巴戟天水提液有效萃取成分促進(jìn)微波致雄性大鼠生殖損傷的修復(fù)

宋斌1,2,3，王瑋1,2,3 *

(1福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系；2福建省高校腦老化與神經(jīng)變性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3福建醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心，福州 350122)

巴戟天水提液有效萃取成分促進(jìn)微波致雄性大鼠生殖損傷的修復(fù)

宋斌1,2,3，王瑋1,2,3 *

(1福建醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)系；2福建省高校腦老化與神經(jīng)變性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3福建醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)研究中心，福州 350122)

目的探討巴戟天（Morinda officinalis F. C. How）水提液對(duì)微波輻射致生殖系統(tǒng)損傷的修復(fù)作用。方法以900MHz頻率、218μm/cm2輻射密度的低功率微波持續(xù)輻射10天，建立雄性SD大鼠生殖損傷模型。66只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為11組。A 組為空白對(duì)照組，B組為輻射未給藥組，C組為輻射+生理鹽水組，D組為巴戟天水提液乙酸乙酯萃取水層治療組，E組為巴戟天水提液乙酸乙酯萃取酯層治療組(其中D、E組各有10g、20g、30g、40g生藥量/kg濃度梯度組)。每天灌胃1.5ml，持續(xù)14d。觀察大鼠性行為學(xué)指標(biāo)差異，同時(shí)檢測血清睪酮變化；比較睪丸、附睪指數(shù)以及睪丸組織形態(tài)學(xué)的改變。結(jié)果巴戟天水提液乙酸乙酯萃取各層濃度梯度組分別給藥后，D3、D4組撲捉潛伏期與B、C組相比縮短，D4組撲捉次數(shù)較之B、C組增加，余治療組性行為學(xué)指標(biāo)與B、C組無明顯差別。D3、D4組睪酮水平較之B、C組均顯著升高。HE染色和PCNA/SCP3雙重免疫熒光染色顯示，隨著給藥劑量增大，D組大鼠生精細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，以A型精原細(xì)胞和粗線期初級(jí)精母細(xì)胞修復(fù)最為明顯。結(jié)論巴戟天水提液乙酸乙酯萃取水層可改善大鼠性欲、修復(fù)生精上皮生精細(xì)胞和精子生成，最佳治療劑量為40g/kg，其機(jī)制可能與促進(jìn)睪酮分泌增加有關(guān)。

巴戟天；微波輻射；精子生成；男性不育

在不育癥中，男性不育或生育能力低下占近50%的比例[1]。近年來，國內(nèi)外研究表明環(huán)境因素對(duì)男性生殖功能造成的損傷超過以往的預(yù)期[2]。暴露在微波輻射如移動(dòng)電話、筆記本電腦和無線路由器等環(huán)境中可導(dǎo)致人類精子質(zhì)量的降低[3]。微波是指頻率為300MHz～300GHz的電磁波。微波輻射對(duì)全身各個(gè)系統(tǒng)均可造成損傷，尤其以生殖系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)損害為重。微波輻射對(duì)生殖系統(tǒng)的影響主要表現(xiàn)為性欲下降、睪丸病理性損傷、精子參數(shù)和相關(guān)激素的水平偏離正常值范圍等[4]。臨床上常用西藥如克羅米酚等治療各種少精、弱精子癥不育患者，具有一定的效果，但是存在引起體重和性欲改變、輕度抑郁、惡心暈眩、視覺障礙、胃腸道反應(yīng)和皮疹等副作用。因此，尋找生精效果好和毒副作用小的新型生精藥物是當(dāng)前新藥研發(fā)熱點(diǎn)之一。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究認(rèn)為中草藥巴戟天（Morinda officinalis How）能提高人體免疫力、增強(qiáng)性欲，消除性功能障礙等。巴戟天水提物已被證實(shí)可改善雄性大鼠微波輻射所致的生殖功能損傷[5]。但巴戟天對(duì)雄性生精障礙及性欲方面的修復(fù)機(jī)制尚不清楚，關(guān)于巴戟天中起修復(fù)作用的有效成分單體尚無定論，而巴戟天水提液給藥濃度與修復(fù)雄性生精障礙之間的量效關(guān)系研究較少。本實(shí)驗(yàn)擬在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，以巴戟天水提物的乙酸乙酯萃取層(酯層)和水層分別對(duì)微波輻射誘導(dǎo)生精障礙模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，比較各組大鼠性行為學(xué)、血清睪酮水平、睪丸指數(shù)以及睪丸組織形態(tài)學(xué)差異，并研究不同給藥濃度和上述指標(biāo)間的量效關(guān)系，以探討巴戟天水提液中有效成分在乙酸乙酯萃取各層的分布情況及對(duì)生精功能修復(fù)的最佳濃度、具體修復(fù)生精細(xì)胞類型，從而為巴戟天有效成分單體提取的后續(xù)研究提供基礎(chǔ)，并為不育癥患者的中藥治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。

