針刺對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠心肌ANP、ACE2表達(dá)和Ang（1-7）/AngⅡ 比值的影響

紀(jì)智　袁靜云　王紫娟　張躍　梁靖蓉　吳嬌娟　劉清國

[摘要] 目的 通過觀察自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）心肌組織結(jié)構(gòu)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAS）作用因子表達(dá)的變化，探究針刺對(duì)高血壓心肌肥厚的防護(hù)機(jī)制。 方法 將10只WKY大鼠作為空白組，將20只SHR按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組和針刺組，每組各10只。所有大鼠均為10周齡SPF級(jí)雄性大鼠。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，針刺組大鼠用毫針于“百會(huì)”和雙“太沖”直刺，每天1次，連續(xù)干預(yù)28 d。模型組和空白組不做針刺干預(yù)。于實(shí)驗(yàn)第1、7、14、21、28天針刺前測(cè)量血壓值。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后稱取大鼠全心及左心室重量，并計(jì)算心臟重量指數(shù)（HWI）和左心室重量指數(shù)（LVWI）。應(yīng)用HE和Masson染色法觀察心肌組織形態(tài)，并通過Real-tiem PCR、Western blot、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）等技術(shù)檢測(cè)各組大鼠心肌組織中心房鈉尿肽（ANP）、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（ACE2）、血管緊張素1-7[Ang（1-7）]和AngⅡ的表達(dá)，并計(jì)算Ang（1-7）/AngⅡ。 結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠收縮壓（SBP）、HWI、LVWI顯著升高（P < 0.01）。與模型組比較，針刺組大鼠SBP、HWI、LVWI值明顯降低（P < 0.05或P < 0.01）。病理切片結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組大鼠心肌細(xì)胞的細(xì)胞體積明顯變大，且排列相對(duì)紊亂，同時(shí)細(xì)胞間距變寬，充斥著大量被藍(lán)染的纖維。與模型組比較，針刺組大鼠心肌細(xì)胞體積更小，細(xì)胞間距更窄，細(xì)胞間隙藍(lán)染的纖維變少。與空白組比較，模型組心肌組織的ACE2的表達(dá)水平和Ang（1-7）/AngⅡ顯著降低（P < 0.01），ANP的表達(dá)水平升高（P < 0.01）。與模型組比較，針刺組ACE2的表達(dá)水平和Ang（1-7）/AngⅡ的比值顯著升高（P < 0.01），ANP的表達(dá)水平降低（P < 0.01）。 結(jié)論 針刺“百會(huì)”“太沖”可通過調(diào)節(jié)ACE2/Ang（1-7）的表達(dá)，有效降低SHR血壓，并減輕其心肌肥厚的程度。

[關(guān)鍵詞] 高血壓;針刺;心肌肥厚;血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2;血管緊張素1-7

[中圖分類號(hào)] R544.1? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-7210（2019）06（b）-0004-05

Effect of acupuncture on the expression of ANP， ACE2 and Ang（1-7）/ AngⅡ ratio in heart tissue of spontaneously hypertensive rats

JI Zhi? ?YUAN Jingyun? ?WANG Zijuan? ?ZHANG Yue? ?LIANG Jingrong? ?WU Jiaojuan? ?LIU Qingguo

School of Acupuncture and Massage， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing? ?100029， China

