牛至香酚對(duì)LPS所致的免疫應(yīng)激小鼠脾臟細(xì)胞因子及核轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)的影響

呂明其, 閔思明, 衣偉萌, 陳楊超, 甘思言, 喬 石, 黃一帆, 馬玉芳

[1.中西獸醫(yī)結(jié)合與動(dòng)物保健福建省高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.福建省獸醫(yī)中藥與動(dòng)物保健重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(福建農(nóng)林大學(xué))，福建 福州 350002]

牛至(Origanumvulgare)又名止痢草，為唇形科(Lamiaceas)牛至屬(Origanum)多年生草本植物或半灌木.牛至味辛、性涼、無(wú)毒，具有清熱解表、理氣化濕、利尿消腫之功效，曾收載于《中華人民共和國(guó)藥典》(1977年版)[1].牛至香酚是從牛至中提取的一種特殊芳香氣味的揮發(fā)性植物精油，主要成分包括百里香酚、香荊芹酚、γ-萜品烯、p-異丙甲苯等酚類化合物.研究表明，牛至香酚具有促生長(zhǎng)[2]、增強(qiáng)免疫力[3]、抗氧化[4]、抗腫瘤[5]等功效.

本課題組前期研究表明，牛至香酚能促進(jìn)斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能，提高機(jī)體免疫功能[6-7].脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)是革蘭氏陰性菌膜結(jié)構(gòu)物質(zhì)，通過(guò)靶細(xì)胞上的Toll樣受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用將單核、巨噬細(xì)胞漿內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子κB激活，使機(jī)體中的炎性介質(zhì)大量釋放造成機(jī)體損傷.研究表明，LPS是能引發(fā)免疫造成機(jī)體損傷的主要物質(zhì)，大鼠腹腔注射LPS能夠造成脾臟組織急性損傷或嚴(yán)重感染[8].牛至香酚對(duì)免疫應(yīng)激小鼠脾臟細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響鮮見(jiàn)報(bào)道.本試驗(yàn)擬研究牛至香酚對(duì)免疫應(yīng)激小鼠脾臟細(xì)胞因子(TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-1β)、NF-κB及核轉(zhuǎn)錄因子(T-bet、GATA-3)mRNA表達(dá)的影響，旨在從分子水平上探討牛至香酚對(duì)免疫應(yīng)激小鼠的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理，豐富牛至香酚免疫藥理學(xué)研究?jī)?nèi)容，為其進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供數(shù)據(jù)借鑒.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 80只健康雄性清潔級(jí)KM小鼠體重(22±2) g，購(gòu)自福建醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心.

1.1.2 試劑 牛至香酚(百里香酚、香芹酚的含量為67%)由福建中農(nóng)牧生物藥業(yè)有限公司惠贈(zèng)；注射用LPS購(gòu)自Sigma公司；RNA提取試劑盒、cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司.

1.1.3 儀器與設(shè)備 主要儀器與設(shè)備有獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠具(蘇州市蘇杭科技器材有限公司)、電子分析天平[梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司]、SW-CJ-1F型雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司)、ALLEGRA X-22R型冷凍離心機(jī)(美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司)、CFX96型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)伯樂(lè)公司)、SK-1快速混勻器(金壇市科析儀器有限公司).

1.2試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理

將80只小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分成5組(空白對(duì)照組、模型組及牛至香酚低、中、高劑量組)，每組16只.所有小鼠均自由飲水、采食.牛至香酚低、中、高劑量組分別按25、50、100 mg·kg-1的劑量灌胃牛至香酚，空白對(duì)照組、模型組則灌胃相同體積的橄欖油，每日1次，連續(xù)14 d.第15天時(shí)牛至香酚試驗(yàn)組、模型組均按8 mg·kg-1的劑量腹腔注射LPS，空白對(duì)照組注射等量的生理鹽水.

1.3 樣品采集與處理

小鼠腹腔注射LPS 6 h后，采用頸椎脫臼法處死.無(wú)菌取脾臟組織，裝入經(jīng)DEPC水處理后的Eppendorf管，置-80 ℃凍存.