材料與方法

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

66只健康成年雄性SD大鼠，4月齡，體重(247.73±13.61)g，由福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(閩2012-0001)】；以福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心生產(chǎn)的普通顆粒飼料，新鮮自來水進(jìn)行喂養(yǎng)；室溫控制在18～24℃，濕度控制在45%～65%。

2 主要試劑及儀器

巴戟天干燥根(福建南靖)；ELISA-T 試劑盒(美國R&D公司)；增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)鼠單克隆抗體(丹麥DAKO)；聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白3(synaptonemal complex protein 3，SCP3)兔多克隆抗體(美國Novus Biologicals)；Alexa 546羊抗兔熒光二抗 (1∶500) (美國Invitrogen)；Alexa 488羊抗鼠熒光二抗 (1∶500) (美國Invitrogen)；DAPI(碧云天生物技術(shù)研究所)；非離子型去污劑Brij? L23(C12E23聚氧乙烯月桂醚) (美國Sigma公司)；伊紅染色液(碧云天生物技術(shù)研究所)；蘇木素染色液(碧云天生物技術(shù)研究所)；實(shí)驗(yàn)用其他試劑均為國產(chǎn)分析純。微波信號(hào)發(fā)生器(泉州榮盛達(dá)電訊公司)； ML-91型微波漏能測試儀(宿遷市精誠無線電儀器有限公司)；R-200旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI公司)；酶標(biāo)儀ELx 800(美國Bio-Tek)；HM-525冰凍旋轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國Microm International GmbH)；TCS SP5激光共聚焦顯微鏡(德國Leica)；ECLIPSETS-100 型倒置顯微鏡(日本Nikon)。

3 動(dòng)物分組及造模

66只健康成年雄性SD大鼠隨機(jī)分為11組，每組6只。A 組為空白對(duì)照組，B組為輻射組，C組為輻射+生理鹽水組，D組為巴戟天水提液乙酸乙酯萃取水層治療組，E組為巴戟天水提液乙酸乙酯萃取酯層治療組(其中D、E組各有10g 、20g、30g和40g生藥量/kg濃度梯度組，分別表示為D1、D2、D3、D4和E1、E2、E3、E4)。

大鼠于大號(hào)鼠籠中取自由體位，同鼠籠一并置于前方開口的白色鐵皮箱中。微波輻射發(fā)生裝置發(fā)射天線位于白色鐵皮箱前方5cm，輻射密度為218um/cm2，輻射時(shí)間為24h/d、連續(xù)輻射10d。C組輻射指標(biāo)同輻射組，輻射10d后給予1.25ml生理鹽水灌胃。D1-D4組及E1-E4組輻射10d后，分別給予巴戟天水提物萃取水層及萃取酯層10g、20g、30g和40g生藥量/kg灌胃，給藥時(shí)間為每日晨8∶00，每天一次，每次1.25ml，持續(xù)14d。

