肝腎顆粒的制備、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及指紋圖譜研究

程杰 張屏 包保全 梁雨娜 唐雨晨 劉德旺

中圖分類號(hào) R944.2;R917 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2019）21-2913-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2019.21.08

摘 要 目的：制備肝腎顆粒，并初步擬定其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，建立其高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜。方法：以送料速度、壓輥速度、壓輥壓力、壓輥間隙為考察因素，顆粒成型率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化肝腎顆粒干法制粒工藝。根據(jù)2015年版《中國藥典》（四部）（以下簡(jiǎn)稱“藥典”）對(duì)其水分、粒度、溶化性進(jìn)行測(cè)定;采用薄層色譜定性鑒別肝腎顆粒中的枸杞子、黃芪、黨參;采用HPLC法定量測(cè)定肝腎顆粒中甜菜堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黨參炔苷的含量，并繪制10批肝腎顆粒的指紋圖譜。結(jié)果：肝腎顆粒干法制粒的最優(yōu)工藝為送料速度25 r/min、壓輥轉(zhuǎn)速8 r/min、壓輥壓力7 MPa、壓輥間隙1.1 mm，所制顆粒成型率為85.53%。肝腎顆粒的水分、粒度、溶化性均符合藥典標(biāo)準(zhǔn);枸杞子、黃芪、黨參供試品薄層色譜在對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn);甜菜堿的進(jìn)樣量線性范圍為4.32～8.64 μg，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黨參炔苷的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為5～30、10～60 ? ?μg/mL，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性（24 h）試驗(yàn)的RSD均<2.0%（n=5），平均回收率分別為97.02%、99.25%、101.04%（RSD均<1.7%，n=6或9），含量分別為4.298、0.054、0.025 mg/g;10批肝腎顆粒樣品HPLC指紋圖譜與對(duì)照指紋圖譜相似度均>0.95。結(jié)論：優(yōu)化后的肝腎顆粒制粒工藝穩(wěn)定、可行，所建立的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及HPLC指紋圖譜可為肝腎顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 肝腎顆粒;干法制粒;制備;正交試驗(yàn);含量測(cè)定;質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);指紋圖譜

Study on Preparation， Quality Standard and Fingerprint of Ganshen Granules

CHENG Jie，ZHANG Ping，BAO Baoquan，LIANG Yuna，TANG Yuchen，LIU Dewang（College of Pharmacy， Inner Mongolia Medical University， Hohhot 010110， China）

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To prepare Ganshen granules， formulate its quality standards primarily and establish its HPLC fingerprint. METHODS： Using feeding speed， roller speed， roller pressure and roller clearance as factor， grain forming rate as index， single factor test and orthogonal test were used to optimize the granulation technology of Ganshen granules. According to 2015 edition of Chinese Pharmacopeia （part Ⅳ） （shorted for pharmacopeia）， moisture， granulation and dissolution were determined. TLC was used for the qualitative identification of Lycium barbarum， Astragalus membranaceus， Codonopsis pilosula in the Ganshen granules. HPLC method was used to determine the contents of betaine， calycosin-7-glucoside and lobetyolin in Ganshen granules. Fingerprints of 10 batches of Ganshen granules were drawn. RESULTS： The optimal dry granulation technology of Ganshen granules included that 25 r/min feeding speed， 8 r/min roller speed， 7 MPa roller pressure and 1.1 mm roller clearance， The grain forming rate is 85.83%. The moisture， granulation and solubility of Ganshen granule were all in line with pharmacopeia standard. TLC of L. barbarum， A. membranaceus and C. pilosula showed the same color spots on the corresponding positions of the reference chromatogram. The linear range of sample mass of betaine is 4.32-8.64 μg， and the linear range of mass concentration of calycosin-7-glucoside and lobetyolin were 5-30 and 10-60 μg/mL， respectively. RSDs of precision， reproducibility and stability tests （24 h） were all lower than 2.0% （n=5）. Average recoveries were 97.02%， 99.25% and 101.04% （all RSD<1.7%， n=6 or n=9）. The contents of them were 4.298、0.054、0.025 mg/g， respectively. The similarity of HPLC fingerprints of 10 batches of Ganshen granules to control fingerprint was higher than 0.95. CONCLUSIONS： The optimal granulation technology of Ganshen granule is stable and feasible， and established quality standard and HPLC fingerprint can provide reference for quality control of Ganshen granule.

