青錢柳內生真菌多樣性及其代謝產物的特性

寇曉琳, 謝 楠, 吳彩娥,, 范龔健,, 洑香香

(1.南京林業(yè)大學輕工與食品學院，江蘇 南京 210037；2.南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

青錢柳(Cyclocaryapaliurus)又名青錢李、搖錢樹等，系胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬(Cyclocarya)植物，是我國特有的單種屬植物，也是國家重點保護的瀕危植物之一，屬三類保護植物.《中國中藥資源志要》[1]記載，其樹皮、葉均具有清熱消腫、止痛的功能，可用于治療頑癬[2].長期以來，江西、湖南等地的人們取其葉制作飲料，因其味甜，有清熱解暑、降血壓、降血糖等功能，又稱甜茶、神茶[3].2013年10月30日國家衛(wèi)計委正式批準青錢柳葉為新食品原料，并規(guī)定其使用方式為“沖泡”.近年來，國內外學者對青錢柳的種植、活性物質提取以及膠囊沖劑等保健品開發(fā)進行了廣泛研究[4-5].

植物內生菌是指生活在植物組織內而不引起任何直接、明顯植物病變的一大類微生物，包括寄生或共生在植物體內的真菌和細菌，以及植物侵襲性腐生菌或植物機會致病菌[6].100多年前，Bacon et al[7]就從黑麥草種子中分離出第一株內生真菌，但直到1993年Stierle et al[8]從短葉紅豆杉韌皮部分離到一株能產抗癌活性物質紫杉醇的內生真菌才真正引起人們對植物內生真菌的功能性質的注意.近年來，植物內生菌特別是藥用植物內生菌，作為一種新的微生物資源引起了廣泛關注，人們從其代謝產物中分離出多種生物活性物質，包括具有抗菌、抗腫瘤、殺蟲、免疫抑制、抗氧化等特點的天然化合物，其中不少是新物質，具有特殊生物活性[9-12].黃酮類化合物是一類天然多酚化合物，具有抗氧化、清除自由基的功效，目前已證實其對動脈粥樣硬化、骨質疏松癥、糖尿病和某些癌癥有一定的治療效果[13].研究表明，植物內生菌能夠產生與宿主相同或相似成分的活性物質[14].張海龍等[15]、張婷等[16]及趙曉璐等[17]都從植物中分離出多株產黃酮類物質的內生真菌.野生青錢柳的直接利用由于其屬于國家珍稀瀕危植物受到很大限制，不能滿足開發(fā)和應用的需求，獲得其活性物質的途徑有待進一步的創(chuàng)新和拓寬，青錢柳活性內生菌的開發(fā)研究意義重大.

本研究以江蘇鎮(zhèn)江的青錢柳為材料，采用組織分離的方法從植物的枝、葉、根、皮部位大量分離內生真菌，研究青錢柳內生真菌的多樣性及分布部位.通過抑菌活性跟蹤，篩選具有抑菌作用和產黃酮的青錢柳內生真菌，研究青錢柳內生真菌發(fā)酵產物對供試菌株的抑菌活性以及產黃酮的能力，旨在為青錢柳功能性內生真菌進一步的研究提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試植物、菌株與黃酮提取物 青錢柳植株枝、皮、葉、根均采自江蘇鎮(zhèn)江.大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccocusaureus)，由南京財經(jīng)大學食品實驗室提供；白色念珠菌(Moniliaalbican)由南京師范大學食品實驗室提供；青錢柳黃酮提取物由南京林業(yè)大學食品實驗室提供；異槲皮苷標品(純度≥98%)、山奈酚標品(純度≥98%)、槲皮素標品(純度≥90%)從SIGMA公司購入.

1.1.2 培養(yǎng)基 青錢柳內生真菌分離培養(yǎng)基：馬丁氏培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基).青錢柳內生真菌發(fā)酵培養(yǎng)基：馬鈴薯肉湯培養(yǎng)基(PDB培養(yǎng)基).供試細菌培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基.供試真菌培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基[18].