[Abstract] Objective To investigate the protective mechanism of acupuncture on myocardial hypertrophy by observing the changes of myocardial tissue structure and renin angiotension system （RAS） system action factor expression in spontaneously hypertensive rats （SHR）. Methods Ten Wistar Kyoto rats （WKY） were selected as normal control group， 20 SHRs were divided into model group and acupuncture group by random number table method， with 10 rats in each group. All rats were SPF grade male 10-week-old rats. After one week of acclimatization， acupuncture was applied on Taichong （LR3） and Baihui （DU20） of SHRs in acupuncture group once a day for 28 days. The other two groups only received the same grasping and fixation stimulation. Blood pressure was measured before acupuncture on day 1， 7， 14， 21 and 28. At the end of the experiment， the weight of the whole heart and left ventricle of the rats were weighed， and ratio of left ventricle weight to body weight （LVWI）， heart weight index （HWI） were calculated. HE and Masson staining method were applied to observe the myocardial tissue morphology， and Real-time RCR， Western blot， enzyme linked immunosorbent assay （ELISA） were used to detect the expression of atrial natriuretic peptide （ANP）， angiotensin-converting enzyme 2 （ACE2）， angiotensin （1-7） [Ang（1-7）]， AngⅡ and Ang（1-7）/AngⅡ， as well as the underlying mechanisms were investigated. Results Compared with normal control group， the systolic blood pressure （SBP）， HWI and LVWI in the model group were significantly increased （P < 0.01）. Compared with the model group， SBP， HWI and LVWI values in the acupuncture group were significantly decreased （P < 0.05 or P < 0.01）. The pathological results showed that compared with normal control group， the cell volume of rat cardiac muscle cells in the model group was significantly larger， and the arrangement was relatively disordered. Meanwhile， the cell spacing was widened， and there were a lot of blue-stained fibers. Compared with the model group， the cardiac muscle cells in the acupuncture group were smaller in volume， narrower in cell spacing， and fewer blue-stained fibers in the cell space. Compared with normal control group， the expression level of ACE2 and Ang （1-7）/AngⅡ of myocardial tissue in model group significantly decreased （P < 0.01）， the expression level of ANP significantly increased （P < 0.01）. Compared with model group， the expression level of ACE2 and Ang （1-7）/AngⅡ in acupuncture group significantly increased （P < 0.01）， the expression level of ANP significantly decreased （P < 0.01）. Conclusion Acupuncture at LR3 and DU20 could reduce blood pressure and inhibit the development of cardiac hypertrophy， which might be mediated by the regulation of ACE2/Ang（1-7） pathway.

[Key words] Hypertension; Acupuncture; Myocardial hypertrophy; Angiotensin-converting enzyme 2; Angiotensin （1-7）

高血壓病患者的心臟損傷往往開始于病理性心肌肥厚，長時(shí)間的壓力負(fù)荷往往引起心肌細(xì)胞的肥大[1-2]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin system，RAS）在調(diào)節(jié)血壓、維持心肌正常結(jié)構(gòu)功能等方面具有極其重要的作用。血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2（angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）和血管緊張素1-7[angiotensin（1-7），Ang（1-7）]是RAS系統(tǒng)中起降壓作用的一條軸線，對(duì)心血管系統(tǒng)起到保護(hù)作用[3]。研究表明，針刺可降低血壓，改善心肌肥厚，預(yù)防其并發(fā)癥[4-5]。本研究通過觀察針刺對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）血壓和心肌肥厚程度及對(duì)ACE2/Ang（1-7）軸表達(dá)的影響，探究針刺調(diào)控的內(nèi)在機(jī)制，以期為高血壓和心肌肥厚的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF級(jí)10周齡雄性SHR大鼠20只，體重200～230 g，雄性Wistar-Kyoto（WKY）大鼠10只，體重220～240 g，均購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001。本研究中有所有對(duì)動(dòng)物進(jìn)行的操作，均符合北京中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)的規(guī)定。