KEYWORDS ? Ganshen granules; Dry granulation; Preparation; Orthogonal test; Content determination; Quality standard; Fingerprint

肝腎顆粒（國藥準(zhǔn)字Z20080369）由枸杞子、黃芪、黨參、麥冬、阿膠五味藥加水煎煮，煎液濃縮至清膏，加入輔料，制粒、干燥、整粒制成。方中枸杞子為君藥，黨參和阿膠為臣藥，黃芪為佐藥，麥冬為使藥。本品具有益肝明目、滋陰補(bǔ)腎的療效，用于腎陰不足、氣血兩虧、目?；璋?、心煩失眠、肢倦乏力、腰腿酸軟等。甜菜堿是枸杞子中主要有效成分，具有調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓、促進(jìn)脂肪代謝和蛋白質(zhì)合成等作用[1-2]。黨參炔苷是黨參的主要有效成分[3-4]。黃芪具有顯著的免疫增強(qiáng)作用，其中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷作為黃芪提升免疫的主要活性成分[5-6]，是控制黃芪質(zhì)量的重要指標(biāo)。

受新藥研發(fā)時(shí)期制藥工藝技術(shù)和生產(chǎn)設(shè)備水平的限制，肝腎顆粒舊工藝是在清膏中加入輔料糊精直接濕法制粒，在烘箱中干燥后，整粒，制得顆粒，制粒過程中易黏結(jié)成塊，顆粒成型率低，產(chǎn)品生產(chǎn)存在效率低、成本高和成品質(zhì)量穩(wěn)定性差等缺陷，為此，針對(duì)上述問題需提出工藝變更和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升的解決方法。

本研究在保持提取工藝和輔料不變的條件下，采用噴霧干燥技術(shù)得到原料粉末，并用干法制粒工藝直接制粒。以送料速度、壓輥速度、壓輥壓力、壓輥間隙為考察因素，顆粒成型率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)優(yōu)化肝腎顆粒干法制粒工藝。原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用薄層色譜掃描法對(duì)枸杞子中甜菜堿進(jìn)行了含量測(cè)定，薄層色譜法對(duì)黃芪進(jìn)行了定性鑒別[7]，為保證工藝變更以后的產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定可靠，筆者對(duì)原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了提升。根據(jù)2015年版《中國藥典》（四部）（以下簡(jiǎn)稱“藥典”）對(duì)所制肝腎顆粒的水分、粒度、溶化性進(jìn)行測(cè)定;采用薄層色譜定性鑒別肝腎顆粒中的枸杞子、黃芪、黨參;采用HPLC法定量測(cè)定肝腎顆粒中甜菜堿、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黨參炔苷的含量，并繪制10批肝腎顆粒的指紋圖譜，以期為肝腎顆粒的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Nexera液相色譜儀，包括LC-20AD-XR四元梯度泵、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、CTO-10AS柱溫箱、SPD-M20A紫外檢測(cè)器、ELSD-LTⅡ蒸發(fā)光檢測(cè)器（ELSD）、RID- 20A示差檢測(cè)器（日本Shimadzu公司）;AB135-S分析天平（德國Sartorius公司）;;GL-25干法制粒機(jī)（江蘇張家港市開創(chuàng)機(jī)械制造有限公司）;DHG-9123A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）;B-290噴霧干燥儀（瑞士Buchi公司）。

1.2 藥品與試劑

甜菜堿對(duì)照品（批號(hào)：110894-201604，純度：98%）、枸杞子對(duì)照藥材（批號(hào)：121072-201611）、黨參炔苷對(duì)照品（批號(hào)：111732-201607，純度：98%）、黃芪甲苷對(duì)照品（批號(hào)：110781-201616，純度：98%）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品（批號(hào)：111920-201606，純度：98%）均購自中國食品藥品檢定研究院;肝腎顆粒提取物濃縮液、肝腎顆粒舊工藝樣品（批號(hào)：201801、201802）、肝腎顆粒缺枸杞子陰性樣品、肝腎顆粒缺黨參陰性樣品、肝腎顆粒缺黃芪陰性樣品均由內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)公司提供;甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 肝腎顆粒的制粒與質(zhì)量評(píng)價(jià)方法

