熊果酸/PF127/TPGS-多柔比星混合納米膠束的制備及其體外釋藥特性研究

陳洋洋 耿雪 屈子卉 李雪瑩 王琪 霍元子 郝若祎 閻雪瑩

中圖分類號(hào) R943;R944.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）20-2789-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.11

摘 要 目的：制備熊果酸（UA）/Pluronic F127（PF127）/聚乙二醇維生素E琥珀酸酯（TPGS）-多柔比星（DOX）混合納米膠束，并對(duì)其進(jìn)行表征和體外釋藥特性研究。方法：采用薄膜水化法制備UA/PF127/TPGS納米膠束;以UA包封率為指標(biāo)，結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)處方中的UA投藥量、PF127與TPGS的摩爾比、水化溫度、水化體積進(jìn)行優(yōu)化并驗(yàn)證。在琥珀酰化TPGS的基礎(chǔ)上，合成TPGS-DOX，與UA/PF127/TPGS混合制備UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束，考察其外觀、粒徑、臨界膠束濃度（PF127/TPGS），采用透析袋擴(kuò)散法考察其體外釋藥行為。結(jié)果：UA/PF127/TPGS納米膠束的最優(yōu)制備工藝為UA投藥量8 mg、PF127與TPGS的摩爾比3 ∶ 7、水化溫度50 ℃、水化體積4 mL，所得納米膠束中UA的平均包封率為89.00%（RSD=0.43%，n=3）。在此基礎(chǔ)上所制UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束溶液澄清且?guī)в腥楣?呈類球形且大小均勻，平均粒徑為（115.00±9.42）mm;PF127/TPGS（摩爾比3 ∶ 7）的臨界膠束濃度為0.001 3%。該混合納米膠束中UA、DOX的體外釋放均較其原料藥或?qū)φ掌访黠@減緩，膠束中兩種藥物的釋藥過(guò)程均符合Weibull方程。結(jié)論：本研究成功制備了UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束，其粒徑均勻且系統(tǒng)穩(wěn)定性好，并具有較好的緩釋效果。

關(guān)鍵詞 熊果酸;多柔比星;Pluronic F127;聚乙二醇維生素E琥珀酸酯;混合納米膠束;正交試驗(yàn);體外釋放

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To prepare Ursolic acid （UA）/Pluronic F127 （PF127）/TPGS-doxorubicin （DOX） mixed nanomicelles， and to characterize it and study its in vitro release behavior. METHODS： UA/PF127/TPGS nanomicelles were prepared by thin film hydration method. Using encapsulation efficiency of UA as index， combined with the results of single factor tests， L9（34） orthogonal test was used to optimize drug dosage of UA， molar ratio of PF127 to TPGS， hydration temperature and hydration volume， validation test was performed. On the basis of succinylated TPGS， TPGS-DOX was synthesized and mixed with UA/PF127/TPGS to prepare UA/PF127/TPGS-DOX mixed nanomicelles， the appearance， particle size and critical micelle concentration （PF127/TPGS） were investigated. The drug release behavior was examined by dialysis bag diffusion method. RESULTS： The optimal preparation technology of UA/PF127/TPGS nanomicelles was as follows as drug dosage of UA 8 mg， molar ratio of PF127 to TPGS 3 ∶ 7， hydration temperature 50 ℃， hydration volume 4 mL. Average encapsulation efficiency of UA in nanomicelles was 89.00% （RSD=0.43%， n=3）. The prepared UA/PF127/TPGS-DOX mixed nanomicelles solution was clear with opalescence. The nanomicelles were spherical and uniform in size; average particle size was （115.00±9.42） nm; critical micelle concentration of PF127/TPGS （molecular ratio 3 ∶ 7） was 0.001 3%. The in vitro drug release of UA and DOX in the mixed nanomicelles was significantly slowed down， compared with raw materials or substance control. The drug release process of the two drugs in the nanomicelles conformed to Weibull equation. CONCLUSIONS： UA/PF127/TPGS-DOX mixed nanomicelles are successfully prepared with uniform particle size， good stability and good sustained-release effect.

