石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病的病原分離和鑒定

林 楠, 吳 斌, 李苗苗, 王巧煌, 林國清, 樊海平, 林克冰

(1.福建省水產(chǎn)技術(shù)推廣總站，福建 福州 350002；2.福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建 福州 350002；3.福建省水產(chǎn)研究所，福建 廈門 361000)

本試驗(yàn)采用SSN-1細(xì)胞株及其克隆細(xì)胞株E-11對(duì)從福建省漳州市采集到的疑似病毒性神經(jīng)壞死病的石斑魚苗進(jìn)行病原分離和鑒定，并對(duì)分離的病毒株進(jìn)行了溫度、酸堿度敏感性試驗(yàn)，旨在為病毒性神經(jīng)壞死病的防控及相關(guān)研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 SSN-1細(xì)胞由深圳海關(guān)動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心提供；E-11細(xì)胞由福建省水產(chǎn)研究所提供.

1.1.2 試劑 RNA樣品保存液、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR預(yù)混試劑盒購自TaKaRa公司；L-15培養(yǎng)液、胎牛血清購自HyClone公司；戊二醛電鏡固定液購自武漢賽維爾公司；磷鎢酸負(fù)染色液(3%)購自上海晶都生物公司.

1.1.3 儀器與設(shè)備 主要儀器與設(shè)備有GBOX-F3凝膠成像儀(英國Syngene公司)、HT7700透射電鏡(日本日立公司)、UC7超薄切片機(jī)(德國徠卡公司).

1.2 病魚材料的提取

從福建省漳州市某水產(chǎn)養(yǎng)殖場收集疑似患病毒性神經(jīng)壞死病的珍珠龍膽石斑魚苗(體長2～5 cm)100尾，提取眼部、腦部組織各2份：一份低溫保存在RNA樣品保存液中，待研磨后用于RT-PCR的檢測(cè)；一份置-20 ℃下保存，待研磨后用于病毒分離.

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

SSN-1、E-11細(xì)胞分別在含20% 胎牛血清的L-15培養(yǎng)液(27 ℃)中培養(yǎng)，細(xì)胞經(jīng)胰蛋白酶消化傳代，培養(yǎng)至匯合度達(dá)90%以上時(shí)使用.

1.4 病毒分離

1.4.1 病魚材料的處理 在病魚材料中加入適量1×PBS，充分研磨后于5 000 r·min-1離心10 min，取上清，按1∶10的比例加入含雙抗(1 000 IU·mL-1青霉素、1 000 μg·mL-1鏈霉素)的L-15培養(yǎng)液，于4 ℃下過夜，經(jīng)0.45 μm濾器過濾后，用含胎牛血清的L-15培養(yǎng)液作10、102、103、104倍稀釋.準(zhǔn)備培養(yǎng)至匯合度達(dá)90%的SSN-1、E-11細(xì)胞，吸出培養(yǎng)液.將以上各稀釋度的病毒液、空白對(duì)照液(僅培養(yǎng)液)分別加入到細(xì)胞孔中，于培養(yǎng)箱(27 ℃)中吸附2 h，補(bǔ)加含胎牛血清的L-15培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱(27 ℃)中培養(yǎng)，逐日觀察、記錄細(xì)胞的變化.

在家附近的巷口，弟弟碰見了爸爸。于是他一邊蹺起扎了繃帶的腳給爸爸看，一邊哭喪著臉訴苦，滿以為會(huì)收獲一點(diǎn)同情與憐愛，不料爸爸并沒有安慰他，只是簡單交代幾句，便自己離開了。

1.4.2 細(xì)胞懸液的收集 待細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)，凍融一次，收集細(xì)胞懸液，于2 000 r·min-1離心3 min，取上清繼續(xù)接種細(xì)胞并觀察細(xì)胞的病變情況.

1.5 RT-PCR鑒定

1.5.1 引物合成 石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病病原檢測(cè)引物參考GB/T 27531—2011[10]的方法合成，擴(kuò)增的目標(biāo)基因?yàn)椋撼帱c(diǎn)石斑魚VNNVRNA-2片段完整序列.引物序列為：F—5′-CGT GTC AGT CAT GTG TCG CT-3′；R：—5′-CGA GTC AAC ACG GGT GAA GA-3′，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成.

