鴨源1:A 型多殺性巴氏桿菌的分離與鑒定

程增青，郭玉廣，馬 冬，趙永軍，范根成

（1. 青島易邦生物工程有限公司，動(dòng)物基因工程疫苗國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266032；

2. 尉氏縣永軍獸藥技術(shù)服務(wù)部，河南尉氏 475500）

多殺性巴氏桿菌可以引起多種畜禽巴氏桿菌病，如牛出血性敗血癥、羊出血性肺炎、禽霍亂、豬萎縮性鼻炎、兔傳染性鼻炎等[1]。2018 年9 月，河南省某大型蛋鴨場(chǎng)發(fā)生疑似巴氏桿菌病。鴨群整體精神、采食正常，但產(chǎn)蛋率下降至90%以下。巴氏桿菌病多呈慢性感染，急性敗血型死亡少見，鴨感染后常表現(xiàn)縮頭垂翅，頭頸無力，最后癱瘓并死亡，死亡率約0.5%。剖檢該蛋鴨場(chǎng)病鴨，可見巴氏桿菌病典型病變，如心冠脂肪、心包有出血點(diǎn)，肝臟腫大、質(zhì)脆，有出血點(diǎn)，胰腺邊緣、脾臟、卵巢壞死，卵泡呈“煮熟樣”壞死，腸道出血、黏膜脫落，有膿性帶血的內(nèi)容物。對(duì)病鴨肝臟進(jìn)行細(xì)菌分離，獲得一株疑似多殺性巴氏桿菌菌株，經(jīng)對(duì)其進(jìn)行一系列鑒定，證實(shí)其為1:A型多殺性巴氏桿菌。

1 材料

病料：來源于河南省尉氏縣某蛋鴨場(chǎng)；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、含5%小牛血清的TSA/TSB 培養(yǎng)基：均由青島易邦生物工程有限公司提供；細(xì)菌微量生化鑒定管、藥敏紙片：均購自杭州微生物試劑有限公司；昆明小鼠：體質(zhì)量25 g 左右，購自濟(jì)南山大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；Premix Ex Taq、DL 2 000 核酸Marker：均購自大連寶生物（TaKaRa）有限公司；引物：由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其他儀器、試劑，均由青島易邦生物工程有限公司提供。

2 方法

2.1 細(xì)菌分離

取病死鴨肝臟，無菌操作，接種于含5%小牛血清的TSA 瓊脂平板，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.2 細(xì)菌鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察 挑取疑似菌落，經(jīng)革蘭氏和瑞氏染色后鏡檢，觀察其形態(tài)。

2.2.2 培養(yǎng)特性鑒定 挑取疑似菌落分別接種營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂、含5%小牛血清的TSA 瓊脂及含5%小牛血清的TSB 培養(yǎng)基，置37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察其生長特性。

2.2.3 生化特性鑒定 麥芽糖、甘露醇、半乳糖、鼠李糖、葡萄糖、甘露糖、果糖、乳糖、蔗糖、脲酶試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)、MR 試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)和吲哚試驗(yàn)生化鑒定，均參照使用說明書進(jìn)行。

2.2.4 PCR 鑒定及分型 挑取疑似菌落，用100 μL 純水重懸后，煮沸5 min，以此作為模板，利用引物進(jìn)行PCR 鑒定及分型鑒定。多殺性巴氏桿菌特異性引物參考Townsend 等[3]方法合成，用于擴(kuò)增多殺性巴氏桿菌kmt 基因，擴(kuò)增片段長度為457 bp；莢膜分型引物同樣參考Townsend 等[3]方法合成，用于擴(kuò)增多殺性巴氏桿菌A、B、D、E、F莢膜血清型特異性基因hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD，擴(kuò)增片段長度分別為1 044、760、657、511、851 bp；脂多糖分型引物參考Harper 等[4]方法合成，用于擴(kuò)增多殺性巴氏桿菌LPS1～8 型外核編碼簇上不同的基因位點(diǎn)，擴(kuò)增片段長度分別為1 307、810、474、120、1 175、668、931、255 bp。以上PCR 反應(yīng)體系均為：Premix Ex Taq 12.5 μL，引物F 0.5 μL，引物R 0.5 μL，模板2 μL，無離子水9.5 μL。反應(yīng)程序均為：95 ℃ 3 min；94 ℃ 15 s，54 ℃ 15 s，72 ℃ 65 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min；16 ℃ ∞。

2.3 毒力試驗(yàn)

挑取典型菌落，接種于含5%小牛血清的TSB培養(yǎng)基，37 ℃振搖培養(yǎng)16 h，用生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-7稀釋度菌液涂布含5%小牛血清的TSA 瓊脂平板并進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，0.1 mL/板，涂2 板；取10-6、10-7、10-8、10-9稀釋度菌液，分別按0.2 mL/只劑量，腹腔注射體質(zhì)量25 g 左右昆明小鼠4 只，觀察小鼠死亡情況。

2.4 藥敏試驗(yàn)

挑取典型菌落，密集劃線接種于含5%小牛血清的TSA 培養(yǎng)基，貼上頭孢哌酮舒巴坦鈉、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、強(qiáng)力霉素、丁胺卡那、氟苯尼考、林可霉素等藥敏紙片，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，然后測(cè)量不同藥敏片抑菌圈直徑大小，確定藥物敏感性。按照不同抗菌藥標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)比抑菌圈直徑大小，結(jié)果評(píng)定為高敏、中敏和不敏感。