KEYWORDS? ?Ursolic acid; Doxorubicin; Pluronic F127; TPGS; Mixed nanomicelles; Orthogonal test; Release in vitro

熊果酸（Ursolic acid，UA）屬于五環(huán)三萜類化合物，具有廣泛的藥理活性，如抗腫瘤、抗氧化、抗炎、抗高脂血癥等，但由于其水溶性差、生物利用度低，使得該化合物的應(yīng)用受到極大限制[1-2]。多柔比星（Doxorubicin，DOX）是從鏈球菌色素代謝物中分離出來(lái)的一種蒽環(huán)類化合物，被認(rèn)為是最有效的化療藥之一，是諸多類型癌癥臨床治療的一線用藥[3]。DOX水溶性好，但長(zhǎng)期使用會(huì)導(dǎo)致多藥耐藥，而有研究表明，UA可抑制上述多藥耐藥性，兩藥聯(lián)用具有一定的協(xié)同作用[4]。

Pluronic F127（PF127）是一種ABA型的三嵌段共聚物，由聚環(huán)氧乙烷-聚環(huán)氧丙烷-聚環(huán)氧乙烷（PEO-PPO- PEO）構(gòu)成[5]。在各種類型的Pluronics中，PF127在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用最為廣泛，其由PPO疏水性嵌段構(gòu)成的內(nèi)核可作為疏水性藥物的微環(huán)境，PEO親水性嵌段則可防止結(jié)合蛋白質(zhì)的吸附和聚集[6]。聚乙二醇維生素E琥珀酸酯（TPGS）具有兩親性，被美國(guó)FDA認(rèn)定為安全的藥用輔料，可作為增溶劑、增塑劑、乳化劑、穩(wěn)定劑等應(yīng)用于藥物制劑中[7-8];此外，TPGS也可用于前體藥物的合成，可與其他共聚物形成混合載體以提高藥物的溶解度、滲透性及穩(wěn)定性，從而實(shí)現(xiàn)緩釋、控釋及靶向作用，以促進(jìn)藥物的吸收[9]。本研究將疏水性藥物UA包載于PF127和TPGS形成的混合膠束（TPGS-PF127）內(nèi)核中，初步嘗試制備UA/PF127/TPGS，并優(yōu)化其制備處方工藝[10];同時(shí)參考文獻(xiàn)方法[11]，在琥珀酰化TPGS的基礎(chǔ)上，利用其末端羧基與親水性藥物DOX上的氨基結(jié)合，合成TPGS-DOX;又將上述TPGS-DOX與TPGS-PF127作為共同載體，制備UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束，并對(duì)其進(jìn)行表征以及體外釋藥行為考察，以期為該制劑的后續(xù)體內(nèi)代謝研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜（HPLC）儀（美國(guó)Waters公司）;R-205B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、W202B型恒溫水浴鍋（上海申勝生物技術(shù)有限公司）;TGL-16C型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）;HJ-6A型數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（金壇市榮華儀器制造有限公司）;BT25S型分析天平（德國(guó)Sartorius公司）;UV9100型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京萊伯泰科儀器股份有限公司）;470型傅里葉紅外變換光譜儀（美國(guó)Nicolet公司）;400型核磁共振光譜儀（美國(guó)Bruker公司）;JEM-2100型透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）;Zetasizer Nano-ZS90型納米粒度及Zeta電位分析儀（英國(guó)Malvern公司）。

1.2 藥品與試劑

UA對(duì)照品（長(zhǎng)沙麓園生物科技有限公司，批號(hào)：LYUA-20141218012，純度：≥98%）;UA原料藥（南京道斯夫生物科技有限公司，批號(hào)：141202R，純度：>98%）;鹽酸多柔比星對(duì)照品（DOX·HCl，北京華奉聯(lián)博化學(xué)材料有限公司，批號(hào)：HF150728，純度：>98%）;PF127（德國(guó)BASF公司，批號(hào)：140215）;TPGS（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：T110277）;琥珀酸酐（SA）（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150128）;二環(huán)己基碳二亞胺（DCC，批號(hào)：Z23A6Y9）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，批號(hào)：Z31A8N42796）均購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司;透析袋（截留分子量：8 000～14 400 Da，美國(guó)Sigma公司）;0.22 μm微孔濾膜（天津市領(lǐng)航實(shí)驗(yàn)設(shè)備股份有限公司）;甲醇、乙腈均為色譜純，乙醇、三乙胺（TEA）、二甲基亞砜（DMSO）等其余試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 UA含量測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定。

