新疆某豬場(chǎng)母豬繁殖障礙病病原學(xué)檢測(cè)和毒株鑒定

范士龍，劉丹丹，韋麗婷，巴音查汗，張 偉

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052）

母豬繁殖障礙是影響規(guī)模化養(yǎng)豬穩(wěn)定健康發(fā)展的重要因素之一，其特征為妊娠母豬發(fā)生流產(chǎn)，產(chǎn)死胎、木乃伊胎、畸形胎和弱仔，有的甚至不育[1]。母豬繁殖障礙病因復(fù)雜，有非傳染性和傳染性兩大類。傳染性因素主要包括病毒、細(xì)菌和寄生蟲，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)多種病原的混合感染，因而增加了疾病診斷的難度；非傳染性因素主要包括先天遺傳、機(jī)能障礙、營養(yǎng)不良和管理不當(dāng)?shù)?，多為個(gè)體發(fā)病[2]。為確診新疆地區(qū)某規(guī)?；庇i場(chǎng)母豬繁殖障礙的病因，本試驗(yàn)應(yīng)用PCR、RT-PCR、realtime RT-PCR 方法，對(duì)豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）、偽狂犬病病毒（PRV）、豬細(xì)小病毒（PPV）、弓形蟲等4 種能夠引起母豬繁殖障礙的常見病原進(jìn)行檢測(cè)，為新疆地區(qū)豬場(chǎng)繁殖障礙的病因調(diào)查提供檢測(cè)依據(jù)。

1 材料

1.1 病料樣品

2018 年4 月，新疆某規(guī)?；庇i場(chǎng)出現(xiàn)懷孕母豬后期流產(chǎn)，以及產(chǎn)仔死胎、木乃伊胎和弱仔等現(xiàn)象，發(fā)病母豬主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減少或廢絕、發(fā)熱和不同程度的呼吸困難，出生仔豬體質(zhì)較弱，不易成活，并出現(xiàn)后肢劈叉等神經(jīng)癥狀。本試驗(yàn)采集新鮮死亡胎兒組織樣品以及母豬流產(chǎn)排泄物棉拭子進(jìn)行病原檢測(cè)。

1.2 主要試劑

Prime Script 1 step Enzyme Mix、2×1 step Butter、RNase-free ddH2O、DL 2 000 bp Marker、AxyPerp 體液病毒DNA/RNA 小量試劑盒：購自TaKaRa 公司；PRRSV（北美株）通用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 診斷試劑盒、PRV 實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)試劑盒、弓形蟲PCR 檢測(cè)試劑盒：購自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司；PPV 試劑檢測(cè)盒（實(shí)時(shí)熒光PCR）：購自武漢科前生物股份有限公司。

1.3 主要器材

Thermo Micro 21R 離心機(jī)、PCR 擴(kuò)增儀：購自Thermo 公司。其他儀器包括：BIO-RAD CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀、電泳儀、組織研磨機(jī)等。

1.4 引物

參考孫海峰等[3]設(shè)計(jì)的PRRSV 特異性鑒別引物：NSP2 R-5' ATGTTGTGCTTCCTGGGGTTG3'，NSP2 F-5' CTTGACAGGGAGCTGCTTGA3'，由生工生物工程上海股份公司合成。

2 方法

2.1 病料處理及核酸提取

2.1.1 PRRSV 檢測(cè)病料處理 取0.1 g 組織樣品，加入1 mL 生理鹽水，使用研磨器充分研磨，12 000 r/min 離心1 min；取上清液200 mL，使用AxyPerp體液病毒DNA/RNA小量試劑盒抽提核酸。

2.1.2 PRV 檢測(cè)病料處理 取0.15 g 組織樣品，加入1 mL 生理鹽水，使用研磨器充分研磨，10 000 r/min 離心1 min；取上清液100 mL 加入無菌離心管中，再加入200 μL 消化液和20 μL 蛋白酶K，振蕩混勻后，置56 ℃水浴消化1 h。

