水飛薊賓抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖和遷移能力

趙逸飛，萬靜，戴蕓

（武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中南醫(yī)院內(nèi)科，武漢 430071）

水飛薊賓抑制肝癌細(xì)胞HepG2增殖和遷移能力

趙逸飛，萬靜，戴蕓#*

（武漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬中南醫(yī)院內(nèi)科，武漢 430071）

目的探討水飛薊賓對肝癌細(xì)胞生長、增殖和遷移能力的影響。方法用含不同濃度水飛薊賓的培養(yǎng)基孵育HepG2細(xì)胞后，采用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，應(yīng)用MTT法、EdU摻入實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)法檢測細(xì)胞增殖能力，應(yīng)用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)分析水飛薊賓對HepG2遷移能力的影響。結(jié)果用不同濃度水飛薊賓刺激HepG2細(xì)胞后，倒置顯微鏡鏡檢顯示：水飛薊賓刺激使細(xì)胞數(shù)目減少，胞體皺縮變小，高濃度刺激時(shí)出現(xiàn)較多的死亡細(xì)胞。MTT分析、EdU增殖實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示：水飛薊賓刺激使細(xì)胞增殖能力顯著降低，細(xì)胞的克隆形成數(shù)顯著減少。細(xì)胞劃痕試驗(yàn)結(jié)果顯示：水飛薊賓對HepG2細(xì)胞的遷移爬行能力也產(chǎn)生明顯抑制作用。結(jié)論水飛薊賓能抑制HepG2細(xì)胞的增殖和遷移能力，這可能是其發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制之一。

水飛薊賓；肝癌細(xì)胞HepG2；增殖；遷移

水飛薊素（silymarin，SM）是從植物水飛薊（silybum marianum）中提取的一種黃酮類抗氧化劑。在水飛薊素的各組分中水飛薊賓（silibinin，SB）含量最多，生物活性也最強(qiáng)，其分子式見圖1。水飛薊賓具有抗脂質(zhì)過氧化、清除自由基、維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性、促進(jìn)肝細(xì)胞再生及降血脂等作用，具有較強(qiáng)的肝臟保護(hù)作用，臨床上常用來治療肝纖維化、乙醇相關(guān)性肝病[1]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓可以通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞周期阻滯和凋亡、抑制新生血管生成等機(jī)制，抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖作用[2,3]，但目前對其抗腫瘤的機(jī)制尚無統(tǒng)一認(rèn)識。為探討水飛薊賓對肝癌細(xì)胞增殖和遷移力的影響，我們對水飛薊賓在人肝癌細(xì)胞系HepG2的作用進(jìn)行了初步研究，探討其抑制腫瘤細(xì)胞的可能機(jī)制及其應(yīng)用前景。

圖1 水飛薊賓的分子式Fig.1 Chemical structure of silybinin

材料與方法

1 細(xì)胞培養(yǎng)和傳代

人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞由武漢大學(xué)附屬中南醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中心保存提供。采用高糖型DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，1%青霉素和1%鏈霉素）在37℃、含5% CO2 的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞密度接近80%時(shí)，用磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）洗滌細(xì)胞兩次，再加入胰酶消化細(xì)胞。將消化好的細(xì)胞分加到新的培養(yǎng)瓶中，以1∶3比例傳代培養(yǎng)。DMEM培養(yǎng)基購于GIBCO公司；胎牛血清購于杭州四季青生物工程有限公司。

2 試劑

水飛薊賓 (silibinin，MW482.44)、四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）購自Sigma公司。水飛薊賓用DMSO配制成150μmol/L儲存液，-20℃冷凍保存。使用時(shí)按需要用DMEM培養(yǎng)基配制成工作濃度。EdU（5-ethynyl-2’-deoxyuridine）試劑盒購自廣州銳博生物科技有限公司。

