哈薩克藥駱駝蓬草的質(zhì)量標準研究

許歡 江阿古麗·艾山 汪晶 李筱婧 陳斌 木拉提·克扎衣別克 黃一平

中圖分類號 R282;R917 文獻標志碼 A 文章編號 1001-0408（2019）20-2818-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.16

摘 要 目的：建立哈薩克藥駱駝蓬草藥材的質(zhì)量標準。方法：以新疆哈薩克地區(qū)采集的10批駱駝蓬草藥材為研究對象，考察其性狀;采用薄層色譜（TLC）法對藥材中駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿進行定性鑒別;采用2015版《中國藥典》（四部）相關(guān)方法檢查其水分、總灰分、酸不溶性灰分和醇浸出物含量;采用高效液相色譜（HPLC）法測定藥材中駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的含量，色譜柱為X-bridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為乙腈-醋酸銨緩沖液（冰醋酸調(diào)節(jié)pH至6），梯度洗脫，檢測波長為267 nm，柱溫為25 ℃，流速為1 mL/min，進樣量為5 μL。結(jié)果：TLC法鑒別結(jié)果顯示，10批藥材在駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿對照品相同位置處均顯示清晰斑點;水分、總灰分、酸不溶性灰分分別不得高于12%、22%、2%，醇浸出物不得低于16%。HPLC法考察結(jié)果顯示，駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿分別在15.22～301.40、15.09～301.80 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，精密度、重復性、穩(wěn)定性試驗的RSD均小于4%，平均回收率分別為100.22%、100.94%（RSD均小于2%）;含量測定結(jié)果顯示，該藥材總生物堿含量（以駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿合計）不得少于6.5 mg/g。結(jié)論：本研究在原標準基礎(chǔ)上增加了檢查項，建立了TLC法鑒別駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬和HPLC法測定兩者含量的方法。所建質(zhì)量標準可用于全面控制新疆哈薩克地區(qū)駱駝蓬草藥材的質(zhì)量。

關(guān)鍵詞 駱駝蓬草;質(zhì)量標準;檢查;鑒別;駱駝蓬堿;去氫駱駝蓬堿;含量測定;薄層色譜法;高效液相色譜法

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the quality standard for Kazakhstan medicine Peganum harmala. METHODS： Ten batches of P. harmala collected in Xinjiang Kazakh region were selected as research objects to investigate their characteristics. Qualitative identification of harmaline and harmine was conducted by TLC. The contents of water， total ash， acid-insoluble ash and ethanol extract were tested according to Chinese Pharmacopoeia（2015 edition）. The contents of harmaline and harmine were determined by HPLC. The determination was performed on X-bridge C18 column（250 mm×4.6 mm，5 μm） with mobile phase consisted of acetonitrile-ammonium acetate buffer （adjusted to 6 with glacial acetic acid， gradient elution） at the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was set at 267 nm， and column temperature was 25 ℃. The sample size was 5 μL. RESULTS： TLC identification results showed that 10 batches of medicinal material showed clear spots at the same position as harmaline and harmine reference substances. Water， total ash， acid-insoluble ash should not be more than 12%，22%，2%， respectively; ethanol extract must not be less than 16%. HPLC results showed that the linear ranges of harmaline and harmine were 15.22-301.40，15.09-301.80 μg/mL; RSDs of precision， reproducibility and stability tests were all lower than 4%; average recoveries were 100.22% and 100.94%（all RSD<2%）. The determination results showed that the content of total alkaloids （harmaline and harmine） should not be less than 6.5 mg/g. CONCLUSIONS： Based on the original standard， test items are added in this study. TLC method is established to identify harmaline and harmine. HPLC method is established to determine their contents. Established quality standard can be used for comprehensive quality control of P. harmala from Xinjiang Kazakh region.

KEYWORDS Peganum harmala;Quality standard;Examina- tion; Identification; Harmaline; Harmine; Content determina- tion; TLC; HPLC

