基于正交試驗的風(fēng)濕寧膠囊提取純化工藝研究

劉 培，葉 花，董晨虹，王鵬飛，王 科，段秀俊

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西晉中030619）

風(fēng)濕病是一組侵犯關(guān)節(jié)、骨骼、肌肉、血管及有關(guān)軟組織或結(jié)締組織為主的疾病，其中多數(shù)為自身免疫性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為慢性、進行性、對稱性病理改變?？赡芘c環(huán)境、感染和遺傳等因素有關(guān)，但其疾病機制尚未完全明確，其發(fā)病多較隱蔽而緩慢，病程較長，且大多具有遺傳傾向，診斷及治療均有一定難度。中醫(yī)藥在治療風(fēng)濕病方面有很大優(yōu)勢，近年來，初步闡明了很多中藥的有效成分和作用機制，不斷涌現(xiàn)出新的治療藥物，在改善患者生活質(zhì)量、緩解疼痛、減少致殘率、減輕藥物副作用方面有重要的臨床價值和現(xiàn)實意義［1-2］。

風(fēng)濕寧膠囊為山西省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院院內(nèi)制劑，由羌活、獨活、青風(fēng)藤、威靈仙、片姜黃、防風(fēng)、川芎、麻黃、肉桂、三棱、血竭、延胡索、川牛膝、熟地黃、砂仁、生姜和甘草17味中藥組成，主要用于治療風(fēng)寒濕邪痹阻經(jīng)絡(luò)所致類風(fēng)濕性及風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。本課題屬國家科技部重大專項重大新藥創(chuàng)制項目，前期課題組已經(jīng)對風(fēng)濕寧膠囊對風(fēng)寒濕痹型類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎［3-7］、膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎［8-10］的抗炎作用及機制做了大量研究，同時課題組對風(fēng)濕寧膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)做了研究，建立了獨活、青風(fēng)藤、血竭及肉桂的薄層鑒別方法以及青風(fēng)藤及血竭含量的測定方法［11］。風(fēng)濕寧膠囊中除血竭外的16味藥水煎液均具有不同程度的抗炎、鎮(zhèn)痛或免疫抑制等與治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相應(yīng)的藥理活性［12-17］，故16味藥的提取方法選擇了水煎煮，含揮發(fā)性成分的藥材先采用水蒸汽蒸餾法收集揮發(fā)油［18］，血竭粉碎入藥。為減少服用量，工藝純化選擇了醇沉淀法。采用正交試驗法對風(fēng)濕寧膠囊的水提醇沉工藝條件進行優(yōu)選，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 實驗儀器

Dionex高效液相色譜儀，PDA-100 Photodiode Array Detector檢測器，ASI-100Automated Sample Injector，Chromeleon 6 色譜工作站，DiamonsilC18（2）（150 mm×4.6 mm，5 μm） 色譜柱；METTLER TOLEDO AB135-S型十萬分之一天平，HANPING FA2104型萬分之一電子天平；SB-5200 DTDN超聲波清洗器（寧波新藝生物科技股份有限公司），容量瓶，錐形瓶。

1.2 藥材與試劑

青風(fēng)藤為防己科植物青藤Sinomenium acutum（Thunb.）Rehd.et Wils.的干燥藤莖，羌活為傘形科植物羌活Notopterygium incisum Ting ex H.T.Chang的干燥根莖及根，獨活為傘形科植物重齒毛當(dāng)歸Angelica pubescens Maxim.f.biserrata Shan et Yuan的干燥根，川芎為傘形科植物川芎Ligusticum chuanxiong Hort.的干燥根莖，威靈仙為毛茛科植物威靈仙Clematis chinensis Osbeck的干燥根莖及根，防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng)Saposhnikovia divaricata Schischk.的干燥根等，以上藥材均由山西中醫(yī)藥大學(xué)裴香萍副教授鑒定為正品。青藤堿（批號0774-200206，供含量測定用）化學(xué)對照品購自中國藥品生物制品檢定所。色譜測定用甲醇為色譜純，水為純凈水，其他所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 青藤堿的含量測定方法

2.1.1 色譜條件 色譜柱：DiamonsilC18（2）柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流動相：甲醇-0.1%三乙胺（35∶65）；檢測波長 262 nm；柱溫 30 ℃［11］。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的對照品青藤堿，加甲醇制成每1 mL含0.05 mg的溶液，搖勻，0.45 μm的濾膜濾過，即得。