3 細(xì)胞增殖檢測

首先，采用MTT法測定水飛薊賓對HepG2細(xì)胞增殖的影響。培養(yǎng)HepG2細(xì)胞至對數(shù)生長期，常規(guī)消化計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至2×104個(gè)/ml，然后將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔100μl細(xì)胞懸液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。加入不同濃度水飛薊賓的細(xì)胞培養(yǎng)基100μl。設(shè)立陰性對照組（僅含DMSO），空白對照組（僅加入培養(yǎng)基），每組5個(gè)重復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)24h和48h。每天觀察細(xì)胞增殖情況，最后每孔加入20μl 的MTT（5mg/ml），37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，置于搖床上室溫振蕩10min，使紫色沉淀物完全溶解，用酶標(biāo)儀測定490nm處的光吸收值，參考波長為630nm, 分別繪制增殖曲線，并計(jì)算IC50值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

另外，采用EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖情況。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔 2×103細(xì)胞接種于96孔板中，培養(yǎng)至次日。加入不同濃度SM的細(xì)胞培養(yǎng)基100μL，設(shè)立陰性對照組（僅含DMSO），空白對照組（僅加入培養(yǎng)基），每組5個(gè)重復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48h。按照EdU試劑盒說明書提供的方法進(jìn)行熒光染色操作，用細(xì)胞培養(yǎng)基按1∶1000的比例稀釋EdU溶液加入培養(yǎng)板中孵育2h。細(xì)胞固定后，采用1× Apollo?染色反應(yīng)液孵育30min。最后采用Hoechst33342復(fù)染細(xì)胞核。于倒置熒光顯微鏡下觀測拍照。同一視野中，EdU摻入的細(xì)胞核在505nm波長激發(fā)光下發(fā)出紅色熒光，無EdU摻入的細(xì)胞核只能在400nm波長激發(fā)光下散發(fā)藍(lán)色熒光。每個(gè)孔內(nèi)隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域記錄，使用Image J軟件將同一視野下的圖片疊加，計(jì)算增殖細(xì)胞比例。紅色熒光細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的百分比代表細(xì)胞增殖能力。

4 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)

取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，接種100個(gè)細(xì)胞/孔于6孔板，分別采用含終濃度0, 25, 50 μmol/L的水飛薊賓培養(yǎng)基作用于細(xì)胞，并設(shè)立陰性對照組（培養(yǎng)基僅加DMSO），每組細(xì)胞設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，常規(guī)培養(yǎng)2～3周，待形成肉眼可見細(xì)胞集落時(shí)終止實(shí)驗(yàn)。4%多聚甲醛固定細(xì)胞后，結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)＞50個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。

5 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)

HepG2細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種于24孔板內(nèi)，常規(guī)培養(yǎng)至每孔細(xì)胞到達(dá)100%豐度。用滅菌的200μl tip頭垂直劃線，用PBS緩沖液清洗去懸浮細(xì)胞，重新加入1%胎牛血清和不同濃度的水飛薊賓的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24h，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色。用倒置顯微鏡觀察并記錄測量細(xì)胞劃痕間距，每個(gè)孔內(nèi)隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域記錄并測量，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx ± s）表示。比較兩組之間的均值用t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

結(jié) 果

1 水飛薊賓抑制HepG2細(xì)胞增殖

用終濃度分別為0、25、50、100μmol/L的水飛薊賓作用HepG2細(xì)胞48h后，倒置顯微鏡觀察可見隨著濃度的增加，細(xì)胞數(shù)目明顯減少，細(xì)胞形態(tài)異常，細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)為變圓、變皺縮；死亡細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞的生長明顯受到抑制。而空白對照組的細(xì)胞生長良好，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞數(shù)目和細(xì)胞密度逐漸增加（圖2）。

MTT法檢測顯示水飛薊賓對HepG2細(xì)胞系的增殖有顯著抑制作用，在24h和48h內(nèi)隨著水飛薊賓濃度的增加，其抑制HepG2細(xì)胞生長作用逐漸增強(qiáng)（圖3）。24h內(nèi)水飛薊賓的半數(shù)抑制濃度（IC50）為41.52μmol/L，48h的半數(shù)抑制濃度（IC50）為34.20μmol/L（圖3）。同時(shí)，采用EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測水飛薊賓對細(xì)胞的增殖能力的作用。結(jié)果表明，不同濃度的水飛薊賓對細(xì)胞的增殖均有抑制作用，水飛薊賓的濃度和細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)之間存在量效關(guān)系，其中對照組（僅加DMSO）細(xì)胞增殖率為（57.6±7.2）%，25μmol/L組細(xì)胞增殖率為（41.2±6.2）%，50μmol/L組增殖率為（28.2±4.2）%（圖4）。