1.4 小鼠脾臟細(xì)胞因子、核轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)水平的測(cè)定

采用qRT-PCR檢測(cè)小鼠脾臟細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α)、NF-κB及核轉(zhuǎn)錄因子(T-bet、GATA-3) mRNA的表達(dá)水平.

1.4.1 RNA的提取 將脾臟組織放入1.5 mL去酶管中，于冰上研磨，加入1 mL RNAiso Plus混勻，用離心管分裝兩管，室溫靜置5 min；每個(gè)離心管加入200 μL氯仿，振蕩至液體乳化呈乳白色，室溫靜置3 min，于4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min；上清液轉(zhuǎn)移至新的離心管中，并加入等體積的異丙醇，室溫靜置10 min；于4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，棄RNA沉淀，于4 ℃、7 500 r·min-1離心5 min，棄上清液.室溫下放置干燥，加入20 μL RNase-free水使RNA溶解，測(cè)定RNA的濃度和純度[9].

1.4.2 cDNA的合成 反轉(zhuǎn)錄體系為：2 μL 5×Prime ScriptTM緩沖液、0.5 μL Prime ScriptTMRT Enzyme MixⅠ、0.5 μL 50 μmol·L-1Oligo dT Primer、0.5 μL 10 μmol·L-1Random 6mers、1 μL總RNA、5.5 μL無(wú)DNA酶水.反轉(zhuǎn)錄程序：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃保存.

按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按照SYBR Premix EX TaqTM試劑盒說(shuō)明書(shū)的步驟測(cè)定細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)量.

表1 引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度Table 1 Primer sequences and product sizes

1.4.3 qRT-PCR檢測(cè) qRT-PCR反應(yīng)體系：0.25 μL正向引物、0.25 μL反向引物、6.25 μL SYBR Premix Ex TaqTM(2×)、1 μL cDNA、4.75 μL dH2O.擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性120 s；95 ℃變性5 s，退火至62 ℃，延伸30 s，38個(gè)循環(huán)；65 ℃延伸5 s.經(jīng)過(guò)相應(yīng)條件擴(kuò)增后，以β-actin為內(nèi)參基因，每個(gè)樣本進(jìn)行3次重復(fù).引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度[9-10]如表1所示，由上海生物工程有限公司合成.

1.5 數(shù)據(jù)處理

將每個(gè)DNA樣品分別進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果采用相對(duì)定量法，測(cè)得樣品的循環(huán)閾值(Ct)，采用2-△△Ct法計(jì)算并分析不同試驗(yàn)組相關(guān)引物的變化情況.△△Ct=[Ctm(待測(cè)樣品)-Ctn(待測(cè)樣品)]-[Ctm(對(duì)照樣品)-Ctn(對(duì)照樣品)]，式中，m表示目的基因，n表示內(nèi)參基因.本試驗(yàn)以β-actinRNA作為內(nèi)參基因，其余引物的RNA作為目的基因.試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，并以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用LSD法進(jìn)行多重比較，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著.

2 結(jié)果與分析

2.1 牛至香酚對(duì)LPS所致的免疫應(yīng)激小鼠脾臟細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響

牛至香酚對(duì)LPS所致的免疫應(yīng)激小鼠脾臟細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響見(jiàn)表2.由表2可知，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、NF-κBmRNA的表達(dá)量極顯著提高(P<0.01).與模型組相比，牛至香酚試驗(yàn)組致炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6 mRNA的表達(dá)量有所下降，且差異顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)；NF-κBmRNA的表達(dá)量降低，其中，牛至香酚高劑量組與模型組的差異顯著(P<0.05).與空白對(duì)照組相比，模型組IL-10 mRNA的表達(dá)量顯著提高(P<0.05)；與模型組相比，牛至香酚低、高劑量組IL-10 mRNA的表達(dá)量有所提高，中劑量組降低；牛至香酚試驗(yàn)組IL-10 mRNA表達(dá)量與空白對(duì)照組的差異極顯著(P<0.01).