1.2 儀器與試劑

無創(chuàng)式動(dòng)物尾壓測(cè)量儀（XH200，北京眾實(shí)科技有限公司）;韓氏電針儀（LH200H，南京濟(jì)生醫(yī)療科技有限公司）;漢醫(yī)牌針灸針（7 mm×0.13 mm，北京漢醫(yī)醫(yī)療器械中心）;超薄切片機(jī)（Leica UC7，德國徠卡公司）;正置光學(xué)顯微鏡（BX53，日本Olympus公司）;精密電子稱（ME104E，梅特勒托利多上海有限公司，精度1/10 000）;高速冷凍離心機(jī)（E3116R，美國安勝）;電泳儀（DYCP-31E，北京六一廠）。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒TIANScript RT Kit（北京天根生化科技有限公司）;Trizol試劑（15596026，美國Invitrogen生命技術(shù)科技有限公司）;BCA蛋白測(cè)定試劑盒（02912E，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）;ACE2抗體（ab108252，英國Abcam公司）;心房鈉尿肽（ANP）酶聯(lián)試劑盒（E02A0 493，上海藍(lán)基生物科技有限公司）;Ang（1-7）酶聯(lián)試劑盒（E02 A0206，杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）;AngⅡ酶聯(lián)試劑盒（E02A0204，杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司）;4%多聚甲醛（BL53 9A，合肥新恩源生物科技有限公司）;Masson染液套裝（G1006，武漢賽維爾生物科技有限公司）;HE染液（G1005，武漢塞維爾生物科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

將10只WKY大鼠作為空白組，以隨機(jī)數(shù)字表法將20只SHR大鼠分為模型組和針刺組，每組各10只，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。每天上午固定時(shí)間對(duì)針刺組大鼠進(jìn)行干預(yù)：參照大鼠標(biāo)準(zhǔn)穴位圖譜[6]將毫針刺入大鼠“百會(huì)”和雙側(cè)“太沖”，深度1～2 mm，行捻轉(zhuǎn)手法（60次/min）平補(bǔ)平瀉1 min，留針19 min。每天上午針刺1次，連續(xù)28 d。模型組和空白組不進(jìn)行針刺干預(yù)，僅進(jìn)行相同的抓取固定刺激。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.4.1 血壓測(cè)量? 測(cè)量血壓前先將大鼠放入無創(chuàng)血壓儀的電熱鼠籠中，于37℃下預(yù)熱約15 min后開始加壓，連續(xù)測(cè)量3次大鼠尾動(dòng)脈收縮壓（SBP）并取其平均值。于實(shí)驗(yàn)第1、7、14、21、28天針刺干預(yù)前測(cè)量血壓值，共5次。

1.4.2 心臟重量指數(shù)（HWI）和左心室重量指數(shù)（LVWI） 取材前先稱取大鼠體重。將大鼠心臟取出后，迅速以生理鹽水洗凈并吸干其表面液體。在冰上去除心臟周圍大血管和組織后稱取其重量，以心臟重量與體重的比值作為HWI（mg/kg）。然后沿室間切取左心室稱重，左心室與體重的比值即為LVWI（mg/kg）。

1.4.3 HE和Masson染色觀察心肌組織形態(tài)? 每組大鼠中隨機(jī)選取4只，取其心臟后于4%多聚甲醛中固定12 h，然后進(jìn)行染色。HE染色：依次將組織進(jìn)行脫水、包埋、脫蠟等操作后，切成4 μm切片并烘干，然后用蘇木精-伊紅染液染色，脫水后以二甲苯透明樹膠封片。Masson染色：依次將切片置于鐵蘇木精-麗春紅、磷鉬酸、苯胺藍(lán)染液浸染后脫水封片。通過光學(xué)顯微鏡觀察不同組別大鼠心肌組織形態(tài)的差異。

1.4.4 檢測(cè)心肌組織ANP、ACE2、Ang（1-7）和AngⅡ的表達(dá)水平? 將每組剩余6只大鼠的心臟取出后迅速用液氮冷凍，然后存放于-80℃冰箱中，以備Real-time PCR、Western blot和酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）使用。

