非洲豬瘟診斷技術研究進展

高 瞻，張光磊，邵軍軍，常惠蕓

（中國農業(yè)科學院蘭州獸醫(yī)研究所，家畜疫病病原生物學國家重點實驗室，

OIE/國家口蹄疫參考實驗室，甘肅蘭州 730046）

非洲豬瘟（African swine fever，ASF）是由非洲豬瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起的豬的一種急性、烈性、高致死性傳染病。世界動物衛(wèi)生組織（OIE）將其列為須通報動物疫病，我國將其列為一類動物疫病[1-2]。因ASFV 存活時間長、抵抗力強，以及基因組龐大、易變異[3]，至今仍無商業(yè)化疫苗可用，但有多種診斷技術可用于ASF 監(jiān)測和確診。本文論述了ASF 的病原學、血清學診斷技術并分析了其優(yōu)缺點，以便為不同需求的診斷提供相應的技術支持。

1 病原學診斷技術

1.1 病毒分離與檢測

1.1.1 病毒分離 ASFV 分離必須在BSL-3 級及以上生物安全實驗室中進行。臨床樣本可采集豬血液或器官組織，需要大量病毒時，可使用已建立的ASFV敏感細胞系，例如猴源的Vero和COS-1細胞，豬源的永生化豬肺泡巨噬細胞（IPAM）和野豬肺細胞（WSL）[4]。

1.1.2 紅細胞吸附（haemadsorption，HAD）試驗 HAD 是病毒感染巨噬細胞并在其中復制，導致紅細胞吸附的一種自然現(xiàn)象，由Hess 等[5]在1969 年首次發(fā)現(xiàn)。實驗室用采集的發(fā)病豬血液或組織懸液，接種豬原代巨噬細胞，每天觀察細胞培養(yǎng)物中巨噬細胞表面是否有紅細胞附著，若最終呈現(xiàn)玫瑰花環(huán)狀或桑葚狀，判為陽性結果并根據(jù)結果對樣本的病毒量進行定量[6]。盡管該方法靈敏性高、特異性強，但檢測周期長、檢出率低。自1968 年西班牙首次發(fā)現(xiàn)ASFV 以來，截至1974 年，已分離出200 多株不具備紅細胞吸附能力的ASFV 毒株[7]，因此HAD 不再是主要的ASFV 檢測方法。

1.2 核酸檢測

1.2.1 聚合酶鏈反應技術（polymerase chain reaction，PCR） PCR 是常用的核酸檢測方法，其優(yōu)點是簡單快速、靈敏度高、特異性強，對標本純度要求低，并已廣泛用于ASF 的現(xiàn)場診斷[8]。該技術通常采用基因組高度保守區(qū)域vp72為引物，能夠鑒定出ASF 參考實驗室提供的不同ASFV 基因型分離株的基因組。曾少靈等[9]基于ASFV 結構蛋白基因vp73 序列設計特異性檢測引物，比OIE 推薦的引物（ASFV-278F、ASFV-278R）和（ASFV-257F、ASFV-257R）的靈敏度分別高出100 倍和1 000 倍，并且特異性相當。Basto 等[10]建立巢式PCR 用以檢測蜱體內ASFV，敏感性高于OIE 推薦的PCR 檢測方法。多重PCR 反應原理與一般PCR 相同，而區(qū)別在于在同一反應體系中加入了兩對以上引物進行擴增，因此具有高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟簡便等優(yōu)點。Xiao 等[11]設計了7 對特異性引物和探針，并進行了多重PCR、PCR 產(chǎn)物與偶聯(lián)探針雜交，然后通過Bio-Plex 懸浮陣列系統(tǒng)檢測新建立的方法，結果表明該方法具有高度的特異性和重復性，7 種病毒的同時檢測限達到103拷貝/μL。Bio-Plex 懸浮陣列是一種快速、特異、高通量的工具，可單獨或同時混合檢測7 種豬病毒，對于今后開發(fā)用于診斷動物疾病的液體芯片技術具有重要意義。

1.2.2 實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR） qPCR 利用熒光信號實時檢測，不僅解決了傳統(tǒng)PCR 技術需要瓊脂糖凝膠電泳判定結果的問題，而且速度快、靈敏度更高，最低檢 測 限 為10 拷 貝/μL。Tignon 等[12]基 于ASFV p72 基因建立的方法，其敏感性高于OIE 推薦的常規(guī)PCR 和實時熒光定量PCR。曾少靈等[13]基于ASFV vp73 基因保守序列建立的方法，其靈敏度與OIE 推薦的熒光PCR 方法相當，比普通PCR 方法高出至少10 倍，特異性與OIE 推薦的這兩種相當。

1.2.3 微滴數(shù)字PCR（ddPCR） ddPCR 是第三代PCR 技術，是一種對核酸分子進行絕對定量的技術。鄔旭龍等[14]基于ASFV K205R 基因建立ddPCR 檢測技術，最低檢測限為0.36 拷貝，在20 μL 反應體系中約為10 拷貝/反應，檢測靈敏度是qPCR 的10 倍，并且不與其他豬病陽性血清發(fā)生反應，特異性強，具有很好的應用前景。