1.2 試驗方法

1.2.1 內生真菌的分離 用自來水將無病害青錢柳的枝、皮、葉、根沖洗1 h，晾干后，將葉摘下，皮剝下，枝剪成5 cm長小段.在超凈工作臺上，按無菌操作方法進行以下工作：先用5%的NaClO溶液浸泡材料5 min，再用75%的乙醇溶液浸泡30 s，用無菌水漂洗4次，無菌紗布蘸干水分，剪去枝條和根部兩頭褐變部分，將其剪成0.5 cm小段，去除木質部，保留韌皮部.將韌皮部、葉片和樹皮剪成0.5 cm×0.5 cm小片.把處理過的各部分組織分別植入PDA培養(yǎng)基、馬丁氏培養(yǎng)基、察氏培養(yǎng)基平板中，每皿植入4～5片，置于28 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)，所有樣品在4 h內完成內生真菌的分離工作，每種處理設3組重復.24 h觀察一次，待枝、葉、根、皮切面處長出菌絲后，挑取其尖端部分移至新的PDA培養(yǎng)基平板上，28 ℃培養(yǎng)，經(jīng)反復幾次純化后，即得到青錢柳內生真菌純培養(yǎng)物.對照試驗：將表面消毒后的枝、皮、葉、根不作切割，置相同條件下培養(yǎng)，結果無任何微生物長出，證明表面消毒徹底，分離到的真菌是青錢柳的內生真菌.分離純化后，于4 ℃保存?zhèn)溆肹19-21].

1.2.2 內生真菌的形態(tài)學觀察 觀察28 ℃下培養(yǎng)4～7 d的內生真菌菌落形態(tài)特征.挑取純化的尖端菌絲，用乳酸石炭酸棉藍染色液染色，進行常規(guī)鏡檢.參照《真菌鑒定手冊》[22]及相關文獻[23-25]對分離的內生真菌進行顯微形態(tài)特征的觀察和初步分類.

1.2.3 內生真菌胞內產物的提取 將內生真菌轉接到裝有100 mL PDA液的250 mL三角瓶中，放在恒溫搖床上，在28 ℃、150 r·min-1的條件下培養(yǎng)7～10 d，同時留取空白培養(yǎng)基作對照.將菌體進行細胞破碎，離心后量體積，將其濃縮30倍后用0.22 μm的濾膜過濾，得到胞內產物濃縮液；空白培養(yǎng)基離心后，做相同處理，作為對照發(fā)酵濃縮液，備用[26].

1.2.4 內生真菌發(fā)酵液制備 使用接種針挑取枝、皮、葉、根內生菌培養(yǎng)基中面積為0.5 cm×0.5 cm平板培養(yǎng)物接到發(fā)酵瓶中，置于28 ℃、140 r·min-1的恒溫搖床上繼續(xù)培養(yǎng)7 d.發(fā)酵結束后，用超聲波細胞破碎儀對發(fā)酵瓶中菌體進行破碎，每瓶破碎30 min，使用甲醇靜置浸泡24 h.浸提后的溶液在4 000 r·min-1下，離心15 min后收集浸提液，于60 ℃水浴旋轉蒸發(fā)濃縮樣品得棕色粘稠物，加入70%的甲醇充分混勻，定容至5 mL后備用.

1.2.5 抑菌試驗 以常見的2種細菌(大腸桿菌、金黃色葡萄球)和1種真菌(白色念珠菌)為檢測菌，采用濾紙片法檢測濃縮液的抑菌活性[27].方法為：分別取1.2.3中的胞內產物濃縮液5 mL于無菌具塞試管內，取直徑為10 mm的濾紙片若干放入試管中，使其充分吸收；然后在無菌操作臺上，用鑷子夾取略微風干后的濾紙片平放于含有測試菌的培養(yǎng)皿中，測試各內生真菌的發(fā)酵液和其菌絲提取液(從內生真菌培養(yǎng)基中挑取不同部位內生真菌與5 mL無菌水混合)對3種測試菌的抑菌效果；同時，分別取5 mL上述對照發(fā)酵濃縮液和無菌水于試管中，浸泡濾紙后，作為對照.將制好后的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌培養(yǎng)皿在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，將制好的白色念珠菌的培養(yǎng)基置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，然后觀察，測其抑菌圈大小，并拍照記錄.

抑菌活性表示方法：濾紙片直徑10 mm,“-”表示無抑菌圈，“+”表示抑菌圈直徑<5 mm,“++”表示5 mm≤抑菌圈直徑<10 mm，“+++”表示抑菌圈直徑≥10 mm.抑菌活性以抑菌圈直徑的大小進行衡量,其中，抑菌圈直徑等于抑菌外徑與濾紙片直徑之差[28].

