補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)特發(fā)性肺纖維化模型大鼠肺組織內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響及其機(jī)制研究

楊邯捷 趙惠亮 渠景連 譚蕓 王俊霞

中圖分類號(hào) R285 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）20-2757-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.20.05

摘 要 目的：探討補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)特發(fā)性肺纖維化（IPF）模型大鼠肺組織內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EndMT）的影響，并探討其可能機(jī)制。方法：將雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、地塞米松組[0.405 mg/（kg·d）]和補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高劑量組[6.435、12.87、25.74 g/（kg·d），以生藥總質(zhì)量計(jì)]，每組8只。除正常組外，其余各組大鼠均于氣管內(nèi)注射博來(lái)霉素以復(fù)制IPF模型。自造模后第2天起，正常組和模型組大鼠均灌胃水[10 mL/（kg·d）]，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)28 d。末次給藥24 h后，采用免疫組化法檢測(cè)大鼠肺組織中內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物[血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1、血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白]和間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物[α-平滑肌肌動(dòng)蛋白、成纖維細(xì)胞特異性蛋白1]的表達(dá)情況，采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)大鼠肺組織中Notch4、DLL4的表達(dá)情況。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠肺組織中內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平均顯著降低，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物以及Notch4、DLL4的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.01）。各給藥組大鼠肺組織中內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)水平均顯著高于模型組，補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組上述指標(biāo)顯著低于地塞米松組;間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物以及Notch4、DLL4的表達(dá)水平均顯著低于模型組，補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組上述指標(biāo)顯著高于地塞米松組（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：補(bǔ)陽(yáng)還五湯可通過(guò)干預(yù)EndMT來(lái)減輕大鼠的IPF，其機(jī)制可能與抑制DLL4/Notch4信號(hào)通路有關(guān)。

關(guān)鍵詞 特發(fā)性肺纖維化;補(bǔ)陽(yáng)還五湯;內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化;內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物;間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物;DLL4/Notch4信號(hào)通路;機(jī)制;大鼠

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To investigate the effects of Buyang huanwu decoction on endothelial-mesenchymal transformation （EndMT） of lung tissue in idiopathic pulmonary fibrosis （IPF） model rats， and to explore its potential mechanism. METHODS： Male SD rats were randomly divided into normal group， model gorup， dexamethasone group [0.405 mg/（kg·d）]， Buyang huanwu decoction low-dose， medium-dose and high-dose groups [6.435， 12.87， 25.74 g/（kg·d）， by raw material]， with 8 rats in each group. Except for normal group， other groups were given endotracheal injection of bleomycin to induce IPF model. On the second day after modeling， normal group and model group were given water intrgastrically [10 mL/（kg·d）]; administration groups were given relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 28 days. 24 h after last medication， the expression of endothelial cell markers [platelet endothelial cell adhesion molecule 1， vascular endothelial cell cadherin] and interstitial cell markers [α-smooth muscle actin， fibroblast specific protein 1] were detected by immunohistochemistry method. The expression of Notch4 and DLL4 in lung tissue of rats were detected by Western blotting assay. RESULTS： Compared with normal group， the expression of endothelial cell markers were decreased significantly in lung tissue of model group， while the expressipon of interstitial cell markers， Notch4 and DLL4 were increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， the expression of endothelial cell markers in lung tissue of rats were increased significantly in administration groups， while Buyang huanwu decoction low-dose group was significantly lower than dexamethasone group; the expression of interstitial cell markers， Notch4 and DLL4 were decreased significantly， while Buyang huanwu decoction low-dose group was significantly higher than dexamethasone group （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Buyang huanwu decoction can relieve IPF of model rats by intervening in EndMT， the mechanism of which may be associated with inhibiting DLL4/Notch4 singaling pathway.