1.5.2 病毒核酸的提取 病魚材料用適量的1×PBS洗去殘留的RNA樣品保存液，充分研磨后，于5 000 r·min-1離心10 min，取上清備用.待檢病魚材料上清和上述細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品的病毒RNA參照Viral RNA/DNA Extraction Kit試劑盒說明書的步驟提取.

1.5.3 RT-PCR鑒定 RNA反轉(zhuǎn)錄參照PrimeScriptTMⅡ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書的方法進(jìn)行.在PCR管中分別加入2 μL 10 mmol·L-1引物、4 μL模板、25 μL Premix Taq預(yù)混試劑、17 μL DEPC水，混勻后稍離心.PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性1 min，58 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；最后于72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫.

1.5.4 產(chǎn)物檢測(cè) 用TAE緩沖液配制含GelRed染料的1.0%瓊脂糖凝膠，PCR產(chǎn)物于100 V恒壓凝膠電泳，然后置凝膠成像儀下觀察、拍照.產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序.

1.5.5 序列比對(duì)及系統(tǒng)樹的構(gòu)建 從NCBI公共數(shù)據(jù)庫上查找病毒性神經(jīng)壞死病4種基因型及諾達(dá)病毒科其他種屬相關(guān)基因的序列(表1).采用BLAST比對(duì)樣品測(cè)得序列和已知病毒株序列，使用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

表1 用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的病毒株及其NCBI登錄號(hào)Table 1 Virus and accession numbers of gene sequences for molecular phylogenetic analysis

1.6 電鏡觀察

1.6.1 病毒顆粒負(fù)染觀察 將感染病毒后的細(xì)胞培養(yǎng)上清于12 000 r·min-1離心40 min，取上清置3 ku超濾離心管中，于7 000 r·min-1離心40 min，棄去濾下液，加入等體積的ddH2O稀釋濃縮液，于7 000 r·min-1離心40 min，收集濃縮液.

將上述收集液滴在銅網(wǎng)上3 min蘸取樣品，用濾紙吸干多余液體，再將2%磷鎢酸染色液滴在銅網(wǎng)上染色3 min，用濾紙吸干多余液體，電鏡觀察.

1.6.2 細(xì)胞超薄切片的觀察 吹打使感染病毒3 d的E-11細(xì)胞脫落，吸出培養(yǎng)液加入電鏡固定液于4 ℃固定2 h，于300 r·min-1低速離心細(xì)胞至管底，用1%瓊脂糖包裹，洗滌.用1%鋨酸室溫固定2 h后洗滌.用乙醇和丙酮脫水，包埋，超薄切片機(jī)切片成60～80 nm的厚度，鈾鉛雙染色，切片置室溫下干燥過夜，電鏡觀察.

1.7 病毒特性分析

1.7.1 病毒滴度的測(cè)定 取鋪滿單層E-11細(xì)胞的96孔板，棄去培養(yǎng)液，將病毒上清連續(xù)10倍稀釋至10-10，各稀釋度8個(gè)復(fù)孔，接種至96孔板中，每孔100 μL，設(shè)立空白對(duì)照，于27 ℃吸附2 h，補(bǔ)加L-15培養(yǎng)液至每孔200 μL，于27 ℃下培養(yǎng)，每日觀察細(xì)胞變化并記錄細(xì)胞病變的情況，7 d后采用Reed-Muench法[11]計(jì)算病毒的半數(shù)組織細(xì)胞感染量(TCID50).

1.7.2 溫度敏感性試驗(yàn) 取適量病毒上清，分別置30、40、50、60 ℃下處理30 min，設(shè)立空白對(duì)照，按照上述病毒滴度測(cè)定方法計(jì)算其TCID50.

1.7.3 酸堿度敏感性試驗(yàn) 配制0.1 mol·L-1HCl、0.1 mol·L-1NaOH，取適量病毒上清，分為2份，分別用HCl、NaOH調(diào)整pH至3、11，置27 ℃下處理30 min，設(shè)立空白對(duì)照，按照上述病毒滴度測(cè)定方法計(jì)算其TCID50.

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病魚的臨床癥狀

發(fā)病石斑魚攝食量下降，浮于水面或趴底側(cè)躺，體色發(fā)黑，有的呈螺旋狀打轉(zhuǎn)，有的出現(xiàn)發(fā)癲癥狀，部分魚死亡時(shí)嘴大張，表現(xiàn)出不同程度的神經(jīng)異常.