1.2.6 顯色反應 硼酸顯色反應：取1.2.4制備的發(fā)酵液5 mL置于試管中，加入2%的硼酸溶液數(shù)滴，置于振蕩器上搖勻，靜置30 min觀察有無棕黃色出現(xiàn)，并拍照記錄.3% AlCl3顯色反應：取樣品1滴置于濾紙中央，并在濾紙表面噴灑3% AlCl3乙醇溶液，自然風干后，放在紫外燈下觀察有無黃綠色熒光，并拍照記錄.4% NaOH顯色反應：取青錢柳內生真菌發(fā)酵液2 mL置于試管中，加入4% NaOH溶液數(shù)滴，置于振蕩器上搖勻，靜置30 min觀察有無黃色出現(xiàn)，并拍照記錄[29].

1.2.7 薄層層析 對青錢柳內生真菌所產黃酮進行薄層層析，采用硅膠G薄板，選用20種展開劑，3% AlCl3乙醇溶液(顯色劑)，其組分比例見表1[30-33].

表1 薄層層析的展開劑組分及比例Table 1 Composition and ratio of developers for thin layer chromatography

2 結果與分析

2.1 內生真菌的形態(tài)學特征及初步分類

本試驗共從青錢柳中共分離獲得內生真菌共67株.經(jīng)肉眼觀察菌落表面形態(tài)，并結合光學顯微鏡觀察其微觀特征，初步判定分離得到的內生真菌分別屬于3綱4目6科10屬，其特征及分類見表2，10個代表性菌株的形態(tài)特征見圖1.

2.2 青錢柳內生真菌的分布

2.2.1 不同組織中內生真菌的分離結果 如表3所示，從青錢柳的枝、皮、葉、根4個部位中分離獲得的67株內生真菌中，根部分布的內生真菌從數(shù)量和種屬上都占優(yōu)勢，其內生真菌共9屬27株，占分離菌株總數(shù)的40.3%，以木霉屬為優(yōu)勢菌群，占根部菌株數(shù)的25.9% ；枝部內生真菌共7屬14株，占分離菌株總數(shù)的20.9%，以鐮刀菌屬為優(yōu)勢菌群，占枝部菌株數(shù)的35.7%；皮部內生真菌共8屬19株，占分離菌株總數(shù)的28.4%，以鏈格孢屬為優(yōu)勢菌群，占皮部總菌株數(shù)的26.3%；葉部內生真菌共6屬7株，占分離總菌株數(shù)的10.4%.

表2 青錢柳內生真菌的形態(tài)特征Table 2 Morphological characteristics of endophytic fungi

A:木霉屬×400;B:青霉屬×1000;C:地霉屬×400;D:鏈格孢屬×1000;E:鐮刀菌屬×1000;F:刺盤孢屬×400;G:絲核菌屬×400;H:擬青霉孢屬×1000;I:根霉屬×100;J:棒束梗霉屬×1000.圖1 青錢柳內生真菌的個體形態(tài)Fig.1 Individual form of endophytic fungi isolated from Cyclocaryapaliurus

表3 青錢柳不同組織內生真菌的分布Table 3 Distribution of endophytic fungi in different organs of Cyclocaryapaliurus

表4 不同培養(yǎng)基中內生真菌的分布Table 4 Distribution of endophytic fungi in different culture mediums

2.2.2 不同培養(yǎng)基內生真菌的分離結果 如表4所示，馬丁氏培養(yǎng)基共分離得到31株，分離頻率為46.3%，其優(yōu)勢菌群為鏈格孢屬；察氏培養(yǎng)基共分離得到15株，分離頻率為22.4%，鐮刀菌屬為優(yōu)勢菌群；PDA培養(yǎng)基中共分離得到21株，分離頻率為31.3%，木霉屬為優(yōu)勢菌群.馬丁氏培養(yǎng)基分離得到的菌株雖然較多，但是真菌的種類只有6種；察氏培養(yǎng)基分離得到的菌株數(shù)少，但菌屬種類較多，達到9種，且棒束梗霉屬、絲核菌屬只在察氏培養(yǎng)基中有發(fā)現(xiàn).