KEYWORDS? ?Idiopathic pulmonary fibrosis; Buyang huanwu decoction; Endothelial-mesenchymal transformation; Endothelial cell marker; Interstitial cell marker; DLL4/Notch4 singaling pathway; Mechanism; Rats

特發(fā)性肺纖維化（Idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）是一種慢性纖維化性間質(zhì)性肺炎，臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難或刺激性干咳，其病情呈持續(xù)性進(jìn)展，最終可導(dǎo)致患者呼吸衰竭而亡[1]。目前，IPF的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，肺泡上皮損傷后修復(fù)異常被認(rèn)為是該病的主要發(fā)生機(jī)制[2]。但有研究表明，內(nèi)皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Endothelial-to-mesenchymal transition，EndMT）也是IPF發(fā)生、發(fā)展的重要機(jī)制之一[3]。EndMT是指在特定的生理?xiàng)l件下，內(nèi)皮細(xì)胞的形態(tài)由鵝卵石樣轉(zhuǎn)變?yōu)榧?xì)長(zhǎng)梭形，同時(shí)其遷移能力和侵襲能力顯著增強(qiáng)的病理過(guò)程。在此過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物[如血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣黏蛋白（VE-cadherin）、血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（CD31）等]的表達(dá)逐漸減弱或喪失，而間質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物[如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、成纖維細(xì)胞特異性蛋白1（FSP-1）等]逐漸上調(diào)[4]。近期研究認(rèn)為，包括DLL4/Notch4等在內(nèi)的Notch信號(hào)通路在EndMT過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[5]。其中，Notch4受體主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，DLL4配體作為一種重要的血管生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)因子，也主要在內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，兩者的特異性結(jié)合可啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)，從而調(diào)節(jié)血管的發(fā)育、成熟及穩(wěn)定[5-6]。

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為，IPF的主要病機(jī)為氣虛血瘀，益氣活血是其基本治法[7]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯出自清代名醫(yī)王清任的《醫(yī)林改錯(cuò)》，是益氣活血的代表方劑，可有效防治IPF[8]?，F(xiàn)代藥理研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯能夠通過(guò)抑制IPF模型大鼠肺組織轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、高遷移率族蛋白B1（HMGB1）、α-SMA等的過(guò)度表達(dá)，降低支氣管肺泡灌洗液中炎癥因子的含量，減輕肺泡炎癥反應(yīng)，減少肺纖維化瘢痕形成，從而發(fā)揮抗肺纖維化作用[9-10]。本課題組前期研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清可一定程度上抑制人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的間質(zhì)轉(zhuǎn)化，這種作用可能與調(diào)控Jagged1/Notch1通路的信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)[11]。在此基礎(chǔ)上，本研究以EndMT為切入點(diǎn)，進(jìn)一步探討了補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)IPF模型大鼠肺組織EndMT的影響，并從DLL4/Notch4信號(hào)通路出發(fā)分析其可能機(jī)制，以期為闡明該方劑防治IPF的作用機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1510型多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）;ChemiDocTM XRS+型凝膠成像系統(tǒng)、PowerPacTM Basic型電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）;BX53型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司）;RM2265型切片機(jī)、1150H型包埋機(jī)（德國(guó)Leica公司）;Allegra X-30R型離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司）;PL303型電子天平[梅特勒-托利多（上海）儀器公司];WGL-65B型電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津市泰斯特儀器有限公司）;T10BS25型電動(dòng)勻漿器（德國(guó)IKA公司）。

1.2 藥材、藥品與試劑

生黃芪（批號(hào)：180108，產(chǎn)地：甘肅）、當(dāng)歸（批號(hào)：171016，產(chǎn)地：甘肅）、赤芍（批號(hào)：161201，產(chǎn)地：甘肅）、地龍（批號(hào)：170801，產(chǎn)地：廣東）、川芎（批號(hào)：170701，產(chǎn)地：四川）、桃仁（批號(hào)：171101，產(chǎn)地：山東）、紅花（批號(hào)：170901，產(chǎn)地：新疆）等飲片均購(gòu)自貴陽(yáng)同仁堂藥房，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院孫慶文教授鑒定，分別為豆科植物蒙古黃芪[Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var. mongholicus（Bge.）Hsiao]的干燥根、傘形科植物當(dāng)歸[Angelica sinensis（Oliv.）Diels]的干燥根、毛茛科植物芍藥（Paeonia lactiflora Pall.）的干燥根、鉅引科動(dòng)物參環(huán)毛蚓[Pheretima aspergillum（E. Perrier）]的干燥體、傘形科植物川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）的干燥根莖、薔薇科植物桃[Amygdalus persica（L.）]的干燥成熟種子、菊科植物紅花（Chelonopsis tinctorius L.）的干燥花。