2.1.1 肝腎顆粒的制粒 取肝腎顆粒提取物濃縮液，減壓濃縮至相對(duì)密度為1.10（60 ℃時(shí)測(cè)）的清膏，加入3%糊精，均勻攪拌后，噴霧干燥制成原料粉（進(jìn)風(fēng)溫度：190～200 ℃，出風(fēng)溫度：70～80 ℃），調(diào)節(jié)好干法制粒機(jī)壓輥壓力、壓輥轉(zhuǎn)速、送料速度和壓輥間隙參數(shù)后，將原料粉加入到干法制粒機(jī)中制粒，再用1號(hào)篩整粒，即得。

2.1.2 顆粒成型率的測(cè)定 取所制顆粒15 g，稱定質(zhì)量，依次通過1號(hào)篩和5號(hào)篩。收集通過1號(hào)篩但不能通過5號(hào)篩的顆粒，稱定質(zhì)量，顆粒成型率（%）=通過1號(hào)篩但不能通過5號(hào)篩的顆粒的質(zhì)量/顆?？傎|(zhì)量×100%。

2.2 肝腎顆粒制粒單因素考察

參考相關(guān)文獻(xiàn)研究[8-14]，干法制粒工藝中壓輥壓力、壓輥轉(zhuǎn)速、送料速度和壓輥間隙等工藝條件對(duì)顆粒成型率影響較大，因此針對(duì)上述影響條件進(jìn)行單因素考察。

2.2.1 壓輥壓力 稱取肝腎顆粒原料粉適量，固定壓輥轉(zhuǎn)速8 r/min、送料速度15 r/min和壓輥間隙1.2 mm，分別考察壓輥壓力4、5、6、7、8和9 MPa對(duì)顆粒成型率的影響。結(jié)果，不同壓輥壓力所制顆粒的顆粒成型率分別為45.6%、55.8%、65.3%、75.1%、76.9%和78.3%，試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)壓輥壓力增加到8～9 MPa時(shí)，顆粒成型率增加速度趨于平緩，且在9 MPa時(shí)軋輪間的固體條出現(xiàn)不均的現(xiàn)象，導(dǎo)致制出的顆粒產(chǎn)生色差，綜上，選擇壓輥壓力8 MPa進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2.2 壓輥轉(zhuǎn)速 稱取肝腎顆粒原料粉適量，固定壓輥間隙1.2 mm和送料速度15 r/min，設(shè)定壓輥壓力8 MPa，分別考察壓輥轉(zhuǎn)速3、5、8、12、14和16 r/min對(duì)顆粒成型率的影響。結(jié)果，不同壓輥轉(zhuǎn)速所制顆粒的顆粒成型率分別為55.3%、69.6%、72.3%、75.6%、68.3%和60.5%，因此，選擇壓輥轉(zhuǎn)速12 r/min進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2.3 送料速度 稱取肝腎顆粒原料粉適量，固定壓輥間隙12 mm，壓輥壓力8 MPa，壓輥轉(zhuǎn)速12 r/min，分別考察送料速度10、15、25、35、45和55 r/min對(duì)顆粒成型率的影響。結(jié)果，不同送料速度所制顆粒的顆粒成型率分別為63.9%、70.9%、78.8%、80.6%、73.9%、65.8%，因此，選擇送料速度35 r/min進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2.4 壓輥間隙 稱取肝腎顆粒原料粉適量，固定壓輥壓力8 MPa，壓輥轉(zhuǎn)速12 r/min，送料速度35 r/min，考察壓輥間隙0.8、0.9、1.0、1.1、1.2和1.3 mm對(duì)顆粒成型率的影響。結(jié)果，不同壓輥間隙所制顆粒的顆粒成型率分別為70.3%、75.3%、78.8%、80.6%、72.9%和59.3%。因此，選擇壓輥間隙1.1 mm進(jìn)一步優(yōu)化。

