用GC及GC-MS法對(duì)蜂膠中有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量的確證

趙 靜，李鵬飛，行江水，申國(guó)華

（山西省食品藥品檢驗(yàn)所，山西太原030001）

近年來(lái)對(duì)蜂膠的質(zhì)量進(jìn)行了風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，在檢測(cè)過(guò)程中我們對(duì)蜂膠進(jìn)行了有機(jī)氯農(nóng)藥殘留量（六六六，滴滴涕）的測(cè)定。從檢測(cè)結(jié)果看，在我國(guó)已禁用將近30年的有機(jī)氯農(nóng)藥在蜂膠中仍能檢出，雖然超過(guò)限制的不多，但有機(jī)氯類農(nóng)藥作為一種性質(zhì)穩(wěn)定、難以分解的高殘留農(nóng)藥，由于它的親脂性，常常通過(guò)積聚在脂肪中而進(jìn)入食物鏈，在生態(tài)系統(tǒng)中構(gòu)成惡性循環(huán)，對(duì)人體神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、免疫功能等造成不可忽視的危害，而現(xiàn)行的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)［1］并未將其列入檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)中。蜂膠被公認(rèn)為具有調(diào)節(jié)血脂、血壓、血糖等保健功能［2］，被譽(yù)為“紫色黃金”，作為蜂膠類保健食品的原料，市場(chǎng)占有很大［3］，對(duì)其進(jìn)行農(nóng)藥殘留的檢測(cè)切實(shí)可行，并應(yīng)延伸到保健食品領(lǐng)域。本文參考文獻(xiàn)［4］進(jìn)行檢測(cè)，用中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［5］及參考文獻(xiàn)［6-7］進(jìn)行確證，結(jié)果表明該確證過(guò)程數(shù)據(jù)可靠，方法可行，準(zhǔn)確性高。目前蜂膠檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)為《中國(guó)藥典》2015年版一部，其已經(jīng)將重金屬［8］的檢測(cè)收入標(biāo)準(zhǔn)［1］，而作為第一安全指標(biāo)有機(jī)氯農(nóng)藥的殘留應(yīng)引起足夠的重視，并建議列入相關(guān)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與試劑

氣相色譜儀：島津GC-2010Plus，附63Ni電子捕獲檢測(cè)器（ECD）、島津AOC-5000AUTO INJECTOR自動(dòng)進(jìn)樣器；氣質(zhì)聯(lián)用儀：Agilent Technologies6890N 5975B InertXL EI/CI MSD；氣相色譜柱：DM-1701（30 m×0.25 mm×0.25 m），DM-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm），HP-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；渦旋振蕩器（上海比郎儀器有限公司）；超聲提取器（昆山市超聲儀器有限公司）；低速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）。

石油醚（60℃～90℃）、二氯甲烷、丙酮、無(wú)水硫酸鈉、氯化鈉均為分析純（均為國(guó)藥），濃硫酸、正己烷均為優(yōu)級(jí)純。六六六（α-六六六、γ-六六六、δ-六六六、β-六六六）、滴滴涕（O.P′-DDT、P.P′-DDE、P.P′-DDD、P.P′-DDT） 標(biāo)準(zhǔn)品均來(lái)自農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，均為農(nóng)殘級(jí)（100 μg/mL正己烷溶液）。蜂膠從市場(chǎng)抽樣獲取。

1.2 色譜條件

1.2.1 DM-1701彈性石英毛細(xì)管柱 載氣為高純氮?dú)?，流量?.0 mL/min（恒流方式），進(jìn)樣分流比為 1∶1，進(jìn)樣量為 1 μL，進(jìn)樣口溫度為 230 ℃，ECD檢測(cè)器溫度為300℃。柱升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?00℃，以10℃/min升至220℃，再以8℃/min升至250℃，保持10 min。

1.2.2 DM-5彈性石英毛細(xì)管柱 載氣為高純氮?dú)?，流量?.8 mL/min（恒流方式），進(jìn)樣分流比為1∶1，進(jìn)樣量為 1 μL，進(jìn)樣口溫度為 280 ℃，ECD檢測(cè)器溫度為300℃。柱升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0℃，保持1 min；以40℃/min升至170℃，再以2.3℃/min升至230℃，保持17 min；最后以40℃/min升至280℃，保持5 min。