哈薩克族醫(yī)學是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分，其具有鮮明的民族特色、完整的理論體系及獨創(chuàng)的特色療法[1]。駱駝蓬草是哈薩克醫(yī)學常用藥材之一，其廣泛分布于新疆維吾爾地區(qū)，產(chǎn)量較大，為蒺藜科植物駱駝蓬（Peganumharmala L.）的干燥地上部分[2]，具有祛風止痛、通血調(diào)經(jīng)的功效;同時，其亦是伊犁哈薩克自治州中醫(yī)醫(yī)院傳統(tǒng)醫(yī)院制劑祛風阿德爾阿斯盤蜜膏中的主藥之一[3-4]。江蘇省中醫(yī)藥研究院與伊犁哈薩克自治州中醫(yī)醫(yī)院進行了戰(zhàn)略合作，對祛風阿德爾阿斯盤蜜膏進行了深度開發(fā)。在研發(fā)過程中發(fā)現(xiàn)，駱駝蓬草在哈薩克地區(qū)多以該植物地上部分入藥，而且缺乏相應(yīng)的藥材質(zhì)量標準，而現(xiàn)行《衛(wèi)生部藥品標準（維吾爾藥分冊）》收載的駱駝蓬草標準中僅對該藥材進行了性狀描述及顯微鑒別[2];此外，已有研究雖然對駱駝蓬不同部位的生物堿進行了深入研究[5-9]，但所建立的標準不適用于駱駝蓬草?；诖耍狙芯拷⒘诵陆_克地區(qū)駱駝蓬草藥材的質(zhì)量標準，分別從性狀、鑒別、檢查等方面進行全面控制，并重點對具有調(diào)節(jié)免疫、抗炎、抗腫瘤等功效的β-咔啉類生物堿[10-13]進行含量測定，同時進一步優(yōu)化含量測定方法，為該藥材質(zhì)量標準的完善提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

1100型高效液相色譜（HPLC）儀，含G1311A型四元泵、G1322A型在線真空脫氣機、G1313A型自動進樣器、G1316型柱恒溫箱、G1315B型二極管陣列檢測器、Agilent化學工作站（美國Agilent公司）;Milli-Q Intergral型水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）;HH-2型恒溫水浴鍋、SX2-8-16型馬弗爐（上海力辰邦西儀器科技有限公司）;KQ 500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;MS-105DU型電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;DHG-9055A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海吉眾儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

駱駝蓬堿對照品（批號：H1237，純度：以98%計，供含量測定用）、去氫駱駝蓬堿對照品（批號：H0001，純度：以98%計，供含量測定用）均購自東京化成工業(yè)株式會社;硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠，規(guī)格：10 cm×20 cm）;甲醇、乙腈均為色譜純（美國Tedia公司）;醋酸銨、三乙胺、磷酸、冰醋酸均為色譜純[阿拉丁試劑（上海）有限公司];乙酸乙酯、濃氨水、乙醇均為分析純（南京化學試劑有限公司）;水為超純水。

1.3 藥材

10批駱駝蓬草由伊犁哈薩克自治州中醫(yī)醫(yī)院提供，來源信息詳見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

本品全長15～35 cm;莖呈圓柱形，多分枝，直徑為2～4 mm;表面黃綠色，具縱條紋，略光滑，質(zhì)脆易折斷，斷面黃白色，中央髓部白色;葉互生，無柄或有短柄，葉片呈鹿角狀分歧，顏色為淺綠色至深綠色，有的老葉呈灰白色，常皺縮或卷曲，展平后呈二回羽狀全裂（鹿角狀分歧），裂片呈條形，且光滑無毛、厚革質(zhì);花瓣呈淡黃色至淺棕色，雄蕊15，幼果近球形;氣特異芳香，味微咸苦[14]。各批次駱駝蓬草藥材及其不同部位示例詳見圖1、圖2。

2.2 鑒別

參照2015年版《中國藥典》（四部）通則0502[2]，采用薄層色譜（TLC）法對藥材中的駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿進行鑒別。取駱駝蓬草細粉（過5號篩，下同）1 g，加入95%乙醇40 mL，100 ℃水浴回流30 min;濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇2 mL復溶，作為供試品溶液。另取駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿對照品，以甲醇制成質(zhì)量濃度均為0.05 mg/mL的混合對照品溶液。吸取上述供試品溶液和混合對照品溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-氨水（20 ∶ 5 ∶ 1，V/V/V）展開，取出，晾干，置于紫外燈下（365 nm）檢視[7，15]。結(jié)果顯示，在與混合對照品溶液色譜相應(yīng)的位置上，供試品溶液色譜中顯相同顏色的紫色熒光斑點（去氫駱駝蓬堿）和藍色熒光斑點（駱駝蓬堿），詳見圖3。

2.3 檢查

參照2015年版《中國藥典》（四部）通則0832第二法、通則2302第一法和第二法酸不溶性灰分測定法、通則2201熱浸法[2]，分別檢測藥材樣品的水分、總灰分、酸不溶灰分、醇浸出物（即50%乙醇浸出物），結(jié)果詳見表2。