2.3 正交試驗(yàn)優(yōu)化肝腎顆粒制粒工藝

2.3.1 正交試驗(yàn) 按“2.1.1”項(xiàng)下方法，制備肝腎顆粒原料粉90 kg，平均分成9份，進(jìn)行干法制粒工藝正交試驗(yàn)。根據(jù)單因素考察結(jié)果，確定影響干法制粒顆粒質(zhì)量的主要因素為以下4個(gè)因素：送料速度（A）、壓輥轉(zhuǎn)速（B）、壓輥壓力（C）、壓輥間隙（D）。每個(gè)因素設(shè)3個(gè)水平，采用正交設(shè)計(jì)表L9（34）進(jìn)行試驗(yàn)，以顆粒成型率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行正交試驗(yàn)。因素與水平見表1，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見2，方差分析見表3。

2.3.2 結(jié)果分析 由表2可知，以顆粒成型率作為指標(biāo)，其影響效果大小依次為 A>C>B>D，即送料速度>壓輥壓力>壓輥轉(zhuǎn)速>壓輥間隙;由表3方差分析結(jié)果可知，因素A、B、C具有極顯著性影響，因素D具有顯著性影響。因此，最優(yōu)制粒工藝條件為A2B2C1D3，即送料速度25 r/min，壓輥轉(zhuǎn)速為8 r/min，壓輥壓力為7 MPa，壓輥間隙為1.1 mm。

2.3.3 驗(yàn)證試驗(yàn) 按“2.1.1”項(xiàng)下方法，制備肝腎顆粒原料粉300 kg，再按“2.4.2”項(xiàng)下最優(yōu)制粒工藝制粒3 批（批號(hào)為201803、201804、201805），每批投原料粉100 kg，測(cè)定顆粒成型率。結(jié)果，3 批肝腎顆粒的平均顆粒成型率為85.53%，RSD為1.24%（n=3），表明該工藝穩(wěn)定、可靠。

2.4 肝腎顆粒的檢查

2.4.1 水分測(cè)定 稱取所制肝腎顆粒3份（批號(hào)：201803），每份10 g，參照2015 年版《中國藥典》（四部）通則0832 中水分測(cè)定法的第一法[7]進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果，肝腎顆粒的水分含量分別為4.86%、4.90%、4.52%，符合2015 年版《中國藥典》（四部）“顆粒劑”項(xiàng)下水分≤8.0%的要求。

2.4.2 粒度測(cè)定 稱取所制肝腎顆粒（批號(hào)：201803）3份，每份10 g，參照2015 年版《中國藥典》（四部）通則0982 中雙篩分法測(cè)定[7]。結(jié)果，肝腎顆粒的粒度分別為9.52%、9.66%、9.85%，符合2015 年版《中國藥典》（四部）“顆粒劑”項(xiàng)下粒度≤15%的要求。

2.4.3 溶化性測(cè)定 稱取所制肝腎顆粒（批號(hào)：201803）3份，每份10 g，放入3個(gè)相同燒杯中加熱水200 mL，玻璃棒同時(shí)攪拌，觀察顆粒溶化情況并測(cè)定其完全溶化所用時(shí)間。結(jié)果，肝腎顆粒在25 s內(nèi)全部溶化，符合2015年版《中國藥典》（四部）“顆粒劑”項(xiàng)下溶化性要求[7]。

2.5 肝腎顆粒的定性鑒別

2.5.1 枸杞子的薄層鑒別 取肝腎顆粒新工藝樣品3批（批號(hào)：201805、201806、201807），每批分別取1 g，加水35 mL，煮沸15 min，放冷，濾過，濾液用15 mL乙酸乙酯振搖提取，取乙酸乙酯部分濃縮至1 mL，得供試品溶液。同法制備缺枸杞子的陰性樣品溶液、肝腎顆粒舊工藝樣品（批號(hào)：201801）溶液。另取枸杞子對(duì)照藥材0.5 g，同法制成枸杞子對(duì)照藥材溶液。參照2015年版《中國藥典》（四部）通則0502進(jìn)行薄層色譜試驗(yàn)[7]，吸取上述溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-三氯甲烷-甲酸（3 ∶ 2 ∶ 1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外光燈（365 nm）下檢視。結(jié)果，供試品和舊工藝樣品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。枸杞子的薄層色譜見圖1。

