基于正交設(shè)計(jì)的桃花多糖提取工藝研究

崔京珍， 王 燕， 王柏華， 賀 江， 楊友偉， 平海佳

（1.湖南文理學(xué)院，生命科學(xué)學(xué)院，湖南 常德 415000；2.常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖南 常德 415000）

桃花是薔薇科落葉桃樹 （Prunus persica（L.）Batsch） 的花，桃在我國(guó)已有3 000多年的栽培歷史[1]，其美容養(yǎng)顏和保健功效在傳統(tǒng)醫(yī)療實(shí)踐中得到廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)中醫(yī)藥學(xué)認(rèn)為，桃花味甘辛、性微濕，入心、肺、大腸經(jīng)，具有活血、悅面、潤(rùn)膚、峻下利尿、通便、美容減肥及化瘀止痛等功效[2]。桃花還可作為營(yíng)養(yǎng)保健食品，具有美容減肥功效，其保健價(jià)值在《本草綱目》 《千金要方》 等都有“桃花之所以能減肥，是因?yàn)樗哂惺帨焯禎幔怪畯拇蟊愣觥钡墓π?，可“走泄下降、利大便甚快，用以治氣?shí)人病水飲用于滿，積帶大小便閉塞著，則有功而無(wú)害”[3]?？梢?jiàn)，桃花在醫(yī)藥、保健、美容養(yǎng)顏等領(lǐng)域的作用歷來(lái)受到人們重視。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究進(jìn)一步證明了桃花的藥用和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。其中多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、降血糖與清除自由基等生物學(xué)功效。桃花多糖對(duì)羥基自由基和超氧陰離子具有較強(qiáng)的清除能力，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其在天然抗氧化劑和功能食品領(lǐng)域具有較大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值[4]。由于分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸加深了對(duì)多糖及其復(fù)合物分子生理功能的認(rèn)識(shí)，快速高效、簡(jiǎn)便易行的提取工藝對(duì)多糖的研究具有重要意義。目前常用的多糖提取純化技術(shù)比較成熟，但是存在能源消耗大、效率不高的問(wèn)題，有關(guān)桃花多糖的提取工藝及優(yōu)化條件的研究報(bào)道不多。試驗(yàn)主要討論桃花多糖的測(cè)定及提取條件的優(yōu)化，為桃花多糖的提取及測(cè)定提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

桃花鮮花樣品采集自湖南省常德職業(yè)技術(shù)學(xué)院農(nóng)林工程系苗圃科研基地。桃花干樣：取鮮花微波殺青2 min，攤開晾干水汽后，置于烘箱內(nèi)于60℃條件下烘干至恒質(zhì)量，用研缽磨細(xì)，裝入封口袋備用。

乙醇、葡萄糖、濃硫酸、苯酚，均為分析純。

1.2 主要儀器設(shè)備

UV-1800型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司產(chǎn)品；PHS-3E型pH計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器公司產(chǎn)品；TDZ5-WS型臺(tái)式低速離心機(jī)，上海盧湘儀離心儀器有限公司產(chǎn)品；予華SHZ-D型循環(huán)水真空泵，鞏義市予華儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3 測(cè)定方法

1.3.1 桃花中多糖提取工藝

準(zhǔn)確稱取1.000 g干燥且粉碎后的桃花于100 mL棕色磨口瓶中，加一定量的蒸餾水，在熱水浴中振蕩浸提后，用真空泵抽濾，收集濾液于250 mL三角瓶中，將濾液濃縮，用乙醇沉析后，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心7 min，保留沉淀物，加2 mL蒸餾水溶解，用苯酚-硫酸法測(cè)定水溶性多糖。

1.3.2 桃花中水溶性多糖含量的測(cè)定（苯酚-硫酸法）

制作多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖20 mg于500 mL容量瓶中，加水至刻度，分別吸取0.4，0.6，0.8， 1.0， 1.2，1.4，1.6， 1.8， 2.0 mL， 各以水補(bǔ)至2.0 mL，然后加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL，靜置10 min，搖勻，室溫放置20 min后于波長(zhǎng)490 nm處測(cè)定吸光度，以橫坐標(biāo)為吸光度、縱坐標(biāo)為多糖含量（μg），制作標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間的影響

不同提取時(shí)間對(duì)桃花多糖得率的影響見(jiàn)表1。

表1 不同提取時(shí)間對(duì)桃花多糖得率的影響

為明確在桃花多糖提取過(guò)程中，提取時(shí)間對(duì)多糖得率的影響，設(shè)計(jì)時(shí)間單因素試驗(yàn)。準(zhǔn)確稱取0.200 0 g磨細(xì)的桃花干花，以花水比1∶50的比例在 85℃的恒溫水浴中，分別進(jìn)行 30，60，120，180，240 min的提取，真空抽濾；將濾液濃縮后，用乙醇沉析，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心7 min，取沉淀物溶解定容，然后用苯酚-硫酸法測(cè)定水溶性多糖含量。

由表1可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，多糖提取率不斷提高，在240 min時(shí)桃花多糖提取率最高。一般情況下，在一定溫度和pH值條件下提取一定時(shí)間后，由于可溶性多糖發(fā)生美拉德反應(yīng)和焦糖化反應(yīng)，多糖提取率不再提高[5]，此結(jié)果還未出現(xiàn)提取率下降情況，根據(jù)試驗(yàn)需求可選擇240 min作為多糖提取的合適時(shí)間。