2 水飛薊賓抑制HepG2細(xì)胞的克隆形成

克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，水飛薊賓對HepG2細(xì)胞的克隆形成有明顯的抑制作用。采用不同濃度SM作用于細(xì)胞2周后，其中空白對照組（僅加DMSO）為（124.5±11.2）個(gè)，25μmol/L組細(xì)胞集落形成數(shù)為（77.5±5.7）個(gè)，50μmol/L組空白對照組為（27.3±4.9）個(gè)，與對照組相比均存在顯著性差異；水飛薊賓處理組的細(xì)胞形成的細(xì)胞集落較小，細(xì)胞數(shù)較少（圖5）。

圖2 不同濃度水飛薊賓作用于HepG2細(xì)胞后形態(tài)學(xué)觀察。 A，對照組；B，25μmol/L組； C，50μmol/L組；D，100μmol/L組；比例尺，100μmFig. 2 The Morphological change of HepG2 cells treated with silibinin of diferent concentrations. A, control; B, 25μmol/L silibinin; C, 50μmol/L silibinin; D, 100μmol/L silibinin; scale bar, 100μm

圖3 MTT法檢測水飛薊賓對HepG2細(xì)胞增殖的影響Fig. 3 The efect of silibinin on the proliferation of HepG2 cells detected by MTT assay

圖4 EdU摻入實(shí)驗(yàn)檢測水飛薊賓對HepG2細(xì)胞增殖的影響。比例尺，50μmFig. 4 The efect of silibinin on the proliferation of HepG2 cells detected by EdU assay. Scale bar, 50μm

3 水飛薊賓抑制HepG2細(xì)胞的遷移

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，水飛薊賓對HepG2細(xì)胞的爬行遷移能力具有明顯抑制作用，經(jīng)過24h后，25μmol/L和50μmol/L 水飛薊賓組的細(xì)胞遷移距離明顯小于陰性對照組細(xì)胞（圖6）。

討 論

圖5 水飛薊賓對HepG2細(xì)胞克隆形成的影響Fig. 5 The efect of silibinin on the formation of HepG2 colonies

圖6 水飛薊賓對HepG2細(xì)胞遷移的影響。A，細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移；B，遷移率統(tǒng)計(jì)分析；*，0.01＜P ＜ 0.05；**，P ＜ 0.01；比例尺，200μmFig. 6 The efect of silibinin on the migration of HepG2 cells. A, scratch assay detection of cell migration; B, statistical analysis of the migration rate; *, 0.01＜P＜0.05; **, P＜0.01; scale bar, 200μm

水飛薊素是從菊科植物水飛薊、乳薊、朝鮮薊等中提取的黃酮類化合物，商品名為益肝靈、水林佳等。其中水飛薊賓為其最主要的生物活性成分，臨床上主要用于治療急、慢性肝炎、肝硬化及肝損傷，實(shí)踐證明水飛薊賓對肝損害具有一定的治療作用，對正常組織器官無明顯毒副作用并顯示良好的耐受性及極低的副作用[4,5]。近年來隨著水飛薊賓藥理學(xué)研究的不斷深入，其抗腫瘤作用日益引起人們的關(guān)注。人們發(fā)現(xiàn)水飛薊素具有抗腫瘤作用。水飛薊賓對各種上皮來源的腫瘤如肺癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、膀胱癌等均具有明顯抑制作用；而且水飛薊賓已進(jìn)入治療前列腺癌的I期臨床試驗(yàn)研究[6-8]。