醋酸地塞米松片（陽(yáng)性對(duì)照，浙江仙琚制藥股份有限公司，批號(hào)：151238，規(guī)格：0.75 mg）;注射用鹽酸博來(lái)霉素（瀚暉制藥有限公司，批號(hào)：16032311，規(guī)格：1.5萬(wàn)單位）;兔源α-SMA抗體（批號(hào)：AG02247616）、兔源VE-cadherin抗體（批號(hào)：AC03185478）、兔源CD31抗體（批號(hào)：AO04265948）、兔源FSP1抗體（批號(hào)：AC09223656）均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;兔源Notch4抗體（批號(hào)：GR288351-4）、山羊源DLL4抗體（批號(hào)：GR162316-12）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;山羊抗兔辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記二抗（批號(hào)：3825j63）、兔抗山羊HRP標(biāo)記二抗（批號(hào)：34q9532）、山羊抗小鼠HRP標(biāo)記二抗（批號(hào)：1292k61）、小鼠源β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（批號(hào)：48k2671）均購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences公司;RIPA裂解液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）蛋白上樣緩沖液均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司;0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0）、牛血清白蛋白、二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;ECL發(fā)光液、聚偏氟乙烯（PVDF）膜均購(gòu)自默克密理博（中國(guó)）有限公司;其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 動(dòng)物

SPF級(jí)健康SD大鼠48只，雄性，2月齡，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自長(zhǎng)沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：SCXK（湘）2014-0011。

2 方法

2.1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯藥液的制備

按補(bǔ)陽(yáng)還五湯的配方比例（生黃芪120 g、當(dāng)歸6 g、赤芍5 g、地龍3 g、川芎3 g、桃仁3 g、紅花3 g）稱取各飲片適量，用10倍量（mL/g）水浸泡30 min后，文火煎煮2次，每次1 h，合并濾液，減壓濃縮，分別制得質(zhì)量濃度分別為1.5、3、6 g/mL（以生藥總質(zhì)量計(jì)）的藥液，于4 ℃保存，備用。

2.2 分組、造模與給藥

所有大鼠均適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為正常組、模型組、地塞米松組和補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高劑量組，每組8只。除正常組外，其余各組大鼠均于氣管內(nèi)注射博來(lái)霉素以復(fù)制IPF模型：大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉后，行頸正中切口，分離、暴露氣管，經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙向心端穿刺，注射博來(lái)霉素0.5萬(wàn)單位/kg（以生理鹽水為溶劑），隨后立即將大鼠直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)分布充分、均勻，縫合傷口。正常組大鼠經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙注入等容生理鹽水，其余操作同上。術(shù)后，所有大鼠均自由飲水、進(jìn)食。自造模后第2天起，正常組和模型組大鼠均灌胃水[10 mL/（kg·d）]，地塞米松組大鼠灌胃地塞米松0.405 mg/（kg·d）（以水為溶劑，劑量設(shè)置參考人等效劑量并按動(dòng)物體表面積換算而得），補(bǔ)陽(yáng)還五湯低、中、高劑量組分別灌胃補(bǔ)陽(yáng)還五湯6.435、12.87、25.74 g/（kg·d）（以生藥總質(zhì)量計(jì)，由“2.1”項(xiàng)下藥液經(jīng)水稀釋制得;劑量設(shè)置參考人等效劑量并按動(dòng)物體表面積換算而得，其中中劑量與人等效劑量相當(dāng)，每日1次，連續(xù)28 d。

2.3 標(biāo)本采集

末次給藥24 h后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，于其股動(dòng)脈放血后剖取兩肺，剪除氣管、支氣管，取左肺組織適量，備用。

2.4 肺組織中內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)情況檢測(cè)