Real-time PCR檢測(cè)ANP、ACE2的基因表達(dá)：在50 mg心臟組織中加入1 mL Trizol，在液氮條件下進(jìn)行研磨并提取總RNA。取8 μL RNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。然后按照TIANScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒的使用說明反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過NCBI-Primer3設(shè)計(jì)引物，并用ABI7500 PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增（ANP：上游GCTAG-ACCACCTGGAGGAGA，下游GTTGACTTCCCCAGTC-CAGG，擴(kuò)增長度136 bp;ACE2：上游GAGGAAAAGGCCGAGAGCTT，下游GACGCTTGATGGTCGCATTC，擴(kuò)增長度223 bp;內(nèi)參GAPDH：上游GACTCTACCCACGGCAAGTT，下游GGTGATGGGTTTCCCGTTGA，擴(kuò)增長度78 bp）。擴(kuò)增完成后60℃開始升溫，通過熔解曲線驗(yàn)證擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性是否良好，并通過軟件分析得到Ct值。大鼠心臟組織中ACE2和ANP基因的相對(duì)表達(dá)量以2-△△Ct的方式進(jìn)行計(jì)算。

Western blot檢測(cè)ACE2的蛋白表達(dá)：在50 mg心臟組織中加入500 μL裂解液，液氮條件研磨并提取總蛋白，按照BCA蛋白定量試劑盒的使用說明進(jìn)行蛋白定量，然后將蛋白按照10 μL/孔進(jìn)行上樣，電泳轉(zhuǎn)膜過后，用5%脫脂奶粉封閉孵育1 h。一抗稀釋（1∶1000）后置于4℃冰箱孵育過夜。第2天以TBST洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶10 000），然后在室溫下?lián)u床孵育40 min。TBST洗膜3次后，滴加ECL并靜置3 min后曝光顯影，使用Gel Image system ver.4.00軟件對(duì)所得條帶進(jìn)行分析，計(jì)算其灰度值，內(nèi)參為GAPDH。

ELISA法檢測(cè)ANP、Ang（1-7）和AngⅡ的蛋白表達(dá)：以3000 r/min（離心半徑13.5 cm）將心肌組織離心勻漿，10 min后取上清液，分裝后-20℃保存?zhèn)溆?。?yán)格按ELISA試劑盒說明書檢測(cè)心肌組織勻漿中ANP、AngⅡ和Ang（1-7）的蛋白含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 20.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，不同組間比較采用單因素方差分析，兩組之間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血壓比較

模型組大鼠SBP始終顯著高于空白組（P < 0.01），而針刺治療28 d后針刺組SBP顯著低于模型組（P < 0.01）。見圖1。

與空白組比較，△P < 0.01;與模型組比較，*P < 0.05，**P < 0.01。SBP：收縮壓;1 mmHg=0.133 kPa

2.2 各組大鼠LVWI和HWI比較

模型組大鼠LVWI、HWI明顯高于空白組（P < 0.01），而針刺組LVWI、HWI顯著低于模型組（P < 0.01）。見圖2。

與空白組比較，△△P < 0.01;與模型組比較，**P < 0.01。LVWI：左心室重量指數(shù);HWI：心臟重量指數(shù)

2.3 各組大鼠心肌組織形態(tài)比較

與空白組比較，模型組大鼠的心肌細(xì)胞體積明顯變大，細(xì)胞核增大深染。細(xì)胞之間距離變寬，且細(xì)胞間充斥著大量藍(lán)染的膠原纖維。與模型組比較，針刺組大鼠心肌細(xì)胞體積更小，細(xì)胞間距更窄，且細(xì)胞間隙藍(lán)染的膠原纖維更少。見圖3。

2.4 各組大鼠心肌組織ANP、ACE2、Ang（1-7）和AngⅡ表達(dá)水平比較

與空白組比較，模型組大鼠心肌組織中ACE2、Ang（1-7）的表達(dá)水平及Ang（1-7）/AngⅡ的比值顯著降低（P < 0.01），ANP和AngⅡ的表達(dá)水平顯著升高（P < 0.01）。而與模型組比較，針刺組大鼠心肌組織中ACE2、Ang（1-7）的表達(dá)水平及Ang（1-7）/AngⅡ的比值顯著升高（P < 0.01），ANP和AngⅡ的表達(dá)水平顯著降低（P < 0.01）。見圖4。

