優(yōu)勢菌種，其在發(fā)酵液中以菌絲球形態(tài)分布，菌絲無色透明、短而粗、分支少、稀疏著生，發(fā)酵最佳溫度為33C，在發(fā)酵液中有少量草酸的產(chǎn)生。

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