2.5.2 黃芪的薄層色譜鑒別 取肝腎顆粒新工藝樣品3批（批號(hào)：201805、201806、201807），每批分取10 g，加甲醇80 mL，超聲（頻率：40 KHz，功率：400 W，下同）提取30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)影痹囈?5 mL溶解，再用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次15 mL，合并正丁醇溶液，蒸干，殘?jiān)铀? mL溶解，過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm），先用50 mL水洗脫，棄去水液，再用30 mL 40%乙醇洗脫，棄去洗脫液，最后用80 mL 70%乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)?.5 mL甲醇溶解，得供試品溶液。同法制備缺黃芪的陰性樣品溶液、肝腎顆粒舊工藝樣品（批號(hào)：201801）溶液。另取黃芪甲苷對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。參照2015年版《中國藥典》（四部）通則0502進(jìn)行薄層色譜試驗(yàn)[7]，吸取供試品溶液10 μL、對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13 ∶ 7 ∶ 2，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，于日光下檢視。結(jié)果，供試品和舊工藝樣品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的棕褐色斑點(diǎn)。黃芪的薄層色譜圖見圖2。

2.5.3 黨參的薄層色譜鑒別 取肝腎顆粒新工藝樣品3批（批號(hào)：201805、201806、201807），每批分取10 g，加甲醇80 mL，超聲處理30 min，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)影痹囈?5 mL溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次15 mL，合并正丁醇溶液，蒸干，殘?jiān)铀?5 mL溶解，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為10 cm），先用50 mL水洗脫，棄去水液，再用50 mL 50%乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状? mL溶解，得供試品溶液。同法制備缺黨參的陰性樣品溶液、肝腎顆粒舊工藝樣品（批號(hào)：201801）溶液。另取黨參炔苷對(duì)照品，加甲醇制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對(duì)照品溶液。參照2015年版《中國藥典》（四部）通則0502進(jìn)行薄層色譜試驗(yàn)[7]，吸取供試品溶液10 μL、對(duì)照品溶液2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（7 ∶ 1 ∶ 0.5， ? V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，在 105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，于日光下檢視。結(jié)果，供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)。黨參的薄層色譜圖見圖3。

2.6 甜菜堿的含量測(cè)定

2.6.1 色譜條件 色譜柱：Sepax-HP-Amino（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈-水（35 ∶ 65，V/V）;流速：1.0 mL/min;柱溫：35 ℃;檢測(cè)器：ELSD;漂移管溫度：40 ℃;進(jìn)樣量：12 μL。

2.6.2 甜菜堿對(duì)照品溶液的制備 取甜菜堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成對(duì)照品貯備液。精密量取對(duì)照品貯備液0.18 mL，置于2 mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得甜菜堿質(zhì)量濃度為0.540 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.6.3 供試品溶液的制備 取肝腎顆粒新工藝樣品（批號(hào)：201806）0.6 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，加甲醇30 mL，搖勻，超聲處理30 min，放置室溫，濾過，用甲醇適量洗滌濾渣及容器，合并濾液，蒸干，殘?jiān)蛹状歼m量溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.6.4 陰性對(duì)照溶液的制備 同“2.6.3”項(xiàng)下方法制備缺枸杞子陰性對(duì)照溶液。

2.6.5 系統(tǒng)適用性考察 取“2.6.2”項(xiàng)下甜菜堿對(duì)照品溶液和“2.6.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，甜菜堿與相鄰峰間分離度均大于1.5，以甜菜堿峰計(jì)理論板數(shù)>4 000，陰性對(duì)照在與對(duì)照品色譜保留時(shí)間相同的位置上無色譜峰出現(xiàn)，表明本方法專屬性良好。甜菜堿的高效液相色譜圖見圖4。

2.6.6 線性關(guān)系考察 分別精密吸取甜菜堿對(duì)照品溶液8、10、12、14和16 μL注入色譜儀，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品進(jìn)樣量對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)（x）、峰面積對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行回歸分析，得甜菜堿的回歸方程為y=1.050x+5.603（r=0.999 1），表明甜菜堿進(jìn)樣量在4.32～8.64 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.7 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.6.2”項(xiàng)下甜菜堿對(duì)照品溶液12 μL，按“2.6.1“項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定 5次，記錄峰面積。結(jié)果，甜菜堿峰面積的 RSD 為 0.05%（n=5），表明儀器的精密度良好。