由表2可見，各批次駱駝蓬草藥材的水分為8.82%～11.18%，總灰分為14.91%～19.85%，酸不溶性灰分為1.05%～1.88%，醇浸出物為18.35%～30.08%。因此，規(guī)定該藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分分別不得高于12%、22%、2%，醇浸出物不得低于16%。

2.4 含量測定

采用HPLC法測定駱駝蓬藥材中駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的含量。

2.4.1 溶液的制備 （1）混合對照品溶液：取駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿對照品各適量，精密稱定，加甲醇溶解制成每1 mL分別含駱駝蓬堿301.40 μg、去氫駱駝蓬堿301.80 μg的混合溶液，即得。（2）供試品溶液：取藥材樣品細粉0.1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲（功率：250 W，頻率：30 kHz）處理45 min，放冷，再用甲醇補足減失的質(zhì)量，然后以13 000 r/min離心10 min，取上清液，即得。（3）空白對照溶液：以甲醇作為空白對照。

2.4.2 色譜條件與系統(tǒng)適用性考察 色譜柱：X- bridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈（A相）-醋酸銨緩沖液（冰醋酸調(diào)節(jié)pH至6，B相），梯度洗脫（0～7 min，11%A;7～8 min，11%A→19%A;8～25 min，19%A;25～26 min，19%A→27%A;26～37 min，27%A）;檢測波長：267 nm;柱溫：25 ℃;流速：1 mL/min;進樣量：5 μL。取“2.4.1”項下混合對照品溶液、供試品溶液（批號：20180818）按上述色譜條件進樣檢測。結(jié)果，待測成分的分離度均大于1.5，空白溶劑無干擾，理論板數(shù)按駱駝蓬堿峰計應(yīng)不低于3 000，色譜見圖4。

2.4.3 線性關(guān)系考察 精密量取“2.4.1”項下混合對照品溶液，以甲醇稀釋制成駱駝蓬堿質(zhì)量濃度分別為15.22、30.44、38.05、60.88、152.20、301.40 μg/mL，去氫駱駝蓬堿質(zhì)量濃度分別為15.09、30.18、37.72、60.36、150.90、301.80 μg/mL的系列混合對照品溶液，按“2.4.2”項下色譜條件進樣測定。以對照品溶液的質(zhì)量濃度（x，μg/mL）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得駱駝蓬堿的標準曲線方程為y=7 414.2x-35 968（r=0.998 8），去氫駱駝蓬堿的標準曲線方程為y=15 536x-88 850（r=0.999 0）。結(jié)果表明，駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿質(zhì)量濃度分別在15.22～301.40、15.09～301.80 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.4 精密度試驗 精密稱取藥材樣品（批號：20180818）細粉0.1 g，按“2.4.1（2）”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次。結(jié)果，駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿峰面積的RSD分別為2.40%、3.10%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.4.5 重復性試驗 精密稱取藥材樣品（批號：20180818）細粉0.1 g，平行6份，按“2.4.1（2）”項下方法制備供試品溶液，再按“2.4.2”項下色譜條件進樣測定，并以標準曲線法計算含量。結(jié)果，駱駝蓬堿平均含量為10.80 mg/g（RSD=3.76%，n=6），去氫駱駝蓬堿平均含量為5.84 mg/g（RSD=3.62%，n=6），表明本方法重復性良好。

2.4.6 穩(wěn)定性試驗 精密稱取藥材樣品（批號：20180818）細粉0.1 g，按“2.4.1（2）”項下方法制備供試品溶液，分別在室溫條件下放置0、4、8、10、12、24 h時，按“2.4.2”項下色譜條件進樣測定。結(jié)果，駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿峰面積的RSD分別為0.57%、2.76%（n=6），表明供試品溶液在上述條件下放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.4.7 回收率試驗 分別精密稱取駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿對照品各適量，以甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為0.304 2、0.288 5 mg/mL的混合對照品溶液。精密稱取已準確測得含量的藥材樣品（批號：20180818）細粉0.06 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入上述混合對照品溶液適量，制備低、中、高3個濃度樣品，均平行3份操作，然后按“2.4.5”項下方法配制供試品溶液、進樣測定并計算含量及回收率。結(jié)果，駱駝蓬堿平均回收率為100.22%（RSD=0.51%，n=9），去氫駱駝蓬堿平均回收率為100.94%（RSD=1.75%，n=9），表明本方法準確度良好，詳見表3。