2.2 病毒的細(xì)胞分離

在27 ℃培養(yǎng)條件下，SSN-1、E-11細(xì)胞接種病料懸液后第3天開始出現(xiàn)細(xì)胞病變，第4天兩株細(xì)胞的病變形態(tài)如圖1A、1C所示.圖1A、1C顯示，細(xì)胞腫脹渾圓，呈顆粒狀并出現(xiàn)空泡化，最后大批細(xì)胞溶解脫落.E-11細(xì)胞較SSN-1細(xì)胞更早出現(xiàn)病變，且病變更明顯.SSN-1、E-11細(xì)胞空白對(duì)照形態(tài)正常(圖1B、1D).

A：感染VNNV的SSN-1細(xì)胞；B：SSN-1細(xì)胞的空白對(duì)照；C：感染VNNV的E-11細(xì)胞；D：E-11細(xì)胞的空白對(duì)照.圖1 SSN-1、E-11細(xì)胞感染VNNV后出現(xiàn)的病變形態(tài)Fig.1 Cytopathic effect of SSN-1 cell and infected E-11 cells

2.3 病毒的RT-PCR鑒定

M：DL2000 DNA Marker；1：空白對(duì)照；2：病魚材料的研磨樣品；3：感染VNNV的SSN-1細(xì)胞上清樣品；4：感染VNNV的E-11細(xì)胞上清樣品.圖2 RT-PCR鑒定結(jié)果Fig.2 RT-PCR identification of the sample

病魚樣品RT-PCR檢測(cè)電泳結(jié)果(圖2)顯示，病料研磨樣品及SSN-1、E-11細(xì)胞培養(yǎng)上清樣品均出現(xiàn)特異性條帶，目的片段大小約427 bp.擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)序列比對(duì)分析顯示，3份樣品基因序列的相似性達(dá)100%.構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)顯示，本試驗(yàn)分離到的病毒株與赤點(diǎn)石斑魚神經(jīng)壞死病毒(redspotted grouper nervous necrosis virus, RGNNV)的親緣關(guān)系最近，鑒定該病毒為RGNNV.

2.4 病毒的電鏡觀察

病毒液濃縮后經(jīng)磷鎢酸負(fù)染色，干燥后置電鏡觀察，可見粒徑為25～35 nm、近二十面體的VNNV顆粒(圖4A).將感染VNNV 3 d的E-11細(xì)胞制成超薄切片后置電鏡下觀察，可見細(xì)胞質(zhì)內(nèi)大量病毒顆粒聚集成團(tuán)，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞器受損，細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)大量空泡，但細(xì)胞核結(jié)構(gòu)完整(圖4B、4C).

圖3 分離到的VNNV系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of VNNV

A：負(fù)染后的VNNV病毒顆粒(箭頭示病毒顆粒，25 000×)；B：病毒感染后的E-11細(xì)胞切片(箭頭示病毒顆粒，10 000×)；C：E-11細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)大量空泡(2 500×).圖4 VNNV的電鏡觀察結(jié)果Fig.4 Electron micrograph of VNNV

2.5 病毒滴度

接種VNNV的E-11細(xì)胞置27 ℃下培養(yǎng)，每日觀察并記錄細(xì)胞的變化，7 d后病毒的滴度達(dá)105.07TCID50·mL-1.

2.6 病毒的溫度敏感性

接種細(xì)胞前將VNNV病毒液分別置30、40、50、60 ℃處理30 min后，每毫升VNNV病毒液的TCID50分別為104.63、104.30、103.30、0，空白對(duì)照組為105.07.結(jié)果顯示，50 ℃下處理30 min后病毒滴度明顯下降，60 ℃處理30 min后病毒失活.

2.7 病毒的酸堿度敏感性

將VNNV病毒液的pH分別調(diào)節(jié)至3、11，置27 ℃處理30 min后，每毫升VNNV病毒液的TCID50分別為102.89、102.08，空白對(duì)照組為105.45.結(jié)果顯示，在pH為3、11的條件下，本試驗(yàn)分離的VNNV滴度均明顯下降.