2.1.3 PPV 檢測(cè)病料處理 PPV 病料處理同2.1.2。

2.1.4 弓形蟲檢測(cè)病料處理 將拭子置于無菌生理鹽水中混勻，轉(zhuǎn)至1.5 mL 滅菌離心管內(nèi)，8 000 r/min離心2 min；取上清液100 μL 于1.5 mL 無菌離心管中，加入200 μL 消化液和20 μL 蛋白酶K，振蕩混勻后，置56 ℃水浴消化1 h。

2.2 病原檢測(cè)

2.2.1 PRRSV 使用PRRSV（北美株）通用實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR 診斷試劑盒檢測(cè)，反應(yīng)體系為25 μL，熒光信號(hào)采集為FAM 通道，預(yù)變性42 ℃5 min，95 ℃ 10 s，（95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s）×40循環(huán)。判定標(biāo)準(zhǔn)：Ct ≤35 為陽性，35 ＜Ct ≤37為可疑（需再次檢測(cè)，若還是可疑，判為陽性），Ct ＞37 為陰性。

2.2.2 PRV 使用PRV 實(shí)時(shí)熒光PCR 試劑盒檢測(cè)，反應(yīng)體系為20 μL，熒光信號(hào)采集為FAM 通道，95 ℃ 52 min，（95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s）×40 個(gè)循環(huán)。判定標(biāo)準(zhǔn)：Ct ≤30，且有明顯指數(shù)增長，為陽性；30 ＜Ct ≤35，為可疑，此時(shí)應(yīng)重新檢測(cè)熒光定量，如仍為可疑，且有明顯指數(shù)增長，判為陽性；Ct ＞35，為陰性。

2.2.3 PPV 采用PPV 試劑檢測(cè)盒（實(shí)時(shí)熒光PCR）檢測(cè)，反應(yīng)體系為25 μL，熒光信號(hào)采集為FAM 通道，UNG 處理50 ℃ 2 min，預(yù)變性95 ℃3 min，（95 ℃ 5 s、55 ℃ 1 min）×40 個(gè)循環(huán)。判定標(biāo)準(zhǔn)：Ct ≥36，且有明顯指數(shù)增長，為陽性；36 ＜Ct ≤39，為可疑，此時(shí)樣品應(yīng)重新檢測(cè)，如仍為可疑，判為陽性；Ct ＞39 或無Ct 值，為陰性。

2.2.4 弓形蟲 使用弓形蟲PCR 檢測(cè)試劑盒，反應(yīng)體系為20 μL，在PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下程序：94 ℃預(yù)變性30 s，（94 ℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃30 s）×35 個(gè)循環(huán)。陽性對(duì)照若出現(xiàn)319 bp 擴(kuò)增帶，陰性對(duì)照無帶出現(xiàn)時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果成立。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.2.5 毒株鑒定 采用AxyPerp 體液病毒DNA/RNA 小量試劑盒提取核酸：2×1step Butter 12.5 μL，RNase-free ddH2O 7.5 μL，NSP2 F/R各1 μL，核酸模板2 μL。使用PCR 擴(kuò)增儀擴(kuò)增，反應(yīng)體系25 μL，94 ℃預(yù)變性5 min，（94 ℃ 50 s、50 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s）×35 個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，PCR 產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳鑒別。

3 結(jié)果

3.1 PRRSV 通用熒光定量PCR 檢測(cè)

檢測(cè)樣品兩組Ct 值拷貝量分別為22.71、22.82，Ct ＜35，判定為陽性（圖1）。

○. 標(biāo)準(zhǔn)品；×. 樣品；1～5. 標(biāo)準(zhǔn)品；6. 陽性對(duì)照；7. 陰性對(duì)照；8. 檢測(cè)樣品。圖1 PRRSV 熒光定量檢測(cè)結(jié)果

3.2 PRV、PPV 熒光定量檢測(cè)

PRV 樣品檢測(cè)Ct ＞35，判定為陰性（圖2）；PPV 樣品檢測(cè)無Ct 值，判定為陰性（圖3）。

1. 陽性對(duì)照；2. 陰性對(duì)照；3. 檢測(cè)樣品。圖2 PRV 熒光定量檢查結(jié)果

3.3 弓形蟲PCR 檢測(cè)