采用免疫組化法檢測(cè)。取“2.3”項(xiàng)下大鼠肺組織適量，用-20 ℃氯化鈉溶液清洗3次，濾紙吸干水分，于4%多聚甲醛溶液中固定48 h后，常規(guī)石蠟包埋、切片（厚度約為5 μm），置于60 ℃干燥箱中烘干2 h。切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水后，用3%H2O2溶液室溫孵育10～15 min，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.2）清洗5 min×3次后，置于0.01 mol/L檸檬酸鈉緩沖液中，95 ℃微波加熱10 min，進(jìn)行抗原熱修復(fù);冷卻至室溫，用PBS清洗5 min×3次，用牛血清白蛋白于37 ℃封閉30 min;分別滴加CD31、VE-cadherin、α-SMA、FSP-1一抗（稀釋度均為1 ∶ 200），于37 ℃孵育2 h;用PBS清洗5 min×3次，滴加山羊抗兔HRP標(biāo)記二抗（稀釋度為1 ∶ 1 000），室溫孵育30 min;用PBS清洗5 min×3次，經(jīng)DAB顯色試劑盒顯色后，行常規(guī)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、樹(shù)膠封片;在光學(xué)顯微鏡高倍鏡視野（×200）下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察，采用Image Pro Plus 6.0軟件測(cè)量并記錄每個(gè)視野中陽(yáng)性染色（即染色后呈棕黃色的細(xì)胞）的平均光密度值，以此表示相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。

2.5 肺組織中Notch4、DLL4表達(dá)情況檢測(cè)

采用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)。取“2.3”項(xiàng)下大鼠肺組織100 mg，加入4 ℃預(yù)冷的RIPA裂解液1 mL，勻漿，于4 ℃下以12 000 r/min離心20 min，收集上清液。采用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加入等體積2×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液后，于95 ℃水浴中變性5 min后，于-80 ℃保存，備測(cè)。取上述蛋白適量進(jìn)行SDS-PAGE電泳（電壓：100 V，時(shí)間：1.5 h），電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，于5%脫脂奶粉中室溫振搖封閉1 h;分別加入Notch4、DLL4、β-actin一抗（稀釋度分別為 1 ∶ 1 000、1 ∶ 2 500、1 ∶ 5 000），4 ℃孵育過(guò)夜，用TBST溶液清洗8 min×3次，分別滴加山羊抗兔HRP;標(biāo)記二抗、兔抗山羊HRP標(biāo)記二抗、山羊抗小鼠HRP標(biāo)記二抗（稀釋度均為1 ∶ 10 000），37 ℃孵育1 h;用TBST溶液清洗8 min×3次，經(jīng)ECL顯色后，置于化學(xué)凝膠成像系統(tǒng)中顯影;采用ImageJ 1.51K軟件進(jìn)行分析，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度值比值表示相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD法。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)IPF模型大鼠肺組織中內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺組織中CD31、VE-cadherin的表達(dá)水平均顯著降低，α-SMA、FSP-1的表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組大鼠肺組織中CD31、VE-cadherin的表達(dá)水平均顯著升高，α-SMA、FSP-1的表達(dá)水平均顯著降低;與地塞米松組比較，補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組的CD31、VE-cadherin表達(dá)水平均顯著降低，α-SMA、FSP-1的表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）;其余各給藥組上述指標(biāo)組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見(jiàn)圖1、表1。

3.2 補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)IPF模型大鼠肺組織Notch4、DLL4表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組大鼠肺組織中Notch4、DLL4的表達(dá)水平均顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。各給藥組大鼠肺組織中Notch4、DLL4的表達(dá)水平均顯著低于模型組，補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組上述指標(biāo)顯著高于地塞米松組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05或P<0.01）;其余各給藥組上述指標(biāo)組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見(jiàn)圖2、表2。

4 討論

IPF是一種纖維化間質(zhì)性肺炎，其病因尚未完全明確。該病的臨床治療應(yīng)分階段進(jìn)行，其中輕、中度患者應(yīng)以口服抗纖維化藥物為主;而病情嚴(yán)重者則需進(jìn)行肺移植，平均存活時(shí)間僅為2～5年[12]。