2.3 抑菌試驗結果

從67株內生真菌次生代謝產物的抑菌活性測試結果(表5)可以看出，其發(fā)酵產物對至少1種指示菌有抑制作用的菌共有13株，占總分離菌株的19.4%；對3種指示菌均有抑制作用的菌株有7株，占總分離菌株的10.4%.青錢柳內生真菌對金黃色葡萄球菌有抑菌作用的菌株最多，有10株，占總分離菌株的14.9%，抑制白色念珠菌的菌株最少，為8株，占總分離菌株的11.9%.抑菌效果顯著的是編號為PP03、PP08、PP11、PP19、PZ11、PG07、PG11的7株青錢柳內生真菌.這些內生真菌抑菌譜廣，而抑菌效果最顯著的是編號為PP08和PG11的兩株青錢柳內生真菌.其中PP08屬于青霉屬，PG11屬于鏈格孢屬.其發(fā)酵產物對指示菌的抑菌圈直徑均大于5 mm，其中PP08胞內發(fā)酵產物對金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑達到14.5 mm，PG11胞內發(fā)酵產物對于白色念珠菌的抑菌直徑達到13.2 mm(圖2)，表明其具有顯著的抑菌性.

表5 內生真菌發(fā)酵產物對供試菌的抑菌作用1)Table 5 Antibacterial activities of the secondary metabolites from endophytic fungi

1)-:沒有抑菌圈;+:抑菌圈直徑<5 mm;++:5 mm≤抑菌圈直徑<10 mm;+++:抑菌圈直徑≥10 mm.

A:金黃色葡萄球菌; B:白色念珠菌.圖2 內生真菌PP08和PG11胞內發(fā)酵產物對金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的抑菌效果Fig.2 Inhibition effects of endophytes PP08 and PG11 on Staphylococcus aureus and candida albicans

2.4 顯色試驗結果

青錢柳內生真菌部分菌株培養(yǎng)液經(jīng)細胞破碎，離心并濃縮上清液，得到供試發(fā)酵液，進行顯色反應.由表6可以推論，顯色反應中，下述7株菌株(PP03、PY01、PG11、PZ06、PY12、PP12、PP06)具有產生黃酮類化合物的能力.

表6 青錢柳內生真菌發(fā)酵液顯色反應Table 6 Color reaction of the fermented liquids

2.5 薄層層析試驗結果

對青錢柳內生真菌濃縮液以不同的層析條件進行多次薄層層析，結果發(fā)現(xiàn)8號層析液(甲苯∶甲酸甲酯∶甲酸=5∶4∶1)和18號層析液(正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶2)可將黃酮對照品分為幾個遷移率明顯不同的斑點，其余10多種展開劑層析時均出現(xiàn)嚴重拖尾現(xiàn)象，而在上述2種展開劑中18號層析液層析效果最穩(wěn)定，故認為正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶1∶2最適合青錢柳內生真菌黃酮的TLC分離.

選用上述展開劑對青錢柳內生真菌培養(yǎng)液的濃縮液進行展開，發(fā)現(xiàn)該層析條件下培養(yǎng)液能夠得到很好的分離.用3% AlC13乙醇溶液噴霧顯色后，用GDS-760圖象及分析系統(tǒng)(UVP)經(jīng)紫外檢測成像，結果如圖3所示.

樣品PP06(S1)和樣品PP03(S2)都只產生了一個層析斑點，其遷移率與異槲皮苷標準品(M1)的相同，推測為同種成分；樣品PY12(S3)產生2個斑點，斑點1對應異槲皮苷標準品(M1)，斑點2對應山奈酚標準品(M3)，由于槲皮素(M2)和山奈酚標準品的遷移率極為相近，也對應青錢柳黃酮提取物中的相同的斑點，可確定該種活性物質為青錢柳黃酮中的一種，但其具體種類僅通過遷移率并不能完全確定，有待于高效液相色譜的進一步檢測；樣品PZ06((S4)的薄層層析出現(xiàn)4個顯色斑點，但斑點1不太明顯，可能是由于其含量過低，導致顯色反應不明顯，其它3個斑點中，斑點3和斑點4分別對應異槲皮苷標準品和槲皮素標準品，而斑點2和青錢柳黃酮的提取物有相對應的點，推測其為青錢柳黃酮中的一種，但和上述3種標準品不同.

薄層層析試驗結果表明青錢柳生真菌產生的黃酮類物質中有與青錢柳黃酮相同或相似的成分，且進行3次重復試驗，均能出現(xiàn)同樣的結果，這表明青錢柳內生真菌產黃酮的能力具有很好的穩(wěn)定性.