根據(jù)PCR 產(chǎn)物電泳結(jié)果，樣品未出現(xiàn)目的條帶，結(jié)果判定為陰性（圖4）

1. 陽性對(duì)照；2. 陰性對(duì)照；3. 檢測(cè)樣品。圖3 PPV 熒光定量檢測(cè)結(jié)果

M. DL 2 000 bp DNA Maker；1. 陰性對(duì)照；2. 陽性對(duì)照；3. 檢測(cè)樣品。圖4 弓形蟲PCR 檢測(cè)結(jié)果

3.4 毒株鑒定

對(duì)陽性樣品PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)電泳結(jié)果，發(fā)現(xiàn)檢測(cè)樣品出現(xiàn)條帶且較亮，大小為608 bp（圖5），鑒定為PRRSV類NADC30株。

M. DL 2 000 bp DNA Maker；1. 陽性對(duì)照；2. 陰性對(duì)照；3. 檢測(cè)樣品。圖5 PRRSV 毒株鑒定結(jié)果

4 討論

由PRRSV 引起的豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）俗稱藍(lán)耳病，以母豬繁殖障礙和仔豬肺炎為主要特征。在我國大部分地區(qū)都有該病毒的流行，為豬場(chǎng)的常在性疾病。PRRSV 具有高變異性和免疫抑制性，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大困擾[4]。該病毒分為兩個(gè)基因型，即以LV 為代表的歐洲型和以VR2332 為代表的美洲型，在我國流行的主要為美洲型，而NADC30 是由美洲型變異而來的[5-6]。NADC30 是2008 年由美國國家動(dòng)物疾病研究中心（NADC）研究人員首次分離并命名[7]。2014 年，周峰等[8]根據(jù)部分NSP2 基因和GP5 基因，首次報(bào)道了國內(nèi)出現(xiàn)與NADC30 高度同源的PRRSV。目前已有的研究顯示，NADC30 毒株和PRRSV高致病性毒株、經(jīng)典毒株以及各種弱毒疫苗毒株均可以發(fā)生基因重組[9]。因此，自2014 年以來，PRRSV 類NADC30 毒株臨床檢出率呈現(xiàn)暴發(fā)式增長，大量研究報(bào)道證明，該類毒株在我國大部分省市已廣泛流行，開始成為主要的PRRSV 流行毒株[10]。

由于本次試驗(yàn)的樣品只對(duì)發(fā)病豬進(jìn)行了采樣，沒有全群采樣，況且僅對(duì)PRRSV、PRV、PPV 和弓形蟲等4 種能夠引起母豬繁殖障礙的常見病原進(jìn)行檢測(cè)，因此既不能排除該場(chǎng)還有其他母豬繁殖障礙疾病病原的存在，也不能排除該場(chǎng)臨床健康豬群中存在PRV、PPV 和弓形蟲等病原的可能。如呂美芹等[11]在2010—2017 年對(duì)全國大部分省市規(guī)?；i場(chǎng)，通過血清學(xué)抗體檢測(cè)進(jìn)行連續(xù)跟蹤分析，發(fā)現(xiàn)PRV 流行自2011 來呈上升趨勢(shì)。李志飛等[12]對(duì)甘肅省涼山區(qū)規(guī)模場(chǎng)進(jìn)行了PPV 流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)PPV 引起的母豬繁殖障礙較為普遍。邱美珍等[13]采用間接酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA），對(duì)14 個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)共184 份母豬血清進(jìn)行豬弓形蟲抗體檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)母豬群弓形蟲總感染率為58.7%，流產(chǎn)母豬弓形蟲感染率為90.0%，可見弓形蟲感染也是母豬流產(chǎn)的一個(gè)重要因素。引起母豬繁殖障礙病的病原有多種，因此今后需要開展系統(tǒng)的流行病學(xué)調(diào)查，明確引起母豬繁殖障礙的病因，這對(duì)于此病的綜合防控具有重要意義。