有研究表明，IPF的主要病理改變是肺泡上皮損傷后的異常修復(fù)，即肺成纖維細(xì)胞的增殖活化和由此而產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)的過(guò)度沉積[2]。近來(lái)有研究證實(shí)，纖維化疾病中活化的肌成纖維細(xì)胞的另一個(gè)來(lái)源是內(nèi)皮細(xì)胞[13]。雖然肌成纖維細(xì)胞是纖維化疾病中關(guān)鍵的細(xì)胞成分，但有研究指出，從內(nèi)皮細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)化并不需要完全的轉(zhuǎn)分化即可引發(fā)病理性纖維化的發(fā)生[14]。在這一過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞將獲得間質(zhì)細(xì)胞表型，繼而表達(dá)α-SMA、FSP-1等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，同時(shí)CD31、VE-cadherin等內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)則明顯下調(diào)[4，15]。其中，CD31是內(nèi)皮細(xì)胞存在的重要標(biāo)志，可顯示較小的微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成情況[16];VE-cadherin是調(diào)節(jié)微血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附、連接的重要蛋白，當(dāng)肺纖維化損傷發(fā)生時(shí)，其可迅速磷酸化，繼而引起內(nèi)皮細(xì)胞間黏附作用失調(diào)，最終導(dǎo)致微血管屏障受損[17];α-SMA是成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，其表達(dá)水平的高低可用以評(píng)估肌纖維母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化程度[18];FSP-1作為肺成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物之一，在正常肺組織中表達(dá)較少，而在博來(lái)霉素誘導(dǎo)的IPF中呈持續(xù)升高，可作為研究該病發(fā)病機(jī)制的指標(biāo)之一[19]。

Notch信號(hào)通路（包括DLL4/Notch4等）是一種高度保守的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，參與了肺細(xì)胞生物功能的調(diào)節(jié)，與IPF關(guān)系密切，已有證據(jù)表明該信號(hào)通路可影響內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移及分化，在EndMT過(guò)程中發(fā)揮了重要作用[5-6，20-21]。在TGF-β誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化中，整合素avβ3可激活Notch信號(hào)通路，活化FSP-1編碼基因啟動(dòng)子，使其蛋白表達(dá)增強(qiáng)，從而使內(nèi)皮細(xì)胞獲得平滑肌細(xì)胞樣的特征，大大增強(qiáng)了細(xì)胞的遷移能力;阻斷Notch信號(hào)通路后，內(nèi)皮細(xì)胞CD31表達(dá)下調(diào)，α-SMA表達(dá)上調(diào)，EndMT受到抑制[22-23]。Notch4特異性分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，為血管內(nèi)皮細(xì)胞的特異性受體，在血管發(fā)育的后期參與調(diào)節(jié)血管的形成，抑制晚期血管的分支發(fā)育[24]。DLL4是Notch信號(hào)通路的重要配體之一，特異性表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞中，可通過(guò)參與動(dòng)靜脈分化、誘導(dǎo)血管尖細(xì)胞來(lái)控制細(xì)胞數(shù)目、血管分支數(shù)和血管密度，從而在血管構(gòu)建和穩(wěn)態(tài)維護(hù)中發(fā)揮重要作用[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)大鼠發(fā)生IPF時(shí)，其體內(nèi)的DLL4/Notch4信號(hào)通路被激活，從而導(dǎo)致肺組織內(nèi)血管新生和重構(gòu)明顯失控，是IPF發(fā)生和進(jìn)展的重要通路之一[20]。