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-0.5%磷酸水溶液（85 ∶ 15，? ? V/V）;檢測(cè)波長(zhǎng)：210 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：25 ℃;進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2 溶液的配制 ①UA貯備液：精密稱取UA對(duì)照品4.01 mg，用乙醇溶解并定容至10 mL量瓶中，得質(zhì)量濃度為401.00 μg/mL的UA貯備液。②供試品溶液：精密稱定處方量UA原料藥，固定摩爾比的PF127、TPGS以及一定量的TPGS-DOX，用乙醇溶解，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮去有機(jī)溶劑，于室溫真空干燥箱中靜置過(guò)夜，得透明干燥的含藥薄膜。將上述薄膜用適量水進(jìn)行水化，于適宜溫度水浴中以700 r/min攪拌30 min，冷卻至室溫，即得UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束供試品溶液。③陰性對(duì)照溶液：按“2.1.2②”項(xiàng)下方法制備不含UA、DOX的空白膠束溶液，即得陰性對(duì)照溶液。

2.1.3 專屬性考察 分別取“2.1.2”項(xiàng)下UA貯備液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示，在該色譜條件下，UA峰形較好，保留時(shí)間約為14.9 min;DOX在此波長(zhǎng)下無(wú)吸收，TPGS、PF127等對(duì)UA的測(cè)定無(wú)干擾，表明本方法專屬性良好。

2.1.4 線性關(guān)系考察 分別取“2.1.2①”項(xiàng)下UA貯備液適量，用乙醇稀釋，制得質(zhì)量濃度分別為40.10、100.25、200.50、300.75、401.00 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（c，μg/mL）、其峰面積為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程為A=6 127.2c-99 354（R2=0.999 2）。結(jié)果，UA檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為40.10～401.00 μg/mL。

2.1.5 定量限與檢測(cè)限考察 取“2.1.4”項(xiàng)下40.10 μg/mL的UA對(duì)照品溶液適量，用乙醇逐級(jí)稀釋，并按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得UA定量限為2.23 μg/mL;當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得UA檢測(cè)限為0.808 μg/mL。

2.1.6 精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、加樣回收率和穩(wěn)定性試驗(yàn) 參照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）要求[12]進(jìn)行精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、加樣回收率和穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果，精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、加樣回收率均符合藥典相關(guān)規(guī)定，供試品溶液在室溫下放置24 h基本穩(wěn)定。

2.2 DOX含量測(cè)定

采用HPLC法測(cè)定。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Dikma Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：磷酸緩沖液[500 mL水中加入磷酸0.68 mL、十二烷基硫酸鈉（SDS）1.44 g]-乙腈-甲醇（500 ∶ 500 ∶ 60，V/V/V）;檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：25 ℃;進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 溶液的配制 ①DOX貯備液：精密稱取DOX·HCl對(duì)照品4.00 mg，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS，含20%乙醇）溶解并定容至100 mL量瓶中，制得質(zhì)量濃度為40.00 μg/mL（以DOX·HCl質(zhì)量計(jì)，下同）的DOX貯備液。②供試品溶液：按“2.1.2②”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。③陰性對(duì)照溶液：按“2.1.2③”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.3 專屬性考察 分別取“2.2.2”項(xiàng)下DOX貯備液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各適量，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，詳見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示，在該色譜條件下，DOX峰形較好，保留時(shí)間約為10.5 min;UA在此波長(zhǎng)下無(wú)吸收，TPGS、PF127等對(duì)DOX的測(cè)定無(wú)干擾，提示本方法專屬性良好。