表2 牛至香酚對(duì)小鼠脾臟細(xì)胞因子mRNA表達(dá)水平的影響1)Table 2 Effect of oregano phenol on cytokine mRNA expression in the spleen of the experimental mice

1)同列數(shù)據(jù)后附不同大寫字母者表示差異極顯著(P<0.01)，附不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).

2.2 牛至香酚對(duì)LPS所致的免疫應(yīng)激小鼠脾臟核轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)水平的影響

牛至香酚對(duì)LPS所致的免疫應(yīng)激小鼠脾臟核轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)水平的影響見(jiàn)表3.由表3可知：與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠T-betmRNA的表達(dá)量極顯著提高(P<0.01)，GATA-3 mRNA的表達(dá)量及T-bet/GATA-3比值極顯著降低(P<0.01)；與模型組相比，牛至香酚試驗(yàn)組T-betmRNA的表達(dá)量下降，但差異不顯著(P>0.05).牛至香酚中劑量組GATA-3 mRNA的表達(dá)量顯著高于模型組(P<0.05)，低、高劑量組的表達(dá)量雖高于模型組，但差異不顯著(P>0.05).與模型組相比，牛至香酚試驗(yàn)組的T-bet/GATA-3比值有所上升，但差異不顯著(P>0.05).

表3 牛至香酚對(duì)小鼠脾臟核轉(zhuǎn)錄因子mRNA表達(dá)水平的影響1)Table 3 Effect of oregano phenol on the mRNA expression of transcription factors in the spleen of the experiment mice

1)同列數(shù)據(jù)后附不同大寫字母者表示差異極顯著(P<0.01)，附不同小寫字母者表示差異顯著(P<0.05)，附相同字母者表示差異不顯著(P>0.05).

3 討論

LPS作為一種免疫刺激劑，能通過(guò)靶細(xì)胞上的Toll樣受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用將單核、巨噬細(xì)胞漿內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子κB激活，引起免疫應(yīng)答，從而啟動(dòng)TNF-α，IL-1、IL-6等炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)[11]，而抗炎因子IL-10在抑制巨噬細(xì)胞分泌致炎因子的同時(shí)還抑制Th1細(xì)胞產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，在機(jī)體免疫抑制中起重要作用[12].NF-κB是一類具有多項(xiàng)調(diào)節(jié)功能的核轉(zhuǎn)錄因子，TNF-α通過(guò)與其受體結(jié)合來(lái)激活NF-κB，而IL-6的產(chǎn)生需要NF-κB在骨髓細(xì)胞中被激活.當(dāng)組織中的IL-6含量增高時(shí)，NF-κB含量也會(huì)發(fā)生相應(yīng)變化[13].脾臟是機(jī)體最大的外周免疫器官，含有大量的淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞，是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心.LPS可以促進(jìn)相關(guān)炎性細(xì)胞因子分泌的增加誘發(fā)膿毒血癥導(dǎo)致免疫細(xì)胞凋亡[14].

本試驗(yàn)中，牛至香酚試驗(yàn)組脾臟致炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達(dá)量低于模型組，但I(xiàn)L-10 mRNA的表達(dá)量高于模型組，這與惠永崗等[15]的“葡萄糖—胰島素—鉀極化液(GIK)試驗(yàn)組IL-10水平高于LPS組，IL-1β、TNF-α水平低于LPS組”研究結(jié)果相似.本試驗(yàn)中，模型組NF-κBmRNA的表達(dá)量極顯著高于空白對(duì)照組，牛至香酚高劑量組較模型組顯著降低，此結(jié)果與韓琳等[16]的“黃芪多糖能通過(guò)抑制NF-κB緩解LPS造成的損傷”研究結(jié)果相似.表明牛至香酚能有效降低LPS引起的IL-1β、IL-6、TNF-α等致炎因子mRNA的表達(dá)量，提高IL-10抗炎因子mRNA的表達(dá)量，提示牛至香酚能有效減輕LPS引起的炎癥，幫助機(jī)體恢復(fù)健康.