4 巴戟天提取方法

巴戟天干燥根經(jīng)250g手提式高速中藥粉碎機(jī)粉碎，以蒸餾水浸泡、煎煮2次，藥汁過濾，藥渣丟棄，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)裝置減壓回收蒸餾水，濃縮后40C保存，備用。濃縮液取500ml置入1L分液漏斗中，加入500ml乙酸乙酯混勻。靜置30min后可見混合液分層，上層為淺黃色的乙酸乙酯萃取酯層，包含了可溶于乙酸乙酯的巴戟天水提液成份及乙酸乙酯；下層為深棕色的萃取水層，包含了巴戟天水提液中可溶于水的成份、蒸餾水及殘留的乙酸乙酯。經(jīng)再次旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除殘留的乙酸乙酯，并將萃取各層溶液調(diào)整成所需濃度。

5 大鼠性行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

大鼠性行為學(xué)實(shí)驗(yàn)在隔音、恒溫的動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行。將各組中的每只大鼠依次放入45cm×25cm×20cm的鼠籠中適應(yīng)5min，隨后以1∶1的雌雄比投入同批飼養(yǎng)的健康雌性大鼠，觀察30min內(nèi)以下指標(biāo)變化：①撲捉潛伏期(Capture incubation period, CIP)：自雌鼠投入開始計(jì)時(shí)，至雄鼠第一次撲捉雌鼠的時(shí)間。②撲捉次數(shù)(Capture times, CT)：自雌鼠投入30min內(nèi)，雄鼠撲捉雌鼠或爬背或舔陰動(dòng)作次數(shù)。

6 血清睪酮測定

大鼠輻射10d后，禁食24h，以10%水合氯醛(3～6ml/kg)腹腔注射麻醉后，將大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。打開胸腔，暴露心臟，取5ml一次性注射器，自右心房進(jìn)針取血3～5ml，置于預(yù)冷的EP管中，冰上靜置30min。血樣分層后置4℃離心機(jī)中，經(jīng)2500r/min離心15min，小心吸取上層血清，置于另一EP管中，-20℃保存?zhèn)溆?。ELISA法測定血清睪酮濃度。

7 組織學(xué)標(biāo)本制備

自大鼠左心室留取血樣后進(jìn)行灌注固定。自左心室向升主動(dòng)脈插入灌注針頭，剪開右心耳，快速灌注0.9%生理鹽水150ml進(jìn)行沖洗后，灌注預(yù)先配好的4%多聚甲醛苦味酸固定液固定，持續(xù)約2h。在陰囊內(nèi)尋找并仔細(xì)分離兩側(cè)睪丸和附睪，去除多余的脂肪和結(jié)締組織，分別測量并記錄睪丸和附睪重量。睪丸置于30%蔗糖溶液中脫水沉底后，行20μm冰凍切片，分別進(jìn)行常規(guī)HE染色及免疫熒光染色。

8 免疫熒光染色

切片以0.01mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS，pH7.4)漂洗5min×3次；滴加含1% 牛血清白蛋白(BSA)的封閉液(PBS配制)室溫放置30min；分別加濃度為1：100的SCP3一抗和1：200的PCNA一抗20μl，4 ℃ 過夜 ；0.075% Brij/PBS(pH7.4)漂洗10 min×3次、PBS漂洗5 min×3次；加入濃度為1：500的Alexa 546驢抗兔熒光二抗和Alexa 488驢抗鼠熒光二抗各20μl，37℃ 避光孵育60min；0.075% Brij/PBS漂洗10 min×3次、PBS漂洗5 min×3次，避光；滴加DAPI(5μg/ml)20μl，避光反應(yīng)5min；PBS漂洗5 min×3次，避光。防熒光淬滅封片液封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照。省略一抗做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，結(jié)果為陰性。

9 睪丸和附睪指數(shù)