3 討論

病毒性神經(jīng)壞死病是世界范圍內(nèi)海水魚類最常見、危害最嚴(yán)重的傳染病之一，除石斑魚外，牙鲆、鱸、東方鲀、軍曹魚等品種均有感染病毒性神經(jīng)壞死病的報(bào)道[12].1991年Mori et al[13]根據(jù)柯克原則確定病毒性神經(jīng)壞死病是由魚類VNNV引起的.根據(jù)病毒顆粒衣殼蛋白基因的不同序列，將VNNV分成4個(gè)基因型，即RGNNV、紅鰭東方鲀神經(jīng)壞死病毒、條斑星鰈神經(jīng)壞死病毒、黃帶擬鲹神經(jīng)壞死病毒(striped jack nervous necrosis virus, SJNNV)[14].不同基因型產(chǎn)生細(xì)胞病變所需的溫度、時(shí)間不一樣，且細(xì)胞病變形態(tài)也不同.福建閩南地區(qū)感染石斑魚的神經(jīng)壞死病毒主要為RGNNV基因型[15].本試驗(yàn)對(duì)福建省漳州市某水產(chǎn)養(yǎng)殖場發(fā)生的疑似石斑魚病毒性神經(jīng)壞死病進(jìn)行了病原分離和鑒定，結(jié)果顯示該病原為VNNV，基因型為RGNNV，下一步計(jì)劃對(duì)該株VNNV進(jìn)行全基因組測(cè)序，進(jìn)一步分析其病原學(xué)特征.

目前能用于VNNV培養(yǎng)的細(xì)胞主要有SSN-1[16]、E-11[9]、石斑魚鰭細(xì)胞系(GF-1)[17]、石斑魚腦細(xì)胞系(GB)[18]、石斑魚脾細(xì)胞系(GS)[19]等細(xì)胞.E-11細(xì)胞是Iwamoto et al[9]采用SSN-1細(xì)胞成功克隆出的對(duì)諾達(dá)病毒高度敏感，且能持續(xù)增殖的細(xì)胞株.RGNNV、SJNNV、紅鰭東方鲀神經(jīng)壞死病毒、條斑星鰈神經(jīng)壞死病毒4種基因型VNNV在E-11細(xì)胞上的最適生長溫度分別為25～30、20～25、20、15～20 ℃[9].與SSN-1細(xì)胞相比，E-11細(xì)胞生長更快、更穩(wěn)定，且細(xì)胞病變更明顯.本試驗(yàn)中，在27 ℃的培養(yǎng)條件下，E-11細(xì)胞較SSN-1細(xì)胞表現(xiàn)出對(duì)VNNV更高的敏感性及更明顯的病變，這也與上述相關(guān)的研究結(jié)果相符.

溫度、pH、輻射等理化因子能影響病毒核酸的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和翻譯等功能，或改變、破壞病毒顆粒的衣殼蛋白，影響病毒顆粒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附和侵入，從而使病毒失去感染性，研究病毒的理化性質(zhì)對(duì)于養(yǎng)殖生產(chǎn)中病原的預(yù)防控制具有重大的意義.Arimoto et al[20]研究表明，于20 ℃、pH 12的條件下處理10 min能夠使當(dāng)?shù)豐JNNV失去活性，因此將在pH為12的條件下處理10 min作為當(dāng)?shù)豐JNNV的滅活程序.臺(tái)灣地區(qū)的Chi et al[21]研究表明，石斑魚的VNNV在60 ℃下處理1 h后完全失活，在pH為3和10～12的條件下處理后滴度明顯下降.本試驗(yàn)結(jié)果顯示，本試驗(yàn)分離到的VNNV經(jīng)50 ℃及以上溫度處理30 min后，滴度明顯下降，至60 ℃病毒完全失活，推測(cè)該過程可能與病毒蛋白高溫變性有關(guān)；此外，酸堿度敏感性檢測(cè)結(jié)果顯示該株VNNV對(duì)強(qiáng)酸或強(qiáng)堿敏感.針對(duì)VNNV理化特性的研究雖然采用的處理?xiàng)l件各不相同，但從研究結(jié)果可以推測(cè)VNNV對(duì)于強(qiáng)酸(pH<3)、強(qiáng)堿(pH>12)、高溫(60 ℃以上)條件敏感.以上結(jié)果可為當(dāng)?shù)厥唪~養(yǎng)殖場的病毒性神經(jīng)壞死病預(yù)防控制提供參考.