2.2.4 線性關(guān)系考察 取“2.2.2①”項(xiàng)下DOX貯備液適適量，用乙醇稀釋，制得質(zhì)量濃度分別為4.00、8.00、16.00、32.00、40.00 μg/mL的系列對(duì)照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。以待測(cè)物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（c，μg/mL）、其峰面積為縱坐標(biāo)（A）進(jìn)行線性回歸，得線性回歸方程為A=2585 080c-29 936（R2=0.999 9）。結(jié)果，DOX檢測(cè)質(zhì)量濃度的線性范圍為4.00～40.00 μg/mL。

2.2.5 定量限與檢測(cè)限考察 取“2.2.4”項(xiàng)下40.00 μg/mL的UA對(duì)照品溶液適量，用乙醇逐級(jí)稀釋，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得DOX定量限為2.263 μg/mL;當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得DOX檢測(cè)限為0.608 μg/mL。

2.2.6 精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、加樣回收率和穩(wěn)定性試驗(yàn) 參照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）要求[12]進(jìn)行精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、加樣回收率和穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果，精密度、準(zhǔn)確度、重復(fù)性、加樣回收率均符合藥典相關(guān)規(guī)定，供試品溶液在室溫下放置24 h基本穩(wěn)定。

2.3 UA包封率和載藥量測(cè)定

精密量取所得UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束溶液適量，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)后，取續(xù)濾液，用乙醇稀釋，以12 000 r/min離心10 min，取上清液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算其被包封的UA含量（m包封）;精密量取UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束溶液適量，不經(jīng)濾過(guò)處理，同法離心后取上清液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，并采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算UA的總量（m總）。包封率（%）=（m包封/m總）×100%，載藥量（%）=[m包封/（m投藥+m載體）]×100%（式中，m投藥為UA投藥量，m載體為載體總量）[13-14]。

2.4 UA/PF127/TPGS納米膠束處方工藝優(yōu)化

采用薄膜水化法[15]制備UA/PF127/TPGS納米膠束：稱取一定量的UA原料藥以及一定摩爾比的載體材料PF127、TPGS（載體材料共100 mg），置于同一100 mL茄型瓶中，加入適量有機(jī)溶劑使其充分溶解，于45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1 h以揮干有機(jī)溶劑，殘?jiān)谑覝卣婵崭稍锵渲徐o置過(guò)夜，即得透明干燥的含藥薄膜。將上述含藥薄膜用一定量的水進(jìn)行水化后，于一定溫度水浴中以700 r/min攪拌30 min，冷卻至室溫，即得。

2.4.1 單因素試驗(yàn) 參考現(xiàn)有研究[13]，以納米膠束溶液澄清程度為指標(biāo)，對(duì)有機(jī)溶劑種類進(jìn)行考察;以UA包封率為考察指標(biāo)，對(duì)UA投藥量、PF127與TPGS的摩爾比、水化溫度、水化體積等進(jìn)行單因素考察。各因素水平均平行操作3次，結(jié)果見(jiàn)表1、表2（表1中，“++”表示澄清，“+”表示較澄清，“-”表示渾濁）。由表1、表2可見(jiàn)，以乙醇作為溶劑，可獲得澄清的納米膠束溶液;當(dāng)UA投藥量為8 mg、PF127與TPGS的摩爾比為3 ∶ 7、水化溫度為37 ℃、水化體積為4 mL時(shí)，所得UA/PF127/TPGS納米膠束的包封率相對(duì)較高。

2.4.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以UA投藥量（A）、PF127與TPGS的摩爾比（B）、水化溫度（C）、水化體積（D）為考察因素，以UA包封率為考察指標(biāo)，采用L9（34）表進(jìn)行正交試驗(yàn)，每個(gè)因素取3個(gè)水平。因素與水平見(jiàn)表3，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表4，方差分析結(jié)果見(jiàn)表5。

