食品中多種水溶性維生素快速檢測(cè)的方法研究

詹越城 ， 何 斌 ， 劉夢(mèng)婷 ，楊 娜 ， 裘鈞陶 ， 鐘世歡 ，汪慶旗 ， 楊 琳

（1.浙江公正檢驗(yàn)中心有限公司，浙江 杭州 310009；2.贊宇科技集團(tuán)股份有限公司，浙江 杭州 310009）

水溶性維生素是維持人體正常生命活動(dòng)不可缺少且需求量較少的一類有機(jī)化合物，其中一些維生素在人體內(nèi)不能合成或者合成的量不能滿足人體的需要，必須由食物供給，但是水溶性維生素?cái)z入過(guò)量或缺乏都將導(dǎo)致各種疾病[1]。目前，很多食品中都會(huì)添加水溶性維生素，但其是否符合要求還有待進(jìn)一步檢測(cè)驗(yàn)證。因此，加大對(duì)水溶性維生素檢測(cè)技術(shù)的研究，快速檢測(cè)食品中水溶性維生素含量，對(duì)于人們科學(xué)攝入水溶性維生素具有一定的指導(dǎo)意義，同時(shí)，對(duì)于科學(xué)控制水溶性維生素在食品中的添加量也具有重要意義。

目前，我國(guó)國(guó)標(biāo)只對(duì)單一或者2～3種水溶性維生素進(jìn)行檢測(cè)，其中?；撬帷⒕SB1（硫胺素）、維B2（核黃素）、維B3（煙酸、煙酰胺）、維B6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺） 主要用高效液相色譜測(cè)定；維B5（泛酸）、維B9（葉酸）、維B12（鈷胺素） 和維H（生物素） 主要用微生物法測(cè)定。這些方法前處理繁瑣、檢測(cè)周期長(zhǎng)、成本高，不能滿足多種物質(zhì)快速同時(shí)檢測(cè)的要求[2]。所以試驗(yàn)擬運(yùn)用HPLC-MS/MS聯(lián)用技術(shù)，建立同時(shí)檢測(cè)食品中12種水溶性維生素（?；撬?、維B1、維B2、煙酸、煙酰胺、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、泛酸、葉酸、維B12、生物素） 的快速檢驗(yàn)方法，針對(duì)不同樣品的前處理進(jìn)行優(yōu)化，可大大提高檢測(cè)效率，對(duì)于科學(xué)控制水溶性維生素在食品中的添加量具有重要意義[3]。

1 試驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

除非另有說(shuō)明，所有試劑均為分析純；水為GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

乙腈 （色譜純），美國(guó)Tedia公司提供；甲酸（優(yōu)級(jí)純），上海安譜科學(xué)儀器有限公司提供；乙酸銨、冰乙酸、鹽酸、三氯乙酸（分析純），杭州化學(xué)試劑有限公司提供；?；撬?、維B1、維B2、煙酸、煙酰胺、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、泛酸、葉酸、維B12、生物素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) （含量≥99%），Dr.Ehrenstorfer公司提供。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配置：?；撬?、維B1、維B2、煙酸、煙酰胺、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、泛酸、維B12、生物素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各稱取0.05 g至50.00 mL容量瓶，用0.01 mol/L鹽酸定容，配制成1 000μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，葉酸稱取0.05 g至50.00 mL容量瓶，用少量稀氨水溶解后，再用濃度為0.01 mol/L鹽酸定容，配制成1 000μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。再用水稀釋成適當(dāng)質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260 InfinityⅡ型超高效液相色譜儀（配備二元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱等）；Agilent 6470型三重四極桿質(zhì)譜儀；TGL-16G型高速離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；Milli-Q型純水儀，美國(guó)Millpore公司產(chǎn)品。

1.3 分析步驟

1.3.1 樣品前處理

（1） 果汁飲料。 稱取試樣5 g（ 精確至0.01） 于100 mL容量瓶中，用濃度為0.01 mol/L鹽酸溶液定容至刻度，混勻，用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定。

（2） 含乳飲料。 稱取試樣5 g（ 精確至0.01） 于100 mL容量瓶中，加入10 mL質(zhì)量濃度為40 g/L三氯乙酸溶液，混勻，超聲提取20 min，用水定容至刻度，取適量溶液以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min。取上清液用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定。