2.1.2 提取溫度的影響

不同提取溫度對(duì)桃花多糖得率的影響見(jiàn)表2。

為明確提取溫度對(duì)桃花多糖得率的影響，設(shè)計(jì)提取溫度單因素試驗(yàn)，觀察溫度從40～100℃的梯度變化，測(cè)定此提取溫度變化條件下多糖得率數(shù)據(jù)。由表2可知，隨著提取溫度的升高，多糖提取率不斷提高，提取溫度100℃時(shí)，多糖提取率為1.46%，達(dá)到最高值，其次是80℃時(shí)多糖得率為0.58%，提取溫度升高有利于多糖的提取。

表2 不同提取溫度對(duì)桃花多糖得率的影響

2.1.3 提取溶液pH值的影響

不同pH值提取液對(duì)桃花多糖得率的影響見(jiàn)表3。

表3 不同pH值提取液對(duì)桃花多糖得率的影響

提取液的pH值在偏酸或者偏堿的條件下都會(huì)造成多糖的降解，進(jìn)而影響多糖的產(chǎn)率，為探索合適的pH值提取液，在提取過(guò)程中更好地穩(wěn)定多糖，設(shè)計(jì)不同pH值提取液對(duì)多糖得率影響的單因素試驗(yàn)。用檸檬酸和氫氧化鈉將蒸餾水pH值調(diào)至1.0，3.0，7.0，9.0，準(zhǔn)確稱取1.000 g桃花干樣；以花水比1∶50，提取溫度80℃，提取時(shí)間30 min；再將提取液抽濾、濃縮；用乙醇沉析，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心7 min，取沉淀物溶解、定容；用苯酚-硫酸法測(cè)定水溶性多糖含量。

結(jié)果表明，在偏中性條件下，pH值為7時(shí)，多糖得率最高為0.69%；其次是pH值為9時(shí)，得率為0.52%；pH值1.0和3.0時(shí)，多糖得率較低分別為0.17%和0.18%。這可能是因?yàn)?，在偏酸或偏堿的條件下多糖容易降解，因此，在偏中性pH值為7的條件下，有利于多糖的提取。

2.1.4 料液比的影響

合適的料液比能節(jié)省原料消耗，提高提取效率，為優(yōu)化提取條件，更高效節(jié)能地提取桃花多糖，設(shè)計(jì)不同料液比對(duì)桃花多糖得率的試驗(yàn)。稱取1.000 g干桃花樣品，分別以1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50的料液比，pH值為7，100℃恒溫水浴中提取多糖；再將提取液抽濾、濃縮，用乙醇沉析，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心7 min；取沉淀物溶解、定容；用苯酚-硫酸法測(cè)定水溶性多糖含量。

不同料液比對(duì)桃花多糖得率的影響見(jiàn)表4。

表4 不同料液比對(duì)桃花多糖得率的影響

結(jié)果表明，料液比的變化對(duì)多糖提取的影響呈現(xiàn)不規(guī)則變化，多糖得率出現(xiàn)小幅波動(dòng)，可能因?yàn)槎嗵翘崛∵^(guò)程中有濃縮-沉析過(guò)程，這一過(guò)程中料液比的稍微變化對(duì)提取多糖產(chǎn)生不穩(wěn)定影響。因此，在桃花多糖工藝優(yōu)化過(guò)程中，料液比需要結(jié)合其他因素綜合考慮，依據(jù)目前試驗(yàn)條件，1∶40的料液比條件下多糖得率最高為0.67%。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

為進(jìn)一步確定各因素對(duì)桃花多糖提取的影響，在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，篩選提取溫度60，80，100℃；提取時(shí)間1，2，3 h；提取溶液pH值3.0，7.0，9.0；進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，以桃花多糖得率為指標(biāo)，進(jìn)行提取工藝優(yōu)選和決策。

桃花多糖提取條件正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表5，桃花多糖提取條件方差分析見(jiàn)表6。

表5 不同料液比對(duì)桃花多糖得率的影響

表6 桃花多糖提取條件方差分析

由表5和表6可知，提取時(shí)間顯著對(duì)多糖的提取影響較大。綜合各因素對(duì)桃花多糖得率的影響可知，對(duì)多糖得率的影響程度從高到低依次為B＞C＞A，即提取時(shí)間＞pH值＞提取溫度，綜合考慮其最佳工藝條件為A3B3C2，即提取溫度100℃，提取時(shí)間2 h，提取溶液的pH值為7。

3 結(jié)論

在提取桃花多糖的過(guò)程中，偏中性的條件下有利于多糖的提取，多糖提取率最高，而在偏酸或偏堿的條件下，多糖易分解，提取多糖溶液的pH值為7時(shí)對(duì)多糖的提取最有利。

料液比對(duì)多糖的影響呈現(xiàn)不規(guī)則波動(dòng)，單因素試驗(yàn)條件下1∶40的料液比多糖得率較高，濃縮和沉析的過(guò)程會(huì)影響多糖得率，此因素有待進(jìn)一步研究。

通過(guò)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化桃花多糖提取工藝，最佳桃花多糖提取條件為提取溫度100℃，提取時(shí)間2 h，提取溶液的pH值為偏中性，此條件下多糖得率為1.10%～1.53%。在試驗(yàn)條件下提取時(shí)間是影響多糖得率的最關(guān)鍵因素。