由表4、表5可見(jiàn)，4個(gè)因素對(duì)UA包封率的影響程度依次為B>D>A>C;除因素C外，其余因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）;最優(yōu)處方工藝為A3B3C2D2，即UA投藥量為8 mg、PF127與TPGS的摩爾比為3 ∶ 7、水化溫度為50 ℃、水化體積為4 mL。

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按“2.3.2”項(xiàng)下最優(yōu)處方工藝平行制備3批UA/PF127/TPGS納米膠束，并按“2.1”項(xiàng)下方法測(cè)定UA含量，再按“2.3”項(xiàng)下方法計(jì)算UA包封率和載藥量，結(jié)果見(jiàn)表6。

2.5 TPGS-DOX的合成與表征

2.5.1 合成 取相同質(zhì)量的TPGS、SA，通過(guò)開(kāi)環(huán)反應(yīng)合成琥珀酰化的TPGS-SA。精密稱定或量取TPGS-SA 574.82 mg、DOX·HCl對(duì)照品307.51 mg、DCC 222.63 mg、NHS 124.38 mg、TEA 150 μL，置于適量DMSO中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下室溫反應(yīng)24 h。所得產(chǎn)物作透析處理后，依次用DMSO、水清洗，冷凍干燥，即得紅色粉末狀的TPGS-DOX[11]。TPGS-DOX的合成過(guò)程見(jiàn)圖3。

2.5.2 表征 ①紅外光譜：稱取DOX·HCl對(duì)照品、TPGS-DOX各10 mg，采用傅里葉紅外變換光譜儀檢測(cè)，其紅外光譜分別見(jiàn)圖4A、4B;對(duì)照TPGS紅外圖譜（圖4C[16]）判定反應(yīng)是否成功。結(jié)果，DOX在3 300～3 500 cm-1處可見(jiàn)其氨基的特征吸收峰（雙峰），而該雙峰在TPGS-DOX的紅外光譜中消失;TPGS在1 738、1 108 cm-1處分別可見(jiàn)羰基和醚鍵的特征吸收峰，而上述吸收峰在TPGS-DOX的紅外光譜中均有所減弱（見(jiàn)圖4畫(huà)圈處），提示UA的氨基已與TPGS中的羧基連接成功。

②氫譜（1H-NMR）：稱取DOX·HCl對(duì)照品、TPGS、TPGS-DOX各適量溶于DMSO-d6中，使用核磁共振光譜儀檢測(cè)，其氫譜見(jiàn)圖5。由圖5可見(jiàn)，DOX在3.99、5.45 ppm處有特征吸收峰;TPGS在3.51 ppm處有特征吸收峰;TPGS-DOX的氫譜包含TPGS的特征吸收峰，且在8.0～8.1 ppm處存在酰胺鍵的特征吸收峰，但DOX的特征吸收峰變小，提示DOX已通過(guò)酰胺鍵與TPGS結(jié)合。

③HPLC定性分析：取DOX·HCl對(duì)照品、TPGS- DOX各適量，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，記錄色譜圖，見(jiàn)圖6。由圖6可見(jiàn)，DOX的保留時(shí)間約為10.5 min，而TPGS-DOX的保留時(shí)間約為9.4 min，且未見(jiàn)游離DOX的色譜峰。

2.6 UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束的制備及表征

2.6.1 制備 分別精密稱取UA原料藥8 mg、PF127 78 mg、TPGS 21.4 mg以及TPGS-DOX 0.6 mg，置于同一100 mL茄型瓶中，加乙醇5 mL使其充分溶解，在45 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)1 h以揮去有機(jī)溶劑，殘?jiān)谑覝卣婵崭稍锵渲徐o置過(guò)夜，即得透明干燥的含藥薄膜。取上述含藥薄膜適量，于50 ℃水浴條件下加水4 mL進(jìn)行水化。在700 r/min轉(zhuǎn)速下恒速攪拌30 min，冷卻至室溫，即得UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束溶液。