1.2.4 原位雜交（in situ hybridization，ISH）ISH 是利用標記探針與目的核酸結合后再檢測的一種技術方法，不僅能檢測出待檢核酸，還能在細胞中精確定位。Oura 等[15]建立了針對ASFV 衣殼蛋白vp73 的原位雜交技術，檢測效果良好。

1.2.5 環(huán)介導恒溫擴增技術（loop-mediated isothermal amplification，LAMP） LAMP 是 日 本Notomi[16]發(fā)明的一種敏感性很高的DNA 擴增技術。該技術已成功應用于SARS、禽流感、艾滋病等疾病的檢測。Heather 等[17]以ASFV 拓撲異構酶II 基因為靶點建立了LAMP 方法，其靈敏度不低于330 個基因組拷貝數(shù)，能夠檢測到具有代表性的ASFV 分離株（n = 38），且不與經(jīng)典的豬瘟病毒發(fā)生交叉反應。楊吉飛等[18]基于ASFV 結構蛋白vp72 基因建立了LAMP 檢測技術，并成功應用于ASF 參考實驗室提供的17 個ASFV 毒株的基因組，與豬病的其他病原及傳染媒介之間均沒有交叉反應，只是LAMP 中引物的相互作用可能會導致假陽性信號[19]。該技術對設備要求低，適合基層診斷使用。

1.2.6 重組酶聚合酶擴增技術（recombinase polymerase amplification，RPA） RPA 是一種等溫DNA 擴增技術，已成為用于分子診斷的有吸引力的PCR 替代方法。RPA 反應在恒定溫度下即可進行，不需要昂貴的熱循環(huán)儀，對粗制樣品具有高度抗性，并且反應可在約20 min 內完成。與實時PCR 相比，簡單、經(jīng)濟，快速[20]。Wang 等[21]設計靶向p72 基因保守區(qū)域引物和外切探針，以含有p72 基因的重組質粒為模板建立RPA 方法。此方法最低限度可檢測每個反應102個拷貝，靈敏度與RT-PCR 相當，與常見豬病毒無交叉反應，特異性良好。Miao 等[22]以ASFV p72 基因建立RPA 與側向流試紙方法（RPA-LFD），對ASFV 的敏感性為38 ℃ 10 min 內每次反應達150 個拷貝，與其他豬病毒無交叉反應，但易出現(xiàn)核酸污染，因此操作需要小心，而其簡單、便捷、經(jīng)濟等優(yōu)點，為ASFV 現(xiàn)場檢測提供了新的替代方案。

1.3 小結

病原學檢測是針對病原體自身的檢測，能夠在ASF 暴發(fā)早期，檢測出動物體內是否帶毒，相較于抗體檢測更快一些。病毒分離操作復雜，適用于病毒分子研究；核酸PCR 類檢測比較普遍，靈敏性很高，操作便捷，但核酸污染易出現(xiàn)假陽性，可用作鑒別診斷；LAMP、RPA 等等溫擴增檢測方法快速簡單，不依賴復雜儀器，現(xiàn)有專為戶外使用而設計的RPA 類便攜式設備Genie Ⅲ，輕便易于攜帶，更適用于現(xiàn)場診斷。病原學診斷方法各有特點（表1），檢測人員可根據(jù)其優(yōu)缺點選擇合適方案進行診斷。

表1 ASFV 病原學檢測技術及其優(yōu)缺點

2 血清學診斷技術

2.1 抗原檢測

2.1.1 熒光抗體技術（fluorescent antibody test，F(xiàn)AT） FAT 是常用的抗原檢測方法之一，具有快速、敏感、特異性高等優(yōu)點，對急性病例的檢出率較高。FAT 能夠檢測組織涂片或HAD 陰性白細胞培養(yǎng)物中的ASFV 抗原[23-24]。采用丙酮固定樣本10 min 后，滴加異硫氰酸熒光素（FITC）偶聯(lián)抗ASFV 抗體，再用熒光顯微鏡觀察巨噬細胞的胞漿中是否有熒光，即可據(jù)此判斷是否為陽性[25-26]?，F(xiàn)已證明，此種技術可用于鑒定12 種非血細胞吸附ASFV 毒株[7]。但此技術所需的冷凍組織切片要求在BSL-3 實驗室進行，所以不能用于現(xiàn)場檢測。此外，該技術對亞急性和慢性ASF 病例敏感性較差，因在慢性感染過程中形成的抗原抗體復合物可競爭性地阻斷ASFV 抗原和抗體的結合，從而出現(xiàn)假陰性[24]，因此一般只用作輔助檢測方法。此外，熒光抗體技術通常也用于ASFV 的體外細胞培養(yǎng)，通過病毒定位檢測復制類型等。

2.1.2 雙抗夾心ELISA 或捕獲ELISA 這種方法是在特異性單抗包被的酶標板中加入抗原，使抗原與單抗特異性結合，再加入抗原另一表位的酶標單抗，結合后加底物顯色，根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。Vidal 等[27]建立了抗ASFV vp73 蛋白特異單克隆抗體的雙夾心ELISA 方法。該測定法能檢測到的最低全病毒顆粒為2.3×102PFU/mL，最低能檢測到的vp73 抗原濃度為0.05 μg/mL。西班牙INGENASA 夾心ELISA 試劑盒，通過包被p72（p73）蛋白特異單克隆抗體來檢測病毒抗原，其特異性、敏感性均很好，并被OIE 指定為參考的ASF 診斷試劑盒。