睪丸指數(shù)：雙側(cè)睪丸重量和(g)/體重(g)；附睪指數(shù)：雙側(cè)附睪重量和(g)/體重(g)。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)用SPSS 20.0 for Windows分析軟件分析。用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以方差齊性及t檢驗(yàn)、單因素ANOVA統(tǒng)計(jì)方法分析，P＜0.05表示差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 乙酸乙酯萃取水層高劑量組給藥改善大鼠性欲

對(duì)大鼠性行為分析顯示：與A組相比，B組大鼠CIP延長約50%；巴戟天水提液乙酸乙酯萃取各層濃度梯度液治療后，D3、D4組CIP B、C組均縮短約16%；B組大鼠CT較A組減少約35%，D4組CT較B、C組增加約17%；余治療組性行為指標(biāo)與B、C組差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖1)。

2 乙酸乙酯萃取水層高劑量組干預(yù)促進(jìn)血清睪酮升高

以ELISA法測定并比較各組大鼠給藥或者生理鹽水后血清睪酮水平，A組與B組睪酮水平差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；D3、D4組睪酮水平較B、C組分別升高約94%和208%；余治療組睪酮水平與B、C組差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)。

3 乙酸乙酯萃取水層40g劑量組給藥增加生殖腺重量

對(duì)睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)測量顯示：B組睪丸指數(shù)低于A組，D4組睪丸指數(shù)較B、C組上升約31%，余治療組與B、C組差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3a)；B組附睪指數(shù)低于A組，降低約17%；D4組附睪指數(shù)較B、C組升高，余治療組與B、C組差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖 3b)。

圖1 各組大鼠給藥后CIP和CT值分別比較。a，CIP；b，CT; *，與A組相比，0.01＜P＜0.05 ( n = 6)；#，與B、C組相比，0.01＜P＜0.05( n = 6)Fig. 1 Comparison of CIP and CT among the groups after administration. a, CIP; b, CT; *, 0.01＜P＜0.05, compared with Group A (n=6); #, P＜0.05, compared with Groups B and C (n=6)

圖2 各組大鼠給藥后血清睪酮水平比較。#，與B、C組相比，0.01＜P＜0.05 ( n = 6)Fig. 2 Comparison of serum testosterone level among the groups after administration. #, 0.01＜P＜0.05, compared with Groups B and C (n=6)

圖3 各組大鼠給藥后睪丸指數(shù)和附睪指數(shù)分別比較。a，睪丸指數(shù)，b，附睪指數(shù)；*，與A組相比，0.01＜P＜0.05 ( n = 6)；#，與B、C組相比，0.01＜P＜0.05 ( n = 6)Fig. 3 Comparison of testis-weight ratio and epididymis-weight ratio among the groups after administration. a, testis-weight ratio; b, epididymis-weight ratio; *, 0.01＜P＜0.05, compared with Group A (n=6); #, 0.01＜P＜0.05, compared with Groups B and C (n=6)

4 乙酸乙酯萃取水層40g劑量組干預(yù)促進(jìn)睪丸生精小管上皮修復(fù)

HE染色發(fā)現(xiàn)，A組睪丸生精上皮精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞排列緊密、整齊有規(guī)律，生精小管基底膜完整，管內(nèi)可見大量精子(圖 4A)。B組及C組睪丸形態(tài)學(xué)發(fā)生病理改變，表現(xiàn)為各生精小管之間間隙增大，結(jié)構(gòu)疏松，生精小管上皮生精細(xì)胞排列紊亂、脫落、壞死，管腔內(nèi)充滿脫落的生精細(xì)胞及壞死的細(xì)胞碎片，生精小管內(nèi)精子數(shù)量顯著減少或未見精子(圖 4B、C)；D組可見精原細(xì)胞較B組及C組數(shù)量增多，可見部分初級(jí)精母細(xì)胞，大鼠睪丸生精小管上皮恢復(fù)產(chǎn)生各級(jí)生精細(xì)胞，新生的生精細(xì)胞排列規(guī)則、緊密，同時(shí)觀察到D1-D4管腔內(nèi)精子數(shù)量隨給藥劑量增高而逐漸增多(圖 4D-G)；E1-E4組，睪丸生精小管上皮損傷嚴(yán)重，各層生精細(xì)胞均脫落、壞死，管腔內(nèi)未見精子(圖 4H);睪丸其余不同階段生精上皮各組間比較也可見上述類似改變，其中以D4組大鼠睪丸生精小管上皮各級(jí)生精細(xì)胞及精子數(shù)量逐漸增多較為顯著。