2.6.2 形態(tài)觀察與粒徑測(cè)定 取“2.6.1”項(xiàng)下所得UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束溶液適量，滴至鋪有碳膜的銅網(wǎng)上，用2.0%磷錫酸溶液染色，自然干燥，使膠束粒子在銅網(wǎng)上濃縮沉積，于透射電子顯微鏡下觀察其形態(tài)并拍照。室溫條件下，取上述UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束溶液適量，用水稀釋后，采用納米粒度及Zeta電位分析儀檢測(cè)其粒徑。結(jié)果，所得UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束溶液澄清且?guī)в腥楣?鏡下呈類球形，且大小均勻、分散良好;平均粒徑為（115.00±9.42）mm，詳見(jiàn)圖7、圖8。

2.6.3 臨界膠束濃度（CMC）測(cè)定 采用I2探針增溶的紫外-可見(jiàn)分光光度法以紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)檢測(cè)PF127/TPGS水溶液I2吸光度隨其濃度（濃度為0.000 01%～0.1%）變化的趨勢(shì)圖。結(jié)果，摩爾比為3 ∶ 7的PF127/TPGS水溶液的CMC為0.001 3%，介于PF127 （0.003 5%）和TPGS（0.03%）之間，且系統(tǒng)穩(wěn)定性較好（臨界膠束濃度越低，膠束越穩(wěn)定[17]），詳見(jiàn)圖9。

2.7 體外釋藥特性研究

采用透析袋擴(kuò)散法檢測(cè)。取按最優(yōu)處方工藝制得的UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束溶液、UA原料藥、DOX·HCl對(duì)照品各8 mL，分別裝入透析袋中，以含20%乙醇的PBS為釋放介質(zhì)（總體積為50 mL），于37 ℃下以100 r/min恒速振搖。分別于釋放的0.25、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、36、48、72 h取樣2 mL（取樣后補(bǔ)充同體積釋放介質(zhì)），經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)后，再分別按“2.1.1”“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算其中UA、DOX的含量，計(jì)算累積釋放率（Q），并繪制體外釋藥曲線，再分別用零級(jí)動(dòng)力學(xué)、一級(jí)動(dòng)力學(xué)、Weibull、Higuchi、Niebergull、Hixcon-Crowell、Ritger- Peppas等方程對(duì)其體外釋藥行為進(jìn)行擬合，結(jié)果見(jiàn)圖10、表7。

由圖10可見(jiàn)，UA、DOX體外釋藥迅速，分別約于12、6 h釋放完全，而UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束中UA、DOX的釋放均明顯放緩。由表7可見(jiàn)，UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束中藥物的體外釋藥過(guò)程均符合Weibull方程（UA、DOX的R2分別為0.960 2、0.919 3）。

3 討論

DOX抗瘤譜較廣，是一種重要的化療藥，但由于其慢性毒性（可導(dǎo)致心臟、肝臟、大腦和腎臟損傷）和急性毒性（惡心、嘔吐、心律失常等）導(dǎo)致其應(yīng)用受到了一定的限制[18]。UA來(lái)源于天然產(chǎn)物，具有抗多藥耐藥以及保肝護(hù)肝、保護(hù)心血管的功效[19-20]。Zong L等[4]研究發(fā)現(xiàn)，UA不僅可提高DOX的療效，而且還能逆轉(zhuǎn)細(xì)胞對(duì)DOX的多藥耐藥。因此，本研究選擇DOX和UA作為模型藥物，制備UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束，以期為兩藥聯(lián)合治療癌癥提供理論支持。

3.1 色譜條件的優(yōu)化

本研究首先建立了檢測(cè)UA和DOX質(zhì)量濃度的HPLC法。在前期研究中，本課題組考察了不同流動(dòng)相比例、檢測(cè)波長(zhǎng)、流速、柱溫等因素對(duì)其定量分析的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，檢測(cè)UA時(shí)以流動(dòng)相為乙腈-0.5%磷酸水溶液（85 ∶ 15，V/V）、檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm、流速為1.0 mL/min、柱溫為25 ℃，檢測(cè)DOX時(shí)以流動(dòng)相為磷酸緩沖液（500 mL水中加入磷酸0.68 mL、SDS 1.44 g）-乙腈-甲醇（500 ∶ 500 ∶ 60，V/V/V）、檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm、流速為1.0 mL/min、柱溫為25 ℃，兩者的色譜峰峰形均較好，且方法學(xué)考察結(jié)果符合2015年版《中國(guó)藥典》（四部）的相關(guān)要求[12]。

