隱匿性乙型肝炎病毒發(fā)生分子機(jī)制的研究進(jìn)展

張莉　邱艷

[摘要] 隱匿性乙型肝炎病毒感染（OBI）指用高靈敏度的核酸檢測(cè)可在HBsAg陰性感染者肝組織中檢測(cè)到HBV DNA。本文介紹了OBI形成的基因分子機(jī)制：s、p、x和c基因的開放閱讀框突變、起始密碼子和終止密碼子突變;基因調(diào)控序列突變影響轉(zhuǎn)錄過程及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控;表觀遺傳調(diào)控。目前OBI個(gè)體HBV復(fù)制、基因表達(dá)過程中的表觀遺傳調(diào)控研究尚處于起步階段，研究前景廣闊。此外，本文對(duì)歐洲、南非、東南亞以及中國獻(xiàn)血者OBI形成的基因分子生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行了梳理和匯總。

[關(guān)鍵詞] 隱匿性乙型肝炎病毒感染;乙肝表面抗原;乙肝表面抗體;基因分子機(jī)制;表觀遺傳調(diào)控;獻(xiàn)血者

[中圖分類號(hào)] R575.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）06（b）-0023-05

Advance of molecular mechanism of occult hepatitis B virus

ZHANG Li? ?QIU Yan

Beijing Red Cross Blood Center， Beijing? ?100088， China

[Abstract] Occult hepatitis B virus infection （OBI） means that HBV DNA can be detected in liver tissues of HBsAg negative infected people with highly sensitive nucleic acid detection. This paper introduces the gene molecular mechanism of OBI formation： open reading frame mutation， initiation codon and termination codon mutations of s， p， x and c genes; effect of mutations of gene regulatory sequences on transcriptional processes and post-transcriptional regulation; epigenetic regulation. At present， the studies on epigenetic regulation during the process of HBV replication and gene expression in OBI individuals are still in its infancy， with broad research prospect. In addition， this paper summarizes the gene molecular mechanisms of OBI formation in blood donors of Europe， South Africa， Southeast Asia and China.

[Key words] Occult hepatitis B virus infection; Hepatitis B surface antigen; Hepatitis B surface antibody; Gene molecular mechanisms; Epigenetic regulation; Blood donors

隱匿性乙型肝炎病毒感染（occult HBV infection，OBI）指現(xiàn)有血清學(xué)技術(shù)檢測(cè)HBV感染者乙肝表面抗原（HBsAg）陰性，用高靈敏度的核酸檢測(cè)方法在血清和/或肝組織中可檢測(cè)到HBV DNA。早期研究認(rèn)為OBI形成可能的原因有：①e抗原血清學(xué)轉(zhuǎn)換后，在長期的病毒無復(fù)制期檢測(cè)不到HBsAg;②由于HBV基因發(fā)生變異，導(dǎo)致HBsAg無法合成或無法通過血清學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè);③其他病毒（HDV、HCV）合并感染干擾HBV的復(fù)制[1]。本文在基因水平簡(jiǎn)述OBI形成的分子機(jī)制。

1 HBV基因組的基本構(gòu)成

HBV基因組DNA是長約3.2 kb的環(huán)狀、部分雙螺旋結(jié)構(gòu)，包含編碼包膜蛋白（S）、核殼（C）、聚合酶（P）及X蛋白的4個(gè)高度重疊的開放閱讀框（open reading frame，ORF）。見圖1。s基因上游的前-s1、前-s2和c基因上游的前c基因可通讀翻譯S1、S2蛋白和C蛋白相關(guān)抗原。調(diào)控基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列位于編碼基因內(nèi)部，啟動(dòng)子（promoter）序列尚不清楚，增強(qiáng)子（enhancer，ENH）位于p基因中;polyA附加信號(hào)位于c基因ORF中。

根據(jù)全部核苷酸序列的差異≥8%將HBV分為A～I(xiàn) 9個(gè)基因型[2]，同一基因型內(nèi)又有不同基因亞型。HBV基因型呈地理區(qū)域性分布，在不同人種中流行及傳播方式各異。