1.2.3 HP-5ms彈性石英毛細(xì)管質(zhì)譜柱 載氣為高純氦氣，流量為0.8 mL/min（恒流方式），不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量為1 μL，進(jìn)樣口溫度為280℃。柱升溫程序?yàn)椋撼跏紲囟?0℃，保持1 min；以40℃/min升至170℃，再以2.3℃/min升至230℃，保持17 min；最后以40℃/min升至280℃，保持5 min。質(zhì)譜條件：EI離子源，電子能量70 eV，光電倍增器電壓350 V，離子源溫度230℃，接口溫度280℃，掃描質(zhì)量范圍50～350 amu，溶劑延遲5 min，掃描模式采用選擇離子監(jiān)測(cè)。

2 方法

2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別精密吸取上述8種標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mL，置同一10 mL量瓶中，用正己烷定容，搖勻，作為單標(biāo)溶液的儲(chǔ)備液，濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，再根據(jù)各要求稀釋所需濃度。

2.2 蜂膠供試品溶液制備

2.2.1 方法1 取本品適量，混勻，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，置100 mL具塞錐形瓶中，加水20 mL浸泡過(guò)夜，精密加丙酮40 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量。用丙酮補(bǔ)足減失的重量，再加氯化鈉約6 g，精密加二氯甲烷30 mL，稱定重量，超聲15 min，再稱定重量。用二氯甲烷補(bǔ)足減失的重量，靜置（使分層），將二氯甲烷層迅速移入裝有適量無(wú)水碳酸鈉的100 mL具塞錐形瓶中，放置4 h。精密量取35 mL，于40℃水浴上減壓濃縮至近干，加少量石油醚（60～90℃）如前反復(fù)操作至二氯甲烷及丙酮除凈，用石油醚（60～90℃）溶解并轉(zhuǎn)移至10 mL具塞刻度離心管中，加石油醚（60～90℃）精密稀釋至5 mL，小心加入硫酸 1 mL，振搖 1 min，離心（3 000 r/min）10 min，取上清液，即得。濃硫酸的加入量可視樣品的磺化程度適當(dāng)?shù)囟嗉樱员ＷC磺化完全。

2.2.2 方法2 取本品適量，混勻，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，精密加入15 mL乙腈，超聲處理15 min（250 W，33 KHz），濾過(guò)，濾液收集到裝有6 g氯化鈉的50 mL具塞量筒中，收集濾液10 mL，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min，在室溫放置30 min，使乙腈相和水相分層。

2.3 凈化

從具塞量筒中精密量取5 mL乙腈溶液置具塞錐形瓶中，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入2 mL丙酮，蓋上鋁鉑，待凈化。將弗羅里硅土小柱依次用5 mL丙酮+正己烷（10+90）+5 mL正己烷預(yù)淋洗，條件化，當(dāng)洗脫溶劑液面到達(dá)柱吸附層表面時(shí)，立即倒入上述待凈化溶液，用10 mL具塞刻度管接收洗脫液，用10 mL丙酮+正己烷（10+90）分次沖洗燒杯后淋洗弗羅里硅土小柱。將淋洗液置于氮吹儀上，在水浴溫度50℃條件下，氮吹蒸發(fā)至小于5 mL，用正己烷定容至5 mL，搖勻，即得。

3 結(jié)果

3.1 不同提取方法測(cè)定結(jié)果

采用“2.2.1”制備蜂膠供試品溶液，用“1.2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果未檢出六六六、檢出滴滴涕（見(jiàn)表 1，見(jiàn)圖 1），再用“2.2.2”制備的蜂膠供試液，用“1.2.1”色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果未檢出六六六，但檢出滴滴涕。

3.2 驗(yàn)證結(jié)果

采用“2.2及2.2.2”制備蜂膠供試品溶液，用“1.2.2”色譜條件進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果均未檢出六六六，而均檢出滴滴涕（見(jiàn)表2，圖2）。

通過(guò)以上數(shù)據(jù)滴滴涕的量為0.39 mg/kg，而我國(guó)規(guī)定的總滴滴涕的綠色行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定為≤0.10 mg/kg，超出限度近4倍。