2.1.3 供試品溶液的制備 取提取物干浸膏粉約0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%的甲醇溶液20 mL，超聲處理20 min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45 μm的微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 測定法 分別精密吸取上述兩種溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定。色譜圖見圖1。

圖1 風(fēng)濕寧膠囊青藤堿測定液相色譜圖

2.2 工藝條件考察［19-22］

2.2.1 提取工藝條件考察 選擇青藤堿作為考察對象，以青藤堿轉(zhuǎn)移率為考核指標(biāo)，選擇加水量、煎煮時間以及煎煮次數(shù)作為考察因素，每個因素選擇了3個水平（因素水平設(shè)定見表1），采用L9（34）正交表安排實驗。

表1 提取工藝考察因素水平表

2.2.2 純化工藝條件考察 按處方比例稱取各藥適量，按上述最佳煎煮工藝條件，加水煎煮，合并煎液，平均分成9份，仍以青藤堿轉(zhuǎn)移率作為考察指標(biāo)，對影響醇沉效果的3個主要因素藥液的濃縮程度、醇沉濃度以及醇沉?xí)r間進行考察，每因素設(shè)定3水平（因素水平設(shè)定見表2），仍采用L9（34）正交表安排實驗。

表2 純化工藝考察因素水平表

3 結(jié)果與分析

3.1 提取工藝條件的優(yōu)選結(jié)果與分析

按處方比例稱取各藥味適量，共9份，按照正交表設(shè)定的試驗條件分別進行煎煮，將所得煎液濃縮至稠膏，烘干。測定干膏中青藤堿的含量，計算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表3、表4。

從統(tǒng)計分析結(jié)果看，A為不顯著因素，Ⅱ＞Ⅰ＞Ⅲ；B為不顯著因素，Ⅱ＞Ⅰ＞Ⅲ；C為顯著性因素，且Ⅱ＞Ⅲ＞Ⅰ。即A2B2C2為最佳方案，而從實際試驗結(jié)果看A2B3C2應(yīng)為最佳方案。將兩種方案各重復(fù)試驗3次，從試驗結(jié)果看兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義，故從省時節(jié)能的角度選擇A2B2C2為最佳方案。

表3 提取工藝考察正交試驗結(jié)果

表4 提取工藝考察方差分析結(jié)果

3.2 純化工藝條件的優(yōu)選結(jié)果與分析

將所得藥液回收乙醇，濃縮至稠膏，烘干。測定各干膏中青藤堿的含量，計算轉(zhuǎn)移率，結(jié)果見表5、表 6。

表5 純化正交試驗結(jié)果

表6 純化方差分析結(jié)果

從統(tǒng)計分析結(jié)果看，A為顯著因素，Ⅲ＞Ⅰ＞Ⅱ；B為不顯著因素，Ⅰ＞Ⅱ＞Ⅲ；C為不顯著因素，Ⅰ＞Ⅲ＞Ⅱ，即A3B1C1為最佳組合。實際試驗結(jié)果也是A3B1C1為最佳組合。故選擇A3B1C1為最佳方案。

4 討論

研究結(jié)果表明，水煎煮最佳工藝條件為加水量10倍，煎煮時間為1 h，煎煮次數(shù)為2次，青藤堿轉(zhuǎn)移率約65%；醇沉淀最佳工藝條件為濃縮至1∶1.1，醇沉濃度為60%，時間為12 h，青藤堿轉(zhuǎn)移率約63%，中試驗結(jié)果表明，優(yōu)選的工藝條件基本合理。

曾考慮采用多指標(biāo)手段對工藝條件進行篩選，初步考慮以羌活與防風(fēng)中所含紫花前胡苷、威靈仙中所含常春藤皂苷元及青風(fēng)藤中所含青藤堿的綜合轉(zhuǎn)移率優(yōu)選最佳工藝條件，這樣可以兼顧各類成分的提取率。但由于本處方藥味多，實驗中除青藤堿外，紫花前胡苷與常春藤皂苷元均難以排除干擾，故選擇青藤堿作為工藝考察指標(biāo)。

水提醇沉淀的工藝路線是通過藥效試驗結(jié)果確定的，其抗炎止痛效果較優(yōu)。本實驗結(jié)果為風(fēng)濕寧膠囊的制劑開發(fā)應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。