3.2 混合納米膠束載體的選擇

混合納米膠束是近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一，其可通過(guò)不同嵌段共聚物來(lái)協(xié)同發(fā)揮包載藥物的藥理作用，可提高膠束的穩(wěn)定性和藥物的包封率，可優(yōu)化膠束的粒徑分布，并延長(zhǎng)載藥系統(tǒng)在體內(nèi)的滯留時(shí)間[21]。PF127是一種多功能材料，在水溶液中能自發(fā)聚集形成膠束，將難溶性藥物包裹于其中，可明顯提高藥物的溶解性和穩(wěn)定性[5-6]。但PF127的CMC較高，當(dāng)用溶劑稀釋時(shí)易發(fā)生不穩(wěn)定的現(xiàn)象;而當(dāng)其與TPGS共同構(gòu)成混合載體時(shí)，所得混合膠束的CMC明顯降低;加之TPGS結(jié)構(gòu)中含有芳香環(huán)，可使混合膠束的疏水核體積增大，難溶藥物更易進(jìn)入膠束的疏水核內(nèi)，從而提高了藥物的包封率和載藥量[15]。鑒于此，本課題組選擇PF127和TPGS為混合載體制備混合納米膠束。

3.3 混合納米膠束的制備及體外釋藥特征分析

本研究曾采用薄膜水化法、自組裝法、透析法、乳化溶劑揮發(fā)法以及納米沉淀法制備混合納米膠束，由于薄膜水化法制備的膠束的包封率、載藥量、粒徑均優(yōu)于其他方法，故選擇該法首先制備了包載單藥的UA/PF127/TPGS納米膠束，將疏水性藥物UA包載于納米膠束的疏水內(nèi)核中;并通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化UA/PF127/TPGS的處方工藝，制得了包封率較高的UA/PF127/TPGS納米膠束。隨后，將TPGS琥珀酸化，利用其末端羧基與DOX上的氨基進(jìn)行鍵合反應(yīng)，形成酰胺鍵;通過(guò)IR、1H-NMR、HPLC法證實(shí)TPGS-DOX已被成功合成。根據(jù)上述最優(yōu)處方工藝，將UA、PF127、TPGS與TPGS-DOX混合，進(jìn)一步制備了UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束，并對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行了一系列的表征和體外釋藥特性研究。在進(jìn)行UA/PF127/TPGS-DOX納米膠束體外釋藥特性研究時(shí)，溶出介質(zhì)的選擇至關(guān)重要，故本研究在2015年版《中國(guó)藥典》（四部）[12]和已有文獻(xiàn)[22]的基礎(chǔ)上，選用含20%乙醇的PBS作為溶出介質(zhì)。體外釋藥特性研究結(jié)果顯示，與單一UA、DOX比較，UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束中兩藥的釋放均明顯減緩，提示其具有一定的緩釋特性;同時(shí)，UA/PF127/TPGS-DOX混合納米膠束中兩種藥物的體外釋藥行為符合Weibull方程，提示其釋藥與溶液滲透所致擴(kuò)散和載體松弛分散這一雙重因素有關(guān)[23]。

綜上所述，本研究利用PF127和TPGS自身特點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)疏水性UA和親水性DOX的共同裝載，構(gòu)建了混合載藥納米膠束，為溶解性差異較大的藥物聯(lián)用提供了新的設(shè)計(jì)思路。但本研究?jī)H進(jìn)行了膠束的處方工藝優(yōu)化和體外釋藥行為的研究，仍有待后續(xù)進(jìn)一步開(kāi)展體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)與藥效學(xué)分析，為其臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-01-18 修回日期：2019-07-26）

（編輯：張?jiān)拢?/p>