圖4 巴戟天提取物對(duì)各組大鼠睪丸生精小管上皮組織形態(tài)學(xué)影響的HE染色觀察。A，空白對(duì)照組；B，輻射組；C，輻射+生理鹽水組；D- G，巴戟天水提液乙酸乙酯萃取水層10g 、20g、30g和40g生藥量/kg濃度梯度組（D1、D2、D3、D4組）；H，巴戟天水提液乙酸乙酯萃取酯層各濃度梯度組（E1、E2、E3、E4組）代表圖片；比例尺：A，E，F(xiàn)和G，100μm；C和D，50μm；B，200μm；H，500μmFig.4 The efect of the aqueous extract of M. ofcinalis on the histomorphology of rat spermatogenic epithelium observed by HE staining. A, Group A; B, Group B; C, Group C; D-G, Groups D1, D2, D3 and D4; H, a representative picture of Group E; scale bar∶ 100μm in A, E, F, G; 50μm in C and D; 200μm in B; 500μm in H

圖5 巴戟天提取物對(duì)各組大鼠睪丸生精細(xì)胞影響的PCNA/SCP3雙重免疫熒光染色觀察。A，空白對(duì)照組；B，輻射組+生理鹽水組；C，巴戟天水提液乙酸乙酯萃取水層10g、20g和30g生藥量/kg濃度梯度組（D1、D2、D3組）代表圖片；D，巴戟天水提液乙酸乙酯萃取水層40g生藥量/kg組（D4組）。紅色箭頭示粗線期初級(jí)精母細(xì)胞；白色箭頭示A型精原細(xì)胞；比例尺，20μm。Fig. 5 The efect of the aqueous extract of M. ofcinalis on rat spermatogenic cells detected by PCNA/SCP3 double immunofuorescent staining. A, Group A; B, Group C; C, a representative picture of Groups D1, D2 and D3; D, Group D4; red arrows indicate pachytene primary spermatocytes; white arrows indicate type A spermatogonia; scale bar, 20μm

PCNA/SCP3雙重免疫熒光染色進(jìn)一步顯示，微波輻射和含巴戟天有效成分萃取物給藥后對(duì)生精細(xì)胞影響的具體類型及其所處時(shí)期：A組空白對(duì)照組睪丸染色呈PCNA+/SCP3-的為A型精原細(xì)胞，位于生精上皮的最外層、緊貼基底膜，形態(tài)呈扁橢圓形；呈PCNA+/SCP3+的為粗線期初級(jí)精母細(xì)胞，位于生精上皮中層，細(xì)胞體積較大，數(shù)量多；DAPI染色顯示大量圓形精子細(xì)胞和位于管腔內(nèi)的精子，精子細(xì)胞靠近管腔、呈球形、體積約為初級(jí)精母細(xì)胞的一半大小、核圓形并位于細(xì)胞中央(圖 5A)；C組輻射加生理鹽水組大鼠A型精原細(xì)胞消失，粗線期初級(jí)精母細(xì)胞數(shù)量顯著減少、體積變小并外移至生精上皮的最外層，圓形精子細(xì)胞排列紊亂、部分也由管腔處外移至靠近基底膜(圖 5B)；D1-D3組大鼠輻射并給藥后上述生精細(xì)胞損傷未見明顯改變(圖 5C)；D4組可見A型精原細(xì)胞重新出現(xiàn)在基底膜側(cè)，體積較大的粗線期初級(jí)精母細(xì)胞明顯增多并位于生精上皮中層精原細(xì)胞內(nèi)側(cè)(圖 5D)；E組染色結(jié)果同圖5B。