PRRSV 對(duì)不同品種以及不同年齡和用途的豬群均可感染，可通過接觸以及空氣和精液傳播，豬感染病毒后2～14 周，均可通過接觸將病毒傳播給其他易感豬群，直接接觸或間接接觸均可感染。感染豬的流動(dòng)也是本病的重要傳播方式。持續(xù)感染不僅會(huì)影響豬生長速度，而且還會(huì)不斷向環(huán)境中排毒，造成健康豬群感染，使病毒很難在豬群中徹底清除。發(fā)病豬場(chǎng)為繁育場(chǎng)，以母豬和仔豬發(fā)病為主，病原很有可能來源于種公豬；其次，此繁育場(chǎng)為下游多家育肥場(chǎng)提供仔豬，如果來往于豬場(chǎng)間的運(yùn)輸車輛消毒不徹底，病原就極有可能被帶入豬場(chǎng)，造成不同毒株交叉感染，增加了基因重組的幾率；再次，此豬場(chǎng)使用時(shí)間較久，場(chǎng)內(nèi)許多設(shè)施均有不同程度的損壞，例如消毒、通風(fēng)、排水設(shè)施性能下降，導(dǎo)致豬舍內(nèi)衛(wèi)生環(huán)境不達(dá)標(biāo)，不能及時(shí)消除病原，造成直接感染。以上各種因素的共同存在給該病防控造成很大困難。

對(duì)于類NADC30 毒株，此前在新疆未有報(bào)道。本次檢測(cè)結(jié)果表明，類NADC30 毒株已經(jīng)蔓延到新疆地區(qū)，并開始對(duì)本地區(qū)生豬養(yǎng)殖業(yè)造成危害。隨著近幾年經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，新疆養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模不斷擴(kuò)大，與內(nèi)地養(yǎng)殖業(yè)交流不斷加深，開始引進(jìn)優(yōu)質(zhì)品種。在交流與引種過程中，如果生物安全措施不到位，就有可能導(dǎo)致病原被人為帶入。

針對(duì)PRRSV 防控，我國主要依賴于高強(qiáng)度的疫苗免疫，但防控效果不佳，臨床流行毒株的遺傳多樣性仍在繼續(xù)加大，毒株遺傳進(jìn)化速度也在進(jìn)一步加快[14]。因此，采取有效行動(dòng)來阻止或者降低類NADC-30 毒株的暴發(fā)風(fēng)險(xiǎn)顯得十分重要：第一，對(duì)豬場(chǎng)進(jìn)行合理選址與規(guī)劃，批次內(nèi)全進(jìn)全出；第二，建立完備的消毒防疫制度，普及生物安全重要性認(rèn)識(shí)，定期檢查，對(duì)從疫區(qū)內(nèi)歸來人員嚴(yán)格隔離；第三，根據(jù)臨床癥狀和檢測(cè)數(shù)據(jù)，及時(shí)淘汰敏感母豬；第四，后備豬進(jìn)場(chǎng)必須隔離，并建立長期的病原監(jiān)測(cè)程序，定期進(jìn)行抗體監(jiān)測(cè)?？傊?，原則上最好引進(jìn)PRRSV 陰性后備豬，或自繁自養(yǎng)，實(shí)現(xiàn)后備豬的自我供應(yīng)，逐漸淘汰陽性豬，保持豬群的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)區(qū)域性的PRRSV 凈化。

5 結(jié)論

檢測(cè)表明，PRRSV 類NADC30 毒株是導(dǎo)致該繁育場(chǎng)大規(guī)模生產(chǎn)母豬繁殖障礙的重要病原，同時(shí)也說明該新型毒株已在新疆地區(qū)流行，并對(duì)當(dāng)?shù)仞B(yǎng)豬業(yè)形成了威脅，需引起關(guān)注，并做好定期監(jiān)測(cè)和引種檢疫工作。本研究為新疆地區(qū)母豬繁殖障礙病的病因調(diào)查提供了依據(jù)。