2.4.8 樣品含量測定 取10個批次藥材樣品細粉各0.1 g，按“2.4.5”項下方法制備供試品溶液、進樣測定，并計算樣品含量。結(jié)果，10批藥材的駱駝蓬堿含量范圍為2.88～10.80 mg/g，去氫駱駝蓬堿含量范圍為5.26～7.43 mg/g;以駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿的含量之和計算總生物堿含量，結(jié)果詳見表4。

由表4可見，10批次駱駝蓬草藥材的總生物堿含量為8.28～16.64 mg/g，故擬定該藥材總生物堿含量（以駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿合計）不得低于6.5 mg/g。

3 討論

3.1 TLC法鑒別條件篩選

駱駝蓬草中主要含有生物堿類、黃酮類等成分，本研究初步建立了鑒別藥材中駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的TLC法，考察了乙酸乙酯-甲醇（4 ∶ 1，V/V）、乙酸乙酯-甲醇-氨水（20 ∶ 5 ∶ 1，V/V/V）等展開系統(tǒng)。結(jié)果顯示，乙酸乙酯-甲醇-氨水（20 ∶ 5 ∶ 1，V/V/V）為展開系統(tǒng)時分離效果較好[7，15]。

3.2 HPLC法含量測定色譜條件優(yōu)化

本研究考察了在乙腈-0.1%醋酸體系、乙腈-0.1%磷酸（三乙胺）體系、乙腈-醋酸銨（0.1%醋酸）體系等流動相下的分離效果。結(jié)果顯示，乙腈-醋酸銨（0.1%醋酸）體系為流動相時色譜峰分離效果最佳，同時對色譜柱柱效的影響較小，故確定該流動相為本研究含量測定色譜條件。

3.3 不同樣品中駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿的含量分析

本研究通過含量測定發(fā)現(xiàn)，哈薩克地區(qū)不同產(chǎn)地駱駝蓬草中駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿含量差異較大，其中以新疆伊犁哈薩克自治州伊寧市伊寧縣潘津鄉(xiāng)和察縣24公里處收集樣品的含量最高;10批次藥材中駱駝蓬堿含量范圍為2.88～10.80 mg/g，去氫駱駝蓬堿含量范圍為5.26～7.43 mg/g，這可能與其不同的生長環(huán)境及采收時間等因素有關(guān)。

據(jù)文獻報道，駱駝蓬堿和去氫駱駝蓬堿等β-咔啉類生物堿主要分布于駱駝蓬種子中;而莖葉、種殼等部位除主要含有鴨嘴花堿等喹唑啉類生物堿成分外，還含有較多的黃酮類成分[13，16]。本研究僅對2種β-咔啉類生物堿進行了定量控制，尚未全面研究駱駝蓬草中喹唑啉類生物堿以及黃酮類成分含量。但是本研究實現(xiàn)了不同成分（保留時間分別約為6、11、15、19、21、27 min）的色譜分離，然而受標準對照物質(zhì)缺乏等因素限制，暫未全面對其進行定性鑒別和定量控制，后續(xù)擬結(jié)合質(zhì)譜學技術(shù)對上述成分作進一步研究。

駱駝蓬屬植物在我國境內(nèi)主要共有3種，分別為駱駝蓬、駱駝蒿、多裂駱駝蓬?？傮w而言，在新疆較多的是駱駝蓬;在青海和甘肅中部及東部黃土高原多為多裂駱駝蓬;在內(nèi)蒙古、寧夏、陜西北部及河西走廊的大部分地區(qū)則同時分布有2～3種駱駝蓬屬植物;駱駝蓬草主產(chǎn)地依然是新疆[17-19]。本文系在深度開發(fā)哈薩克傳統(tǒng)制劑祛風阿德爾阿斯盤蜜膏過程中總結(jié)而來，而哈薩克族當?shù)丶床捎眯陆貐^(qū)駱駝蓬草入藥，故本研究采集的駱駝蓬草樣品僅來自于新疆哈薩克地區(qū)。后續(xù)將收集我國境內(nèi)不同產(chǎn)地駱駝蓬草進行比較，以期進一步完善該藥材的質(zhì)量標準。

綜上所述，本研究在原標準基礎(chǔ)上增加了駱駝蓬草藥材的水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物等檢查項，建立了TLC法鑒別駱駝蓬堿、去氫駱駝蓬堿和HPLC法測定兩者含量的方法，提升了《衛(wèi)生部藥品標準（維吾爾藥分冊）》收載的原駱駝蓬草質(zhì)量標準，可為該藥材的全面質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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（收稿日期：2019-04-06 修回日期：2019-08-26）

（編輯：段思怡）