2.6.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.6.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液共5份，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，甜菜堿峰面積的 RSD為1.33%（n=5），表明本方法重復(fù)性良好。

2.6.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.6.2”項(xiàng)下供試品溶液，室溫下放置2、4、6、8、12、24 h后分別按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，甜菜堿峰面積的RSD為0.07%（n=6），表明供試品溶液在室溫條件下放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.10 加樣回收試驗(yàn) 稱取已知含量的肝腎顆粒新工藝樣品（批號(hào)：201806）共9份，每份約0.3 g，精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，分別按樣品中甜菜堿含量的80%、100%、120%加入對(duì)照品，按“2.6.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并計(jì)算平均回收率。結(jié)果，甜菜堿平均回收率為97.02%（RSD=0.79%，n=9）。

2.6.11 樣品含量測(cè)定 分別稱取10批肝腎顆粒樣品（批號(hào)：201801、201802、201803、201804、201805、201806、201807、201808、201809和201810），每份約0.6 g，精密稱定，按“2.6.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.6.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果10批肝腎顆粒樣品中甜菜堿平均含量為4.298 mg/g。

2.7 黨參炔苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測(cè)定

2.7.1 色譜條件 色譜柱：Apollo C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動(dòng)相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫;流速：1.0 mL/min;檢測(cè)波長：270 nm，柱溫：35 ℃;進(jìn)樣量：10 ? ? ? ?μL。梯度洗脫條件見表4。

2.7.2 混合對(duì)照品溶液的制備 取黨參炔苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含黨參炔苷0.2 mg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.1 mg的溶液，即得。

2.7.3 供試品溶液的制備 稱取肝腎顆粒新工藝樣品（批號(hào)：201806）3 g，精密稱定，置于錐形瓶中，加入甲醇50 mL，超聲處理30 min，取續(xù)濾液，蒸干，殘?jiān)影痹囈?5 mL溶解，水飽和正丁醇萃取4次，每次25 mL，合并正丁醇層，蒸干，殘?jiān)铀? mL溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為10 cm），以水50 mL洗脫，棄去洗脫液，再以50 mL 30%乙醇洗脫，棄去洗脫液，最后以80 mL 80%乙醇洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙?，并? mL量瓶中定容搖勻，即得。

2.7.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取“2.7.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液和“2.7.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。結(jié)果，黨參炔苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷與相鄰峰間分離度均大于 1.5，以黨參炔苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷峰計(jì)理論板數(shù)計(jì)均>4 000，黨參炔苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的高效液相色譜圖譜見圖5。

2.7.5 線性關(guān)系考察 分別精密量取“2.7.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液1.5、1.25、1.0、0.5、0.25 mL，分別置于5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品系列溶液。再取系列溶液按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以對(duì)照品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行回歸分析，得黨參炔苷回歸方程為y=12 479x+6 279.18（r=0.999 4）;毛蕊異黃酮葡萄糖苷的回歸方程為y=11 606x-3 023.32（r=0.999 1）。結(jié)果表明，黨參炔苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的檢測(cè)質(zhì)量濃度分別在 10～60、5～30 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.7.6 精密度試驗(yàn) 取“2.7.3”項(xiàng)下供試品溶液適量，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定5次，記錄黨參炔苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果，黨參炔苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的保留時(shí)間和峰面積的RSD值均<1.96%（n=5），表明本方法精密度良好。

2.7.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.7.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別于室溫下放置0、4、8、12和24 h后，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄黨參炔苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果，黨參炔苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的保留時(shí)間和峰面積的RSD值均<2.15%（n=5），表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7.8 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共5份，再按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定，記錄黨參炔苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的保留時(shí)間和峰面積。結(jié)果，黨參炔苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷的保留時(shí)間和峰面積的RSD值均<2.01%（n=5），表明本方法重復(fù)性良好。

2.7.9 加樣回收試驗(yàn) 稱取肝腎顆粒（批號(hào)：201806）共6份，每份約1.5 g（已知含黨參炔苷0.053 mg/g、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.026 mg/g），精密稱定，分別置于具塞錐形瓶中，加入0.4 mL“2.7.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液（含黨參炔苷0.08 mg，毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.04 mg），按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算回收率。結(jié)果，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黨參炔苷平均回收率分別為 99.25%、101.04%，RSD 分別為1.62%、1.26%（n=6），表明方法準(zhǔn)確度良好。