（3） 奶粉。 稱取試樣1 g（精確至0.01） 于100 mL容量瓶中，加入50 mL 45～50℃的水溶解，混勻后超聲處理30 min，待溶液溫度降至室溫后，用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值至4.50左右，用水定容至刻度，取適量溶液以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心5 min。取上清液用0.22μm微孔濾膜過(guò)濾后，供液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)定。

1.3.2 測(cè)定

（1） 色譜柱。Agilent SB-C18柱（2.1 mm×100 mm，1.8μm， USA）。

柱溫35℃，進(jìn)樣體積5μL，流速0.3 mL/min，流動(dòng)相A為濃度5 mmol/L乙酸銨，流動(dòng)相B為乙腈。

梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

（2） 質(zhì)譜條件。離子源：電噴霧離子源（ESI）；掃描方式為正離子，檢測(cè)方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）方式采集，毛細(xì)管電壓4.0 kV，霧化器 （N2） 壓力45 psi； 干燥氣 （N2） 溫度 350℃， 干燥氣 （N2） 流速10 L/min。

表1 梯度洗脫程序

12種水溶性維生素的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)見(jiàn)表2，12種水溶性維生素MRM色譜圖見(jiàn)圖1。

表2 12種水溶性維生素的質(zhì)譜檢測(cè)參數(shù)

2 結(jié)果與分析[6-8]

2.1 線性關(guān)系和檢測(cè)限

將標(biāo)準(zhǔn)溶液工作液按由低到高質(zhì)量濃度進(jìn)樣，在上述儀器條件下測(cè)定，分別以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、以對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制，標(biāo)準(zhǔn)曲線得到線性方程。

12種水溶性維生素線性及檢出限見(jiàn)表3。

由表3可知，12種水溶性維生素在各自標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好。

2.2 精密度和回收率

對(duì)3種不同基質(zhì)樣品分別進(jìn)行3個(gè)質(zhì)量濃度水平6次加標(biāo)回收試驗(yàn)，考查精密度和回收率。

圖1 12種水溶性維生素MRM色譜圖

表3 12種水溶性維生素線性及檢出限

12種水溶性維生素精密度及回收率試驗(yàn)見(jiàn)表4。

由表4可知，12種水溶性維生素加標(biāo)樣品回收率為78.5%～89.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 為2.00%～4.99%，該方法具有較好的精密度，能滿足實(shí)際樣品的檢測(cè)需要。

2.3 結(jié)果計(jì)算和表達(dá)

試樣中目標(biāo)物的含量X，以μg/kg表示，按式計(jì)算：

式中：C——試樣溶液的質(zhì)量濃度，ng/mL；

V——試樣溶液的體積，mL；

m——試樣的質(zhì)量，g；

n——樣液稀釋倍數(shù)。

注：測(cè)定結(jié)果用平行測(cè)定的算術(shù)平均值表示，保留3位有效數(shù)字。

3 結(jié)論

12種水溶性維生素在相應(yīng)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999，不同樣品基質(zhì)中（果汁飲料、乳飲料、奶粉） 在3個(gè)質(zhì)量濃度水平加標(biāo)試驗(yàn)回收率在78.5%～89.4%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 為2.00%～4.99%， 方法檢測(cè)限 （LOD，S/N≥3）為 5.0μg/kg，定量限為20.0μg/kg。經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，該方法簡(jiǎn)便快速、重現(xiàn)性好、靈敏度高、結(jié)果可靠，適用于食品中12種水溶性維生素的快速篩查和定量測(cè)定。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）同時(shí)測(cè)定食品中?；撬帷⒕SB1、維B2、煙酸、煙酰胺、吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺、泛酸、葉酸、維B12、生物素的方法。樣品用水提取，提取液離心過(guò)濾后動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式測(cè)定。與目前的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)報(bào)道的方法相比，該方法在保證準(zhǔn)確性好、靈敏度高的同時(shí)，盡可能省去了復(fù)雜的前處理，為食品中同時(shí)快速測(cè)定多種維生素的研究提供了數(shù)據(jù)和基礎(chǔ)。

表4 12種水溶性維生素精密度及回收率試驗(yàn)