M：青錢柳葉黃酮提取物；M1：異槲皮苷；M2：槲皮素；M3：山奈酚；S1：PP06；S2：PP03；S3：PY12；S4：PZ06.圖3 青錢柳內生真菌發(fā)酵液的薄層層析圖譜Fig.3 Thin layer chromatograph of the organic extractants from the endophytic fungi of Cyclocaryapaliurus

3 討論

本試驗從青錢柳不同組織共分離得到67株內生真菌，其種群差異明顯，各組織中的優(yōu)勢種群各不相同，通過菌落形態(tài)和顯微形態(tài)對分離得到的青錢柳內生真菌進行分類鑒定，分別隸屬于3綱4目6科10屬，青錢柳中的枝、皮、葉、根不同部位分離出的內生真菌的種類和數(shù)量不盡相同.植物內生真菌的分布不僅受宿主植物影響，還受外界環(huán)境的影響.即使同一種植物，不同組織中內生真菌的數(shù)量和種類也不盡相同，存在復雜的多樣性[34-35].Rosenblueth et al[36]認為內生真菌在植物體內的分布通常下部組織多于上部組織，越往植株頂部，內生真菌越少.目前對植物可培養(yǎng)內生真菌的分離結果表明，內生真菌在林木組織中以根部最多，枝次之，葉部較少，而在一年生和多年生的經(jīng)濟作物中，根部最多，葉枝中數(shù)量相近[37].本研究表明青錢柳根部的內生真菌密度大、數(shù)量多，皮次之，枝和葉中內生真菌的數(shù)量最少，與已有的研究結果基本一致[37].青錢柳不同組織共有的種群相對較多，表明內生真菌在植物的不同部位、不同組織中分布廣泛；而其各自的特有種群在種類上也較為豐富，顯示出內生真菌在植物中的分布有一定的組織專一性.同種植物不同部位內生真菌分布差異的原因，可能是不同部位的微環(huán)境如通氣狀況、酶和其它化學成分不同適合不同的內生真菌類群侵入、生長.并且，本試驗的青錢柳從江蘇省鎮(zhèn)江取樣，不同地區(qū)的青錢柳植物體內的活性物質及內生真菌有一定的相似性，但是也有地域差異[38].目前普遍認為土壤是內生真菌的主要來源，因而地下部位內生真菌的數(shù)量多于地上部位.

從不同培養(yǎng)基分離的菌株可以看出，馬丁氏培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株種類少、數(shù)量多，而察氏培養(yǎng)基和PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株種類較多、菌株較少，體現(xiàn)出不同培養(yǎng)基的特性不同.可以推斷，植物內生真菌的數(shù)量與種類與植物自身狀況及所處的環(huán)境密切相關.但是影響內生真菌分離結果的因素較多，首先很難將植物體內的內生真菌全部分離出來，這主要是因為人工培養(yǎng)基不可能完全模擬植物體內環(huán)境.其次，即使用不同的培養(yǎng)基來分離植物組織的內生真菌，也不能保證所有生活在植物體內的內生真菌全部被分離出來，因為有的內生真菌不能在人工培養(yǎng)基上培養(yǎng)[39].

青錢柳內生真菌的抑菌試驗結果共得到13株具有抑菌作用的內生真菌，其中有2株內生真菌的發(fā)酵產物對供試菌株均表現(xiàn)出較強的抑菌活性，分別屬于青霉屬和鏈格孢屬.結果表明，不同菌株的抑菌活性存在很大差別.研究表明，內生真菌在與植物協(xié)同進化過程中，不但自身能夠產生特殊的化學物質，還能誘導宿主植物次生代謝產物的合成和積累，作為藥食兩用經(jīng)濟植物，青錢柳所具有的藥用價值是否與其體內的內生真菌有關，這些內生真菌是通過何種途徑作用于宿主植物的，其代謝產物化學成分的明確以及功能性內生真菌的產物等問題，有待于進一步研究[40].

本研究在青錢柳內生真菌中篩選出7株菌株(PP03、PY01、PG11、PZ06、PY12、PP12、PP06)具有穩(wěn)定的產生黃酮類化合物的能力.目前，已報道的可產黃酮類物質的內生真菌有刺盤孢屬[41]、青霉屬[42]、曲霉屬和莖點霉屬[43]等，但就產黃酮的7株菌株的進一步鑒定的工作正在開展中以期后續(xù)發(fā)表.同時，由于槲皮素和山奈酚的遷移率相似，因此還需采用高效液相色譜進一步確定其成分.青錢柳黃酮類物質主要從青錢柳葉中提取，對珍貴的青錢柳資源消耗較大.如果能利用內生真菌，實現(xiàn)青錢柳黃酮的微生物體外發(fā)酵，則可使青錢柳黃酮的工業(yè)化生產不受植物資源的限制，并可防止資源的日益短缺.