本研究通過分析水飛薊賓對肝癌細(xì)胞系HepG2的生物行為的影響，探討了水飛薊賓對埃細(xì)胞的生長和遷移等行為的抑制作用。研究表明，水飛薊賓可以明顯抑制HepG2細(xì)胞的增殖，其藥效和藥代動力學(xué)表現(xiàn)出較為明顯的藥物濃度與時(shí)間依賴效應(yīng)。水飛薊賓的半數(shù)抑制濃度(IC50)為30～40μmol/L。HepG2細(xì)胞的生長和細(xì)胞形態(tài)與對照組細(xì)胞比較，存在明顯差異。同時(shí)，在細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓具有明顯的抑制作用，與對照組比較發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓處理組形成的細(xì)胞集落較小，細(xì)胞數(shù)也較少。應(yīng)用細(xì)胞劃痕試驗(yàn)分析HepG2細(xì)胞的爬行能力時(shí)發(fā)現(xiàn)，水飛薊賓可以抑制HepG2細(xì)胞的遷移，而且較高濃度的SB組抑制作用更為明顯。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，水飛薊賓對肝癌細(xì)胞具有較為明顯的生長和遷移能力的抑制作用。這一結(jié)果不僅為水飛薊賓的癌癥臨床治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也進(jìn)一步拓展了其藥理用途及研究價(jià)值。

[1] 王紅軍，姜媛媛，路平，等. 水飛薊賓的抗腫瘤、抗氧化和免疫調(diào)節(jié)分子藥理學(xué)機(jī)制研究進(jìn)展. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，2010，45（4）:413?421.

[2] 劉志剛，李雪玲，翁立冬，等. 水飛薊素藥理作用研究進(jìn)展. 遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2012,（10）∶ 91-93.

[3] 魯小梅，王盛，劉瑞江，等. 水飛薊素抗腫瘤作用及其機(jī)制研究進(jìn)展. 中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2009，23（4）：320-324.

[4] 劉學(xué)民. 水飛薊素治療150例慢性肝炎的療效分析. 中國醫(yī)藥指南，2013，11（19）∶141-142.

[5] 郭斯敏，謝青. 水飛薊素在慢性肝炎治療中的新認(rèn)識及研究進(jìn)展. 肝臟，2013，18（6）∶423-426.

[6] Flaig TW，Gustafson DL，Su LJ，et al. A phase I and pharmacokinetic study of silybin- phytosome in prostate cancer patients．Invest New Drugs, 2007, 25(2)∶ 139-146.

[7] Singh RP，Tyagi A, Sharma G，et al．Oral silibinin inhibits in vivo human bladder tumor xenograf growth involving down-regulation of survivin．Clin Cancer Res, 2008, 14(1)∶ 300-308．

[8] Sharma G，Singh RP，Chart DC，Agarwal R．Silibinin induces growth inhibition and apoptotic cell death in human lung carcinoma cells．Anticancer Res, 2003, 23(3B):2649-2655．

Silibinin inhibits the proliferation and migration of HepG2 hepatic cancer cells

Zhao Yifei, Wan Jing, Dai Yun#*
（Department of Cardiology, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China）

ObjectiveTo investigate the efect of silibinin on the growth, proliferation and migration of hepatic cancer cells.MethodsHepG2 hepatic cancer cells were cultured in media containing silibinin of diferent concentrations. The morphological change of the cells was observed by inverted microscope. The proliferation of the cells was examined by the methyl thiazol tetrazolium (MTT) assay, EdU incorporation assay and colony formation assay; the migration was observed by the scratch test.ResultsThe cells treated with silibinin shrunk and decreased in number. A number of dead cells were observed in the high concentration groups. The MTT, EdU and colony formation assays indicated that silibinin treatment signifcantly inhibited the proliferative capacity of the cells as well as colony formation. The scratch test showed remarkable inhibitory efect of silibinin on HepG2 cell migration. Conclusion Silibinin can inhibit the proliferation and migration of HepG2 cells, and this might be part of its anti-tumor mechanism.

Silibinin; HepG2 hepatic cancer cell; cell proliferation; migration

R73-36

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.02.008

2016-11-22

2017-01-20

趙逸飛，男（1999年），漢族，湖北省武漢市水果湖高級中學(xué)高中生

#湖北省武漢市水果湖高級中學(xué)化學(xué)教師，水果湖高中科學(xué)創(chuàng)新實(shí)踐活動指導(dǎo)老師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：1416070116@qq.com