3.3 GC-MS定性確證

采用“2.2.1”制備蜂膠供試品溶液，用“1.2.3”色譜條件進(jìn)行質(zhì)譜確證，通過(guò)質(zhì)譜結(jié)果得出，供試品質(zhì)譜中在與滴滴涕（4個(gè)組分）相應(yīng)保留時(shí)間處檢出相應(yīng)的質(zhì)譜峰，且質(zhì)譜圖與對(duì)照品一致（見(jiàn)圖3）。

表1 不同提取方法測(cè)定結(jié)果

表2 驗(yàn)證結(jié)果

圖1 蜂膠粗篩品色譜圖

（1.P.P′-DDE；2.P.P′-DDD；3.O.P′-DDT；4.P.P′-DDT）（前面4個(gè)峰為六六六的色譜峰）

圖3 標(biāo)準(zhǔn)品與供試品的質(zhì)譜確證圖

4 方法考察

4.1 線性關(guān)系

精密量取“2.1”項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液適量，分別稀釋成0.001 mg/mL～0.2 mg/mL的梯度標(biāo)準(zhǔn)品溶液，測(cè)定色譜峰面積，以濃度為橫坐標(biāo)，積峰面積（四組分峰面積之和）為縱坐標(biāo)，求回歸方程，得Y=773 549X+20 496，r2=0.997，表明在 0.001～0.2 mg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。

4.2 精密度試驗(yàn)

精密量取“2.1”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0.01 mg/mL），重復(fù)進(jìn)樣6次，RSD為1.6%，表明儀器精密度良好。

4.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取蜂膠2 g，共取6份，照“2.2.1”制成供試品溶液，含量為0.39 mg/g（作為準(zhǔn)確度實(shí)驗(yàn)樣品），RSD為2.5%。

4.4 定量限及檢出限（以P.P′-DDE計(jì)）

以信噪比3倍為檢出限最低響應(yīng)值，計(jì)算檢出限為0.000 25 μg/g；以信噪比10倍為定量限最低響應(yīng)值，計(jì)算定量限為0.000 75 μg/mL。

4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，在制備后每間隔2 h采集其峰面積，以滴滴涕的峰面積之和計(jì)算，結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)保持穩(wěn)定。

4.6 準(zhǔn)確度考察

選用梯度加樣回收法，精密稱取蜂膠樣品1 g，精密稱定9份，分別精密加入濃度為1 mg/mL的滴滴涕混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.08 mL、0.1 mL、0.12 mL各3份，照“2.2.1”同法制成回收供試品溶液，計(jì)算回收率，平均回收率為90.5%，RSD為2.6%。

5 討論

蜂膠是老少病弱皆宜的營(yíng)養(yǎng)品，越來(lái)越被消費(fèi)者大量使用，也是傳統(tǒng)的消費(fèi)商品。由于蜜蜂在采蜜過(guò)程中采集了被農(nóng)藥污染的花粉或藥農(nóng)使用了有機(jī)氯農(nóng)藥，抑或日益加劇的環(huán)境污染使水源、空氣、土壤以及蜜粉植物所載的有害物質(zhì)增加，導(dǎo)致蜂膠中有機(jī)氯殘留，給蜂膠產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來(lái)隱患。

由于蜂膠的原料來(lái)源比較復(fù)雜，無(wú)法確定其準(zhǔn)確源頭，故無(wú)法從源頭上采取相應(yīng)補(bǔ)救預(yù)防措施；由于蜂膠及其中藥材的種植戶保健品品種繁多，沒(méi)有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，且所有涉及蜂膠及其保健品的標(biāo)準(zhǔn)中均未將有機(jī)氯殘留的檢測(cè)列入，存在很大的缺陷?；谏鲜銮闆r分析，建議有關(guān)部門(mén)除進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)蜂膠產(chǎn)品有機(jī)氯農(nóng)藥殘留的監(jiān)督及檢測(cè)外，還應(yīng)在蜂膠及其保健品蜂膠品種中將有機(jī)氯的檢測(cè)列入其中，以保障消費(fèi)者的健康安全。