2 OBI形成的分子機(jī)制

2.1 基因突變與OBI的形成

2.1.1 s基因主要親水區(qū)（major hydrophilic region，MHR）的突變? OBI血清中缺乏可檢測(cè)到的HBsAg，HBV s基因中MHR序列突變引起HBsAg表達(dá)和分泌減少是造成這種現(xiàn)象的原因之一。MHR位于HBsAg膜外區(qū)的99～169位氨基酸區(qū)域。其124～147位氨基酸序列相對(duì)保守，稱為“a”抗原決定簇（“a”determinant）[3-4]。MHR是中和抗體作用的主要靶區(qū)域，對(duì)HBsAg抗原性具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，OBI個(gè)體S蛋白突變可發(fā)生于“a”抗原決定簇126、129、130～134、141、142、144和145氨基酸位點(diǎn)，其中G145R最常見。其兩側(cè)其他突變?nèi)鏠101R/H、E164D等均可能與OBI發(fā)生有關(guān)[5-6]。Lusida等[7]報(bào)道HBV S蛋白的a決定簇區(qū)域可檢測(cè)到T126I、T123A、M133L和T143M氨基酸替換。Bes等[8]分析24例HBV/D OBI獻(xiàn)血者的s基因、前s基因、前c/c抗原基因，發(fā)現(xiàn)s基因突變頻率明顯比c基因高，且突變多集中在MHR。Rastegarv等[9]報(bào)道感染HBV/D（ayw）亞型血液透析患者的S蛋白區(qū)域存在T127P、P153L和F170S氨基酸位點(diǎn)的突變或者替換。Liao等[10]擴(kuò)增并測(cè)序OBI獻(xiàn)血者的preS/S基因，MHR中OBI相關(guān)的S蛋白突變（S117T、T118K、T131N、T134Y/L和D144E）發(fā)生率顯著高于對(duì)照組（慢性乙肝患者）（51.16%比12.96%，P < 0.01），且這些突變往往“共”存在。另外，OBI標(biāo)本中還檢測(cè)到>33個(gè)堿基對(duì)的preS缺失。涂東晉等[11]擴(kuò)增10例（10/66）OBI標(biāo)本的s基因序列，其中7例S區(qū)氨基酸發(fā)生突變，6例突變發(fā)生在“a”抗原決定簇及周邊MHR。王曉存等[12]在33例s基因陽性O(shè)BI樣本中發(fā)現(xiàn)9例MHR氨基酸發(fā)生了變異，發(fā)生頻率由高到低依次為T143S、I110L、S113T、T126I、K122R、K160R、F134Y和K159G。以上研究結(jié)果提示，MHR突變?cè)诤艽蟪潭壬蠜Q定了HBV的隱匿性感染。

2.1.2 其他基因ORF的突變? Kim等[13]選取10例韓國特有的HBVC型大表面蛋白（LHBs）突變體進(jìn)行序列分析，發(fā)現(xiàn)KD（W36L、T47K、N52D）等5例氨基酸突變位于MHR之外，且為OBI個(gè)體特有。這些突變?cè)诤艽蟪潭壬嫌绊懥薍BsAg胞內(nèi)和胞外的分泌。Rendon等[14]報(bào)道在晚期肝病OBI患者中編碼P蛋白的重疊序列發(fā)生改變以及Q219R突變，后者提示了A2915G突變?cè)贠BI發(fā)病機(jī)制中的作用。HBV X蛋白是體內(nèi)和體外病毒復(fù)制所必需的，x基因部分缺失和起始密碼子突變均可導(dǎo)致病毒OBI狀態(tài)。Kim等[15]在6例接種過HBV疫苗的OBI病例中檢測(cè)到共同的突變類型（X8Del），即HBV X基因（HBxAg）的C末端區(qū)域有8個(gè)堿基對(duì)缺失。進(jìn)一步體外和體內(nèi)分析表明，與野生型比較，X8Del HBxAg變異體減少了HBsAg和HBV病毒粒子的分泌，這可能是導(dǎo)致HBV疫苗接種者隱匿性感染的原因。Fujise等[16]發(fā)現(xiàn)OBI病例中x基因起始密碼子ATG（蛋氨酸）突變?yōu)镚TG（纈氨酸），且A1762T和G1764A發(fā)生核苷酸交換。HBV c基因ORF編碼核心蛋白和HBeAg。Chamni等[17]報(bào)道泰國OBI獻(xiàn)血者C區(qū)的突變（65%）位于基礎(chǔ)核心啟動(dòng)子區(qū)域（A1762T / G1764A）和前核心區(qū)域（G1896A）。