中醫(yī)將IPF歸于“肺痹”“肺痿”等癥范疇。在該病的早期階段多因外邪阻絡(luò)、氣血凝滯致肺絡(luò)閉阻，多歸于“肺痹”范疇;在該病的后期因出現(xiàn)肺氣虧虛、肺臟失去津液濡養(yǎng)致肺葉萎縮，則多歸于“肺痿”范疇[26]。補(bǔ)陽(yáng)還五湯首載于清代的《醫(yī)林改錯(cuò)》，該方中黃芪益氣活血化瘀，為君藥;當(dāng)歸活血通絡(luò)，為臣藥;赤芍、桃仁、紅花、川芎協(xié)同當(dāng)歸活血祛瘀通絡(luò)，地龍周行全身、通經(jīng)活絡(luò)，共為佐藥;諸藥通補(bǔ)兼用，行益氣、活血、通絡(luò)之效，與IPF核心病機(jī)“氣虛血瘀，肺絡(luò)閉阻”一致，符合中醫(yī)“方-證要素對(duì)應(yīng)”的治療原則[27]。近年來(lái)，補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療IPF的效果受到臨床認(rèn)可，關(guān)于該方藥理作用的研究也逐漸深入?，F(xiàn)代藥理研究表明，補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)實(shí)驗(yàn)性IPF具有較好的防治作用，可通過(guò)改善微循環(huán)、抑制過(guò)敏介質(zhì)釋放來(lái)延緩IPF的進(jìn)程[28]。為此，本研究以療效較好的地塞米松[29]為陽(yáng)性對(duì)照，在前期研究的基礎(chǔ)上探討了補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)IPF模型大鼠肺組織中內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)以及DLL4/Notch4信號(hào)通路的影響。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織中CD31、VE-cadherin的表達(dá)水平均較正常組顯著降低，α-SMA、FSP-1的表達(dá)水平均較正常組顯著升高，提示模型復(fù)制成功。給予不同劑量的補(bǔ)陽(yáng)還五湯后，各給藥組大鼠CD31、VE-cadherin的表達(dá)水平均較模型組顯著升高，α-SMA、FSP-1的表達(dá)水平均顯著降低，表明補(bǔ)陽(yáng)還五湯可不同程度地上調(diào)CD31、VE-cadherin的表達(dá)，下調(diào)α-SMA、FSP-1的表達(dá)，提示該方治療IPF的作用可能與抑制EndMT有關(guān)。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織中Notch4、DLL4的表達(dá)水平均顯著升高，提示IPF發(fā)生后，DLL4/Notch4信號(hào)通路被激活，血管內(nèi)皮細(xì)胞分化增多，使得結(jié)構(gòu)及功能完整的血管的形成受到抑制，造成肺纖維化進(jìn)一步加重。給予不同劑量的補(bǔ)陽(yáng)還五湯后，大鼠Notch4、DLL4的表達(dá)水平均顯著降低，提示補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療IPF的機(jī)制可能與抑制DLL4/Notch4信號(hào)通路有關(guān)。此外，本研究結(jié)果還顯示，補(bǔ)陽(yáng)還五湯低劑量組大鼠肺組織中CD31、VE-cadherin的表達(dá)水平顯著低于地塞米松組，α-SMA、FSP-1、Notch4、DLL4的表達(dá)水平均顯著高于地塞米松組，而中、高各劑量組與地塞米松組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示中、高劑量補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)IPF模型大鼠的改善作用與地塞米松相當(dāng)。

綜上所述，補(bǔ)陽(yáng)還五湯可通過(guò)干預(yù)EndMT來(lái)減輕模型大鼠的IPF，其機(jī)制可能與抑制DLL4/Notch4信號(hào)通路有關(guān)，但其具體靶點(diǎn)和機(jī)制有待后續(xù)研究進(jìn)一步確認(rèn)。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 周瑛，李惠萍. 2018 ATS/ERS/JRS/ALAT特發(fā)性肺纖維化診斷指南解讀[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2018，39（6）：30-33.

[ 2 ] RICHELDI L，COLLARD HR，JONES MG. Idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Lancet，2017，389（10082）：1941- 1952.

[ 3 ] PIERA-VELAZQUEZ S，LI Z，JIMENEZ SA. Role of endothelial-mesenchymal transition（EndMT）in the pathogenesis of fibrotic disorders[J]. Am J Pathol，2011，179（3）：1074-1080.

[ 4 ] 何光庭，吳潔，黃巧冰.內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的信號(hào)調(diào)節(jié)和生物學(xué)意義[J].中國(guó)循環(huán)雜志，2016，31（6）：622-624.

[ 5 ] POST LC，TERNET M，HOGAN BL. Notch/Delta expression in the developing mouse lung[J]. Mech Dev，2000，98（1）：95-98.

[ 6 ] CLAXTON S，F(xiàn)RUTTIGER M. Periodic Delta-like 4 expression in developing retinal arteries[J]. Gene Expr Patterns，2004，5（1）：123-127.

[ 7 ] 陳煒，胡夢(mèng)娟.中醫(yī)藥干預(yù)特發(fā)性肺纖維化血管新生相關(guān)通路研究進(jìn)展[J].遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2018，20（10）：19-22.

[ 8 ] 魏萊，王澤玉.補(bǔ)陽(yáng)還五湯防治特發(fā)性肺纖維化的研究進(jìn)展[J].中國(guó)老年學(xué)雜志，2019，39（5）：1252-1256.

[ 9 ] 楊晗，王飛，王全林，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1/Smad3表達(dá)的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（24）：240-244.

[10] 楊昆.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)博來(lái)霉素所致大鼠特發(fā)性肺纖維化的保護(hù)作用及機(jī)制研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2016.