Th1、Th2細(xì)胞的分化平衡是機(jī)體免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)的重要環(huán)節(jié)，與疾病發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的關(guān)系密切.T-bet、GATA-3是調(diào)節(jié)Th細(xì)胞特異性分化的核轉(zhuǎn)錄因子，分別調(diào)控Th細(xì)胞向Th1、Th2細(xì)胞轉(zhuǎn)化，影響細(xì)胞因子在體內(nèi)的轉(zhuǎn)換[17-18].Th1細(xì)胞分泌IFN-γ、TNF-α等細(xì)胞因子，主要參與細(xì)胞免疫應(yīng)答；Th2細(xì)胞主要分泌IL-6、IL-10等細(xì)胞因子，主要參與機(jī)體的體液免疫[19].正常情況下，Th1、Th2細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)處于相對(duì)平衡的狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體發(fā)生異常功能時(shí)，兩者之間的動(dòng)態(tài)平衡被打破[20].研究表明，系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者中GATA-3的表達(dá)量高于正常人，Th2細(xì)胞增多，引發(fā)Th1、Th2細(xì)胞分化失衡，造成自身免疫紊亂[21].研究表明：臺(tái)灣紫芝多糖能顯著提高Th1轉(zhuǎn)錄因子T-bet的表達(dá)，同時(shí)降低Th2轉(zhuǎn)錄因子GATA-3的表達(dá)[22]；不同濃度的金線蓮多糖可顯著降低免疫抑制小鼠脾臟組織中T-bet的表達(dá)或顯著增強(qiáng)GATA-3的表達(dá)[23].研究還表明，強(qiáng)雞散(主要由黃芪、黨參、白頭翁等組成)具有調(diào)節(jié)環(huán)磷酰胺致免疫抑制小鼠脾臟核轉(zhuǎn)錄因子GATA-3、T-bet表達(dá)量的作用，通過(guò)降低GATA-3的表達(dá)量，使Th1、Th2細(xì)胞的分化平衡向Thl方向轉(zhuǎn)化[24].

本試驗(yàn)結(jié)果表明，LPS可不同程度地提高小鼠脾臟細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α的表達(dá)，引發(fā)Th1、Th2細(xì)胞分化失衡.與模型組相比，牛至香酚試驗(yàn)組脾臟組織中GATA-3 mRNA的表達(dá)量增加，T-betmRNA的表達(dá)量減少；牛至香酚試驗(yàn)組的T-bet/GATA-3比值較模型組提高，提示牛至香酚通過(guò)提高T-betmRNA的表達(dá)量，降低GATA-3 mRNA的表達(dá)量來(lái)維持機(jī)體Th1、Th2細(xì)胞分化的動(dòng)態(tài)平衡，減少Th0細(xì)胞向Th1或Th2細(xì)胞發(fā)生漂移，減少LPS造成的免疫應(yīng)激.綜上所述，牛至香酚可以調(diào)節(jié)LPS應(yīng)激狀態(tài)對(duì)應(yīng)的脾臟相關(guān)細(xì)胞因子及核轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)；調(diào)節(jié)細(xì)胞因子mRNA的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，從而維持Th1、Th2細(xì)胞分化的動(dòng)態(tài)平衡，表明牛至香酚能對(duì)LPS造成的脾臟免疫損傷有很好的保護(hù)作用.這與李鵬等[25]的“由牛至油、肉桂油、百里香油組成的植物精油對(duì)于LPS所致的仔豬肝臟刺激有較好的保護(hù)作用”研究結(jié)果相似.

4 小結(jié)

本試驗(yàn)結(jié)果表明，牛至香酚能通過(guò)調(diào)節(jié)免疫應(yīng)激小鼠脾臟核轉(zhuǎn)錄因子mRNA的表達(dá)，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子mRNA的轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)相關(guān)細(xì)胞因子的分泌，減輕LPS對(duì)脾臟造成的免疫應(yīng)激損傷.