2.7.10 樣品含量測(cè)定 分別稱取10批肝腎顆粒樣品（批號(hào)：201801、201802、201803、201804、201805、201806、201807、201808、201809和201810），每份約3 g，精密稱定，按“2.8.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，10批肝腎顆粒樣品中黨參炔苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷平均含量分別為0.054、0.025 mg/g，RSD分別為2.70%、2.46%（n=10）。

2.8 肝腎顆粒的指紋圖譜

由于檢測(cè)甜菜堿需要使用ELSD，但經(jīng)過前期預(yù)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，ELSD不適于肝腎顆粒指紋圖譜研究，經(jīng)綜合考慮，選用了在紫外條件下有特征吸收，并且以含量穩(wěn)定的黨參炔苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為后續(xù)肝腎顆粒指紋圖譜研究指標(biāo)。

2.8.1 HPLC指紋圖譜的生成 取10批（編號(hào)S1～S10，其中S1～S2為舊工藝樣品，S3～S10為新工藝樣品）肝腎顆粒各適量，按“2.7.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.7.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012A版）對(duì)10批肝腎顆粒樣品的HPLC圖譜進(jìn)行分析，得其HPLC指紋圖譜，設(shè)計(jì)時(shí)間窗寬度為0.20 min，以中位數(shù)法生成對(duì)照指紋圖譜。結(jié)果，肝腎顆粒HPLC疊加指紋圖譜見圖6，HPLC對(duì)照指紋圖譜見圖7。

2.8.2 相似度分析 采用《中藥指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012A版），以肝腎顆粒樣品HPLC對(duì)照指紋圖譜為參考，進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)。結(jié)果，S1～S10樣品與對(duì)照?qǐng)D譜相比相似度均大于0.95，符合指紋圖譜要求。

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)肝腎顆粒的成型工藝進(jìn)行了優(yōu)化，優(yōu)化后的工藝所制備的顆粒成型率為85.53%，且該工藝具有較好的穩(wěn)定性，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。采用薄層色譜法對(duì)肝腎顆粒中枸杞子、黃芪、黨參進(jìn)行定性鑒別，結(jié)果表明，枸杞子、黃芪、黨參色譜分離效果良好，斑點(diǎn)顯色清晰。之后筆者對(duì)肝腎顆粒的粒度、水分、溶化性等進(jìn)行了測(cè)定，也符合2015 年版《中國藥典》（四部）的相關(guān)質(zhì)量要求。

在前期甜菜堿的含量測(cè)定中，參考相關(guān)研究[15-16]對(duì)不同類型色譜柱、流動(dòng)相、檢測(cè)器進(jìn)行了考察，選擇 Welch XB-C8色譜柱、Sepax BR-C18色譜柱、Sepax-HP- Amino色譜柱對(duì)樣品進(jìn)行色譜分析，發(fā)現(xiàn)使用Sepax-HP- Amino色譜柱對(duì)樣品的分離效果好;考察甲醇-水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水溶液等流動(dòng)相的色譜分離效果，發(fā)現(xiàn)乙腈-水溶液的分離效果較好?？疾炝硕O管陣列（PDA）檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器、ELSD檢測(cè)器的靈敏度，發(fā)現(xiàn)采用ELSD檢測(cè)器靈敏度高，峰形分離較好，滿足含量測(cè)定要求。另外，筆者以黨參炔苷和毛蕊異黃酮葡萄糖苷作為質(zhì)控成分，建立肝腎顆粒HPLC指紋圖譜，結(jié)果，10批肝腎顆粒指紋圖譜的相似度均大于0.95。

綜上所述，本試驗(yàn)考察了肝腎顆粒的質(zhì)量相關(guān)項(xiàng)目，初步擬定了肝腎顆粒中指標(biāo)性成分甜菜堿的含量測(cè)定方法和黨參、枸杞子、黃芪的薄層鑒別方法，建立了肝腎顆粒的HPLC指紋圖譜，可為肝腎顆粒的質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2019-06-17 修回日期：2019-08-02）

（編輯：唐曉蓮）