討 論

巴戟天是天然中草藥，茜草科藤狀灌木的根，為我國四大南藥之一。主要生長在福建省閩南山區(qū)、廣東和廣西[6]。中醫(yī)認(rèn)為巴戟天具有壯陽補(bǔ)腎、固精安神功效。林芳花等[7]以巴戟甲素對(duì)正常大鼠灌胃處理，并對(duì)雄性大鼠性行為指標(biāo)進(jìn)行觀察，結(jié)果顯示巴戟甲素可顯著提高大鼠撲捉次數(shù)及射精次數(shù)，而首次撲捉時(shí)間及首次射精時(shí)間均顯著縮短。Wu等研究[8]顯示巴戟甲素治療可明顯改善羥基脲誘發(fā)腎陽虛小鼠的性行為學(xué)指標(biāo)，提高血清睪酮濃度，并改善精子質(zhì)量。在我們的研究中，巴戟天提取物治療前后，萃取水層30g/kg及40g/kg劑量組撲捉潛伏期較輻射組、生理鹽水組明顯縮短，萃取水層40g劑量組30分鐘撲捉次數(shù)較輻射組、生理鹽水組增多，均提示巴戟天可提高雄性大鼠性行為能力，但可能需達(dá)到適當(dāng)?shù)膭┝坎拍苓_(dá)到較佳效果，結(jié)果與上述研究一致。

Chang等[9]以H2O2誘導(dǎo)小鼠睪丸間質(zhì)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷，并應(yīng)用巴戟天進(jìn)行干預(yù)后檢測超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)、脂質(zhì)過氧化反應(yīng)及睪酮水平，結(jié)果顯示巴戟天可顯著提高睪酮水平、降低脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并改善SOD及CAT水平，表明巴戟天可拮抗H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激損傷，并達(dá)到保護(hù)生殖功能效果。Li等研究[10]提示手機(jī)輻射可致大鼠血清黃體生成素(luteotropic hormone，LH)升高，巴戟天治療可降低LH水平。本課題組前期研究[11]顯示巴戟天水提液及可改善微波輻射所致生殖損傷大鼠性行為學(xué)，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)HPTA下丘腦、垂體以及性腺各個(gè)水平上相關(guān)激素分泌有關(guān)。巴戟天多糖還可能通過下調(diào)細(xì)胞因子如TGF-β3和TNF-α水平來調(diào)節(jié)包括睪酮在內(nèi)的各種激素水平表達(dá)，從而修復(fù)實(shí)驗(yàn)性精索靜脈曲張大鼠的生精上皮及其中支持細(xì)胞緊密連接損傷[12]。本研究亦顯示巴戟天水提液萃取水層可提高微波輻射后大鼠血清睪酮水平，且睪酮水平與給藥量呈正相關(guān)。

Liu等[13]比較生曬巴戟天與鹽制巴戟天對(duì)未成熟大鼠的生殖保護(hù)及抗缺氧能力的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，鹽制巴戟天組睪丸重量明顯增加，與對(duì)照組間差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。生曬巴戟天組睪丸重量亦有所增加，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩種炮制方式巴戟天均可增加大鼠包皮腺、精囊腺重量。Chen等[14]應(yīng)用激光共聚焦拉曼光譜對(duì)過氧化氫損傷的人類精子DNA進(jìn)行變化分析，結(jié)果顯示過氧化氫損傷后精子DNA光譜較對(duì)照組有顯著差異，而巴戟天寡糖治療后精子DNA光譜幾乎恢復(fù)至正常。張巍等[15]采用微波輻射造成SD大鼠睪丸生精功能損傷模型，并以巴戟天水提液進(jìn)行干預(yù)處理，結(jié)果顯示給藥組精子活性及精子密度均較對(duì)照組顯著增高，提示巴戟天對(duì)微波損傷的雄鼠睪丸生精功能有修復(fù)作用。本課題組前期研究也證實(shí)巴戟天對(duì)睪丸體積及重量的修復(fù)作用[5,11,12]。本研究結(jié)果亦顯示巴戟天水提液萃取水層可提高微波輻射后大鼠睪丸及附睪指數(shù)，并改善微波輻射后睪丸及附睪病理變化，但以上治療效果僅當(dāng)給藥劑量達(dá)30～40g/kg方明顯呈現(xiàn)。