2.1.3 側向流動免疫色譜分析（lateral flow assay，LFA） LFA 是利用生物學物質或化學物質相互特異性附著的性質，快速對分析物質進行定性或定量分析的方法。Sastre 等[28]基于vp72 蛋白的單抗建立LFA 方法，結果表明病毒的最低檢測限度為104PFU/mL，雖敏感性不如RT-PCR，但其快速便攜、經(jīng)濟易用，為現(xiàn)場診斷提供了一種選擇。此外，Sastre 等[29]還基于vp72 蛋白建立雙重側向流動測定法，用于同時檢測針對ASFV 和CSFV 的抗體，結果顯示也具有良好的靈敏度和特異性水平。

2.2 抗體檢測

2.2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） ELISA 是OIE 指定的非洲豬瘟首選血清學診斷方法，其方便快速、敏感特異，并可使用自動化設備檢測大量樣本，為目前最廣泛的血清學檢測技術。國內外常用作檢測ASFV 抗原的蛋白有p73、p72、p54、p32/p30等，ELISA 方法通過這些蛋白能夠直接檢測出較低或中等毒力的感染豬抗體。常規(guī)ELISA 使用來源于感染猴腎細胞（Vero 或 MS 細胞系）的病毒蛋白p72 抗原[30]。Wardley 等[31]在1979 年首次使用ELISA 鑒別ASFV 抗原和抗體，重復性好，能夠檢測到50～500 HAD50/mL 的有限抗原濃度。靳雯雯等[32]以ASFV vp73 蛋白作為包被抗原，建立間接ELISA 方法檢測豬血清中抗ASF vp73 蛋白的抗體，對ASFV 陽性血清靈敏度高達1:2 560，具有良好的特異性和敏感性、較好的重復性和穩(wěn)定性。曹琛福等[33]基于vp54 蛋白作為包被抗原建立競爭ELISA 方法，結果特異性達到100%，靈敏度達到96.22%，與西班牙INGENASA 試劑盒符合率為98.13%。但此方法不能診斷低毒力和高毒力菌株，因此對此類毒株檢測要配合其他診斷方法。

2.2.2 膠體金快速免疫層析法（goldimmunochromatography assay，GICA） GICA 是 近年來發(fā)展迅速的一項診斷技術。Beggs 等[34]首次用GICA測定人絨毛膜促性腺激素，該方法具有快速、靈敏、特異等優(yōu)點，尤其適合臨床的快速診斷。張鑫宇等[35]建立的p54 抗體檢測膠體金免疫層析試紙，具有高度特異性，與豬其他病毒抗體陽性血清無交叉反應，在ASF 防控中具有良好的應用前景。

2.2.3 間接熒光抗體試驗（indirect fluorescent anti-body test，IFA） IFA 是用熒光標記的二抗與抗原抗體復合物特異結合，最后在熒光顯微鏡下觀察結果的一種方法[36]。

2.2.4 免疫印跡檢測（immunoblotting test，IBT） IBT 是一種將蛋白質電泳技術和血清學結合的免疫生化技術，其特異性高，可檢測出弱陽性樣本[37]。IBT 可做為IFA 診斷技術的替代方法。

2.3 小結

血清學診斷是通過檢測血清中的抗原或抗體來確定體內是否存有ASFV。此類診斷方法繁多，也很成熟，主要優(yōu)缺點見表2。FAT 一般作為輔助性檢測方法，當用于亞急性或慢性疾病檢測時，其靈敏性不如ELISA 或熒光定量PCR；ELISA 診斷技術雖然已經(jīng)很成熟，但操作繁瑣，要求較高；GICA、LFA 檢測迅速，但只能用于初步診斷，不能定量，適用于基層診斷；IBT 成本較高，操作復雜，適用于實驗室定性定量等專業(yè)測定。實際診斷運用中，常常聯(lián)合應用多種診斷方法，各取所長。

表2 ASFV 血清學檢測技術及其優(yōu)缺點

3 展望

ASF 是外來動物疫病，但已在全球流行近百年，一旦暴發(fā)便會對疫區(qū)造成災難性打擊。目前尚未研制出有效商業(yè)化疫苗，用于ASF 早期預防，這就需要效率更高的診斷技術用于ASF 排查。綜上不難發(fā)現(xiàn)，病原學診斷和血清學診斷技術應用廣泛，其中qPCR、RPA、GICA、LAMP 等技術靈敏快速，近年來發(fā)展迅速，在ASF 暴發(fā)前能起到高效排查作用，具有很好的發(fā)展前景。各種診斷方法雖很成熟，但各有優(yōu)缺點，今后的發(fā)展趨勢在于不同診斷技術的聯(lián)合應用，如RPA-LFD、多重PCR聯(lián)合自動電子芯片[38]等。