3 討論

長期的高血壓會(huì)導(dǎo)致心肌肥厚，進(jìn)入失代償期則會(huì)大大提高心力衰竭的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)[7]。因此控制血壓和逆轉(zhuǎn)左室肥厚，對(duì)預(yù)防嚴(yán)重心血管系統(tǒng)疾病具有重要意義。根據(jù)中醫(yī)理論，高血壓多因?yàn)楦侮柹峡憾餥8]，發(fā)病日久則導(dǎo)致陰陽失調(diào)，氣血逆亂，瘀濁阻心而引起心肌肥厚[9]。本研究選用太沖穴為肝經(jīng)原穴、百會(huì)為諸陽之會(huì)。兩穴合用有平肝降氣、調(diào)和陰陽、祛瘀化濁之效。諸多研究顯示，針刺太沖、百會(huì)均可明顯降低血壓，抑制心肌肥厚的發(fā)展[10-11]。本研究結(jié)果與以上研究一致：模型組大鼠SBP和LVWI、HWI等指標(biāo)均明顯高于空白組，形態(tài)學(xué)觀察也表現(xiàn)出明顯的心肌肥厚趨勢(shì)。而針刺組經(jīng)過28 d治療后，以上指標(biāo)有顯著改善，提示針刺可有效降低SHR的血壓，遏制其心肌肥厚的發(fā)展。

病理性心肌肥厚常伴有間質(zhì)纖維化和血管周圍纖維化，并伴有細(xì)胞凋亡和ANP的釋放，故ANP常被作為心肌細(xì)胞肥厚的反應(yīng)指標(biāo)[12]。研究表明自發(fā)性高血壓大鼠的心臟中ANP的表達(dá)水平比正常大鼠高50%～70%，并且隨著其年齡的增長和血壓的升高，其心臟中ANP表達(dá)水平也隨之升高[13]。研究表明Ang、抗利尿激素和腎上腺皮質(zhì)激素等均可以促進(jìn)ANP釋放[14]。RAS系統(tǒng)存在兩條相互拮抗的軸線，即ACE/AngⅡ和ACE2/Ang（1-7）。正常狀態(tài)下兩者相輔相成，制約平衡，共同維持心血管系統(tǒng)的穩(wěn)定[15]。研究表明，ACE2可有效抑制病理性肥厚、心肌纖維化和心功能不全[16-17]。ACE2可將AngⅡ轉(zhuǎn)化為Ang（1-7），從而降低AngⅡ濃度，增大Ang（1-7）/AngⅡ比值[18]。Ang（1-7）的作用與AngⅡ相反，可擴(kuò)張血管，降低動(dòng)脈壓，還可抑制AngⅡ介導(dǎo)的心肌重構(gòu)作用[19-20]。

本研究結(jié)果亦顯示針刺“百會(huì)”“太沖”，在降低血壓和抑制心肌肥厚發(fā)展的同時(shí)，可顯著提高SHR大鼠心肌組織中ACE2和Ang（1-7）的表達(dá)水平，降低AngⅡ和ANP的表達(dá)水平。提示針刺可通過激活A(yù)CE2/Ang（1-7）軸，降低血壓，抑制心肌肥厚的發(fā)展。高血壓和心肌肥厚的形成是一個(gè)受多因素影響的復(fù)雜過程，本研究著重關(guān)注了針刺通過調(diào)節(jié)RAS系統(tǒng)對(duì)高血壓心肌肥厚起到的作用，尚有一定的局限性。接下來的研究中將對(duì)針刺調(diào)節(jié)血壓和逆轉(zhuǎn)心肌肥厚的其他可能途徑及其內(nèi)在機(jī)制做更全面的探索。

[參考文獻(xiàn)]

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[2]? Draper TS，Silver JS，Gaasch WH. Adverse Structural Remodeling of the Left Ventricle and Ventricular Arrhythmias in Patients With Depressed Ejection Fraction [J]. J Card Fail，2015，21（2）：97-102.