3 結(jié)果

3.1 形態(tài)觀察及培養(yǎng)特性鑒定

分離菌為革蘭氏陰性小桿菌，多單在，部分菌體兩端濃染。在營養(yǎng)瓊脂上生長貧瘠，在麥康凱瓊脂上不生長；在含5% 小牛血清TSA 瓊脂上生長良好，37 ℃培養(yǎng)24 h，能形成圓形、邊緣整齊光滑、半透明的灰白色菌落，菌落直徑為2～3 mm；接種含5%小牛血清TSB 中培養(yǎng)24 h 后，發(fā)現(xiàn)呈均勻一致渾濁，管底有少量沉淀，無菌膜。

3.2 生化特性

分離菌不能發(fā)酵鼠李糖、乳糖，能發(fā)酵麥芽糖、甘露醇、半乳糖、葡萄糖、甘露糖、果糖和蔗糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣；脲酶試驗(yàn)、MR 試驗(yàn)結(jié)果為陰性，接觸酶試驗(yàn)結(jié)果為陽性，硫化氫試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)結(jié)果為陽性。

3.3 PCR 鑒定及分型鑒定

分離菌用多殺性巴氏桿菌特異性鑒定引物能擴(kuò)增到547 bp 的目的基因片段（圖1），用多殺性巴氏桿菌莢膜型和LPS 型特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)莢膜A 型引物和LPS1 型引物能分別擴(kuò)增到1 044、1 307 bp 的基因片段，其余引物均未能擴(kuò)增到預(yù)期大小的基因片段（圖2）。

M. DL 2 000 bp DNA Marker；1. 分離菌；2. 陰性對(duì)照。圖1 多殺性巴氏桿菌特異性鑒定引物擴(kuò)增結(jié)果

M. DL 2 000 bp DNA Marker；1. Pm-LPS1；2. Pm-LPS2；3. Pm-LPS3；4. Pm-LPS4；5. Pm-LPS5；6. Pm-LPS6；7. Pm-LPS7；8. Pm-LPS8；9. Pm-A；10. Pm-B；11. Pm-D；12. Pm-E；13. Pm-F。圖2 分離菌莢膜型和LPS 型鑒定結(jié)果

3.4 藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，分離菌對(duì)頭孢噻肟、頭孢曲松鈉、左氧氟沙星高度敏感，抑菌環(huán)直徑分別為25、25、22 mm；對(duì)強(qiáng)力霉素、環(huán)丙沙星、頭孢哌酮舒巴坦鈉、丁胺卡那中度敏感，抑菌環(huán)直徑分別為20、18、16、16 mm；對(duì)氟苯尼考、林可霉素不敏感，抑菌環(huán)直徑分別為13、10 mm。結(jié)果詳見圖3。

3.5 毒力試驗(yàn)

圖3 分離菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

活菌計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，攻毒菌液原液的活菌含量 為1.85×109CFU/mL，10-6、10-7、10-8、10-9稀釋度菌液攻毒組的攻毒菌量分別為370、37、3.7、0.37 CFU/（0.2 mL/只）。毒力試驗(yàn)結(jié)果顯示，所有10-6、10-7、10-8稀釋度菌液攻毒組小鼠均于攻毒后24 h 內(nèi)全部死亡，10-9稀釋度菌液攻毒組小鼠于攻毒后7 d 內(nèi)全部健活。結(jié)果詳見表3。

表3 分離株對(duì)小鼠的毒力試驗(yàn)結(jié)果

4 分析與討論

經(jīng)形態(tài)、培養(yǎng)特性和生化特征鑒定，初步確定該分離菌為多殺性巴氏桿菌。參考文獻(xiàn)[3-4]方法，用PCR 進(jìn)行多殺性巴氏桿菌特異性鑒定、莢膜型及菌體型（LPS 型）鑒定，證明該分離株為1:A 型多殺性巴氏桿菌，與國內(nèi)學(xué)者研究得出的禽源多殺性巴氏桿菌主要為1:A 型的結(jié)論一致[5]。相對(duì)于傳統(tǒng)的基于抗原抗體反應(yīng)的莢膜型和菌體型鑒定，PCR 方法具有快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，尤其是對(duì)于難以獲得標(biāo)準(zhǔn)鑒定血清的研究。國內(nèi)也有多位學(xué)者應(yīng)用PCR 分型的方法對(duì)多殺性巴氏桿菌進(jìn)行了分型研究[5-6]。

目前國內(nèi)學(xué)者對(duì)雞源巴氏桿菌的研究報(bào)告較多，但對(duì)鴨源的研究報(bào)告較少。本次病例中，鴨群整體精神、采食正常，產(chǎn)蛋率下降不明顯，死亡率也不高，但呈現(xiàn)持續(xù)的慢性感染和死亡，造成較大經(jīng)濟(jì)損失。分離菌被確診后，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇頭孢噻肟拌料，飼喂3 d 后，死亡現(xiàn)象停止。

雖然本次病例沒有出現(xiàn)較高的死亡率，但分離的鴨源多殺性巴氏桿菌對(duì)小鼠具有較高的毒力，3.7 CFU 即能致死全部攻毒小鼠。這是否說明多殺性巴氏桿菌對(duì)雞、鴨、鼠等不同動(dòng)物具有不同的易感性，還有待于對(duì)以上幾種動(dòng)物進(jìn)行毒力對(duì)比試驗(yàn)來進(jìn)一步驗(yàn)證。