本研究證實(shí)巴戟天水提液乙酸乙酯萃取水層可改善微波輻射所致生殖損傷的雄性大鼠性欲、修復(fù)生精上皮生精細(xì)胞和精子生成，最佳治療劑量為40g/kg，其機(jī)制可能與促進(jìn)睪酮分泌增加有關(guān)。本研究未能納入更多的治療劑量組，關(guān)于更高濃度的療效尚有待進(jìn)一步考證，同時(shí)藥物對(duì)全身各系統(tǒng)的毒副作用影響也需考慮和開展實(shí)驗(yàn)，從而為不育癥患者的中藥治療時(shí)的劑量選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和參考。

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Effective extractive from the aqueous extract of Morinda officinalis F. C. How facilitates the repair of microwave-induced male reproductive impairment of rats

Song Bin1,2,3, Wang Wei1,2,3＊
(1Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, School of Basic Medical Sciences, Fujian Medical University, Fuzhou 350122, China;2Key Laboratory of Brain Aging and Neurodegenerative Diseases of Fujian Provincial Universities and Colleges, Fuzhou 350122, China;3Research Center of Neuroscience, Fujian Medical University, Fuzhou 350122, China)

ObjectiveTo study the repair of microwave-induced male reproductive impairment by the aqueous extract of Morinda officinalis F. C. How.MethodsThe reproductive impairment model was established by continuous 900MHz and 218μm/cm2microwave radiation for ten days. Sixty-six healthy male adult SD rats were randomly divided into 11 groups (including subgroups)∶Group A, Blank control; Group B, Radiation; Group C, Radiation + NS; Group D, Radiation + the aqueous layer in ethyl acetate extraction of the aqueous extract of M. ofcinalis; Group E, Radiation + the ethyl acetate layer in ethyl acetate extraction of the aqueous extract of M. ofcinalis; Groups D and E were further divided into four subgroups respectively according to the dose of M. ofcinalis treatment (10/20/30/40g crude drug/kg). 1.5ml M. ofcinalis extraction or NS were administered by oral gavage per day for 14 days. The sexual behavior, serum testosterone, testis-weight ratio, epididymis-weight ratio and histomorphological changes of the testis were compared among the groups.ResultsAfter treatment, compared with Groups B and C, the capture incubation period (CIP) decreased signifcantly in Groups D3 and D4, and the capture frequency (CF) increased signifcantly in Group D, while no obvious diference in sexual behavior was observed in the other treatment groups. The level of testosterone was signifcantly higher in Groups D3 and D4 than in Groups B and C. HE staining and PCNA/SCP3 double immunofurorescent staining results showed that in Group D, the num-ber of spermatogenic cells increased with the addition of administration dosage, among which the repair of type A spermatogonia and pachytene primary spermatocytes was the most remarkable. Conclusion The aqueous layer in ethyl acetate extraction of the aqueous extract of M. officinalis can improve the sexual desire of rats, repair spermatogenic cells and promote spermatogenesis, possibly by stimulating the secretion of testosterone. The optimal administration dosage was 40g/kg.

Morinda officinalis How; microwave radiation; spermatogenesis; male infertility

R339.2

A

10.16705/ j. cnki. 1004-1850.2017.02.004

2017-01-23

2017-03-30

福建省自然科學(xué)基金（2014J01330）

宋斌，女（1979年），漢族，講師

*通訊作者(To whom correspondence should be addressed)：wangwei@fjmu.edu.cn