2.2 HBV基因調(diào)控序列突變影響轉(zhuǎn)錄過程及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控導(dǎo)致OBI形成

基因突變包括點(diǎn)突變、基因片段的插入或者缺失等。Chen等[6]首次報(bào)道了1例OBI患者前s/s基因區(qū)域的13種突變，涉及核苷酸缺失、插入以及前s1和前s2起始密碼子的突變。與野生型比較，這13種新型核苷酸突變體的HBsAg表達(dá)水平降低了51.2%～99.9%，前s1區(qū)域3046～3177缺失突變體造成病毒復(fù)制能力和表面抗原啟動(dòng)子Ⅱ活性分別下降了43.3%和97.0%。Candotti等[18]報(bào)道，發(fā)生在B型和C型OBI中的前s2/s剪接體位點(diǎn)的突變可影響pre-s2/s mRNA剪接，造成HBsAg分泌受限。Wei等[19]報(bào)道X基因的突變可發(fā)生在復(fù)制調(diào)控元件、BCP和增強(qiáng)子Ⅱ。Biswas等[20]分析OBI獻(xiàn)血者的基礎(chǔ)核心啟動(dòng)子（BCP）和前核心蛋白（Pre-C）突變，發(fā)現(xiàn)BCP區(qū)域常見的6～8種核苷酸突變（1752～1773及1814核苷酸）。Rendon等[14]報(bào)道HBx、HBeAg、HBcAg和核心蛋白啟動(dòng)子的突變（A1762T、G1764A、C1766T和T1768A）。

陳靜娜等[21]從OBI獻(xiàn)血者樣本中擴(kuò)增得到c區(qū)突變基因轉(zhuǎn)染Hu H7細(xì)胞和注射Balb/c小鼠，檢測(cè)HBcAg和HBeAg的表達(dá)水平。與野生型比較，c區(qū)突變型顯著性下調(diào)HBeAg和HBcAg的表達(dá)水平，形成OBI。劉妍等[22]為分析HBV s基因MHR的N-糖基化突變與OBI發(fā)生機(jī)制的關(guān)系，設(shè)計(jì)系列實(shí)驗(yàn)證實(shí)MHR區(qū)N-糖基化突變?cè)斐傻腍BsAg抗原性降低是引起OBI原因之一。

由于HBV基因的高度重疊，核苷酸位點(diǎn)和/或基因片段的缺失、插入或者突變以及翻譯后蛋白的修飾突變往往不僅造成一個(gè)蛋白基因的轉(zhuǎn)錄或者轉(zhuǎn)錄后調(diào)控?zé)o法正常進(jìn)行，還會(huì)影響相鄰蛋白甚至幾個(gè)蛋白的合成或者空間結(jié)構(gòu)形成受阻，這些直接或者間接導(dǎo)致OBI的形成。由于OBI個(gè)體主要表現(xiàn)為HBV粒子表面HBsAg表達(dá)障礙，因此對(duì)s基因序列分析以及調(diào)控研究歷時(shí)已久并且較為深入。但隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，OBI的形成還不僅僅局限在基因的突變和轉(zhuǎn)錄調(diào)控方面。

2.3 表觀遺傳調(diào)控與OBI的形成

除了基因突變，HBV病毒復(fù)制和基因表達(dá)受到抑制也是OBI形成的重要原因。DNA甲基化是一種常見的細(xì)胞防御機(jī)制，可致入侵的外源DNA或者病毒基因組靜默。HBV基因組中有3個(gè)CpG島，分別分布在s基因ATG翻譯起始區(qū)（CpG島-Ⅰ）、x基因啟動(dòng)子的增強(qiáng)區(qū)（CpG島-Ⅱ）和p基因ATG翻譯起始區(qū)（CpG島-Ⅲ）。在HBV感染的肝癌患者（HCC）和肝細(xì)胞樣本中發(fā)現(xiàn)CpG島-Ⅰ和Ⅲ都存在甲基化。Vivekanandan等[23]研究發(fā)現(xiàn)A型HBV DNA可以在人體組織中甲基化，進(jìn)而調(diào)控基因的復(fù)制和表達(dá)。Kaur等[24]發(fā)現(xiàn)HCC組織中HBV基因組的CpG島-Ⅰ經(jīng)常發(fā)生甲基化，這可能與肝癌的發(fā)展相關(guān)。Vivekanandan等[25]分析5例OBI的全長基因序列發(fā)現(xiàn)OBI個(gè)體HBV基因CpG島-Ⅱ的甲基化較CpG島-Ⅰ明顯密集，這與HBV陽性對(duì)照組的情況恰恰相反。

HBV共價(jià)閉合環(huán)狀DNA（cccDNA）是HBV循環(huán)復(fù)制的中間體，也是OBI形成的分子基礎(chǔ)。cccDNA可結(jié)合組蛋白和非組蛋白形成穩(wěn)定的小染色體（minichromosomes）。免疫沉淀反應(yīng)顯示在siRNA、去乙酰化酶和/或藥物誘導(dǎo)下，cccDNA結(jié)合的H3和H4組蛋白的乙?；癄顟B(tài)可以調(diào)控HBV的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄[26]。表觀遺傳調(diào)控對(duì)HBV復(fù)制、轉(zhuǎn)錄以及影響OBI形成的研究尚處于起步階段。