[11] 渠景連，楊邯捷，趙惠亮.補(bǔ)陽(yáng)還五湯含藥血清對(duì)人肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2019，25（19）：1-9.

[12] XAUBET A，ANCOCHEA J，MOLINA-MOLINA M.? ? Idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Med Clin：Barc，2017，148（4）：170-175.

[13] KARASEK MA. Does transformation of microvascular endothelial cells into myofibroblasts play a key role in the etiology and pathology of fibrotic disease？ [J]. Med Hypotheses，2007，68（3）：650-655.

[14] MOORE-MORRIS T，GUIMAR?ES-CAMBOA N，BANERJEE I，et al. Resident fibroblast lineages mediate pressure overload-induced cardiac fibrosis[J]. J Clin Invest，2014，124（7）：2921-2934.

[15] PARDALI E，SANCHEZ-DUFFHUES G，GOMEZ-PUERTO MC，et al. TGF-β-induced endothelial-mesenchymal transition in fibrotic diseases[J]. Int J Mol Sci，2017. DOI：10.3390/ijms18102157.

[16] 王桂.丹貝益肺顆粒對(duì)特發(fā)性肺纖維化大鼠CD31和CD34蛋白表達(dá)水平的影響[D].哈爾濱：黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，2018.

[17] 曹芳，李海濤，王明明.大黃酸對(duì)油酸所致急性肺損傷大鼠治療作用及其對(duì)肺部微血管屏障與炎癥反應(yīng)的影響[J].貴州醫(yī)藥，2018，42（8）：917-921.

[18] 黃彥銘.補(bǔ)陽(yáng)還五湯對(duì)肺纖維化大鼠肺泡灌洗液中HMGB1、IL-8、α-SMA水平影響的實(shí)驗(yàn)研究[D].成都：成都中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[19] LAWSON WE，POLOSUKHIN VV，ZOIA O，et al. Cha- racterization of fibroblast-specific protein 1 in pulmonary fibrosis[J]. Am J Respir Crit Care Med，2005，171（8）：899-907.

[20] 渠景連.養(yǎng)肺通絡(luò)法干預(yù)Notch信號(hào)通路防治肺纖維化的機(jī)制研究[D].南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2015.

[21] 劉曉夏.Dll4/Notch4-ephrin-B2調(diào)控血管內(nèi)皮祖細(xì)胞改善胎盤(pán)血管內(nèi)皮損傷的研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2017.

[22] WANG W，WANG Z，TIAN D，et al. Integrin β3 mediates the endothelial-to-mesenchymal transition via the Notch pathway[J]. Cell Physiol Biochem，2018. DOI：10.1159/000493229.

[23] TIAN D，ZENG X，WANG W，et al. Protective effect of rapamycin on endothelial-to-mesenchymal transition in HUVECs through the Notch signaling pathway[J]. Vascul Pharmacol，2019. DOI：10.1016/j.vph.2018.10.004.

[24] WANG Y，YANG R，WANG X，et al. Evaluation of the correlation of vasculogenic mimicry，Notch4，DLL4，and KAI1/CD82 in the prediction of metastasis and prognosis in non-small cell lung cancer[J]. Medicine：Baltimore，2018. DOI：10.1097/MD.0000000000013817.

[25] 縱單單，陳平，陳燕. Notch信號(hào)通路在血管生成中的作用研究進(jìn)展[J].國(guó)際呼吸雜志，2012，32（4）：299-303.

[26] 王國(guó)琛，劉江彥.特發(fā)性肺纖維化中醫(yī)研究進(jìn)展[J].吉林中醫(yī)藥，2018，38（2）：243-245.

[27] 張川鋒，王振興，楊昆，等.依據(jù)“方-證要素對(duì)應(yīng)”分析補(bǔ)陽(yáng)還五湯治療肺纖維化疾病機(jī)制[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2018，29（6）：1406-1408.

[28] 楊昆，李勇華，王飛，等.補(bǔ)陽(yáng)還五湯防治特發(fā)性肺纖維化的作用及機(jī)制探討[J].北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2017，40（7）：550-557.

[29] 崔蘭鳳.中藥治療特發(fā)性肺纖維化隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的系統(tǒng)綜述和Meta分析[D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

（收稿日期：2019-01-18 修回日期：2019-07-12）

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