3 獻(xiàn)血人群OBI HBV基因的研究

1978年，Hoofnagle等[27]首次報(bào)道OBI獻(xiàn)血者傳染HBV。Sosa-Jurado等[28]在墨西哥HBV/H的OBI獻(xiàn)血者樣本中檢測(cè)出“a”抗原決定簇的多種突變。Kishk等[29]報(bào)道HBV/D OBI獻(xiàn)血者樣本中Q129R突變明顯高于HBV顯性感染組（P = 0.01），而后者S143L/T和P120T/S氨基酸替換比例高于前者。另有研究報(bào)道，在病毒載量很低（<50 copies）的E型OBI獻(xiàn)血者樣本中，聚合酶基因逆轉(zhuǎn)錄酶結(jié)構(gòu)域的L217R多態(tài)性顯著高于HBsAg陽性對(duì)照組（P < 0.0001）[30]。Liao等[10]、Biswas等[20]擴(kuò)增并測(cè)序OBI獻(xiàn)血者的preS/S基因、前核心蛋白（Pre-C）得到多種核苷酸突變。Candotti等[18]報(bào)道，東南亞HBV B（60%）或C型（34%）OBI獻(xiàn)血者中，pre-S2/S剪接體周邊突變普遍存在[B型（44%）和C型（36%）]。細(xì)胞轉(zhuǎn)染試驗(yàn)中這一突變使HBsAg粒子分泌減少。剪接體的缺失突變可能是東南亞獻(xiàn)血者OBI形成的主要原因之一。

1992年新生兒乙肝疫苗接種計(jì)劃實(shí)施后，至2006年我國人口的乙肝流行率仍為7.18%[31]。人群HBV的高流行率造成OBI在獻(xiàn)血人群中較高的流行率。OBI獻(xiàn)血者仍然是影響我國輸血安全的潛在威脅。

Zhang等[32]用3個(gè)OBI獻(xiàn)血者的MHR代表性突變構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2或Huh7細(xì)胞。之后檢查HBsAg的表達(dá)和抗原性。與野生型毒株比較，胞外上清液和細(xì)胞內(nèi)HBsAg水平均降低明顯。OBI相關(guān)突變引起的抗原性降低是HBsAg不易檢測(cè)到的主要原因。王東等[33]報(bào)道大連地區(qū)OBI獻(xiàn)血者以HBV/C為主，其次為HBV/B。擴(kuò)增其前s/s基因序列，獲得HBV/C的氨基酸變異多集中在118、127、164等區(qū)域，HBV/B的變異多集中在161、168、217區(qū)域。趙亮等[34]報(bào)道，福州OBI獻(xiàn)血者中HBV/B是主要流行病毒株（15/16），對(duì)HBV/B的s基因測(cè)序發(fā)現(xiàn)，MHR氨基酸的變異多集中在“a”抗原決定簇（25/33），變異的形式主要為單個(gè)氨基酸點(diǎn)替換，OBI組變異率高于對(duì)照組（HBsAg+/HBV DNA+）。另有7例標(biāo)本在124位與125位氨基酸的密碼子間發(fā)生了9個(gè)堿基的非移碼插入，造成該位點(diǎn)“TNR”3個(gè)氨基酸的插入。蔣菲菲等[35]分析安徽、福建、江西三地血液中心OBI獻(xiàn)血者s基因變異情況，報(bào)道35例OBI標(biāo)本擴(kuò)增產(chǎn)物中，74.3%（26/35）出現(xiàn)HBV s基因MHR區(qū)氨基酸置換突變，主要集中在“α”抗原決定簇區(qū)域。

葉賢林等[36]報(bào)道經(jīng)HBsAg及NAT檢測(cè)合格的抗-HBc（+）獻(xiàn)血者，其血液中仍有一定概率含有HBV DNA，存在經(jīng)輸血傳播病毒的威脅。因此，輸血之前對(duì)獻(xiàn)血者OBI的篩查十分必要。

4 小結(jié)

當(dāng)前，HBV仍然是輸血安全領(lǐng)域的焦點(diǎn)之一，表面健康、無癥狀獻(xiàn)血者中較高的OBI流行率需要特別關(guān)注。HBV編碼基因、調(diào)控序列的突變以及表觀遺傳調(diào)控對(duì)病毒隱匿性特征形成的分子機(jī)制研究對(duì)保障輸血安全、臨床診斷和HBV流行病學(xué)監(jiān)控具有重要意義。目前，在沒有抗-HBc檢測(cè)的情況下，NAT單檢是最為準(zhǔn)確的OBI檢測(cè)[37]。然而，靈敏度更高的檢測(cè)技術(shù)可有效降低免疫學(xué)檢測(cè)合格獻(xiàn)血者中OBI的流行率，基于基因水平的、針對(duì)不同基因型、不同核苷酸突變的分子生物學(xué)檢測(cè)方案的建立十分必要。

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