分散固相萃取法測定黃瓜中的喹啉銅殘留量

陳思宇 王明月 林冰 呂岱竹

摘 ?要 ?建立了分散固相萃?。╠-SPE）-高效液相色譜（HPLC）分析測定黃瓜中喹啉銅殘留量的方法。樣品采用乙腈和0.1 mol/L鹽酸混合溶液提取，C18填料凈化，高效液相色譜儀分離，紫外檢測器檢測。其色譜條件為：色譜柱SunFireC18（4.6×150 mm，5 ?m），流動相為十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液乙腈（65∶35）體系，流速0.6 mL/min，檢測波長250 nm。結(jié)果表明：在0.02、0.2、2 mg/kg三個添加水平下，喹啉銅回收率在92.3%～107.7%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在2.0%～7.7%之間。該方法操作簡單、靈敏度和準(zhǔn)確度高，能夠用于黃瓜中喹啉銅的殘留分析。

關(guān)鍵詞 ?黃瓜;喹啉銅;分散固相萃取;高效液相色譜法

中圖分類號 ?X839.2 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識碼 ?A

Abstract ?A high performance liquid chromatography （HPLC） coupled with the dispersive solid phase extraction （d-SPE） method for the determination of oxine-copper residue in cucumber was established. The sample was extracted by acetonitrile and hydrochloric acid （0.1 mol/L）. The extract was purified by C18. The analysis was carried out by phosphate buffer saline （PBS） and sodium dodecyl sulfate （SDS） -acetonitrile （65∶35） at a flow rate of 0.6 mL/min on SunFireC18 （4.6×150 mm， 5 ?m） column， and detected by HPLC with UV detector at a ultraviolet absorption wavelength of 250 nm. The recovery was in 92.3%107.7% with relative standard deviation （RSD） of 2.0%7.7% at spiked levels of 0.02， 0.2 and 2 mg/kg. The method is simple， sensitive and accurate， and could be used in the determination of oxine-copper residue in cucumber.

Keywords ?Cucumis sativus L.; oxine-copper; dispersive solid phase extraction; high performance liquid chromatography

DOI ?10.3969/j.issn.1000-2561.2019.07.029

8-羥基喹啉銅（oxine-copper，簡稱為喹啉銅）是黃瓜上常用的一種廣譜、高效、低毒的有機(jī)銅螯合物殺菌劑，噴施后在植物表面形成藥膜，釋放殺菌的銅離子，可有效抑制病菌的萌發(fā)和侵入，對梨、蘋果、黃瓜、西瓜和番茄等作物真菌和細(xì)菌性病害起到預(yù)防和治療作用[1-2]。喹啉銅的使用雖然可以減少農(nóng)業(yè)病蟲害，但過量使用會造成農(nóng)藥殘留，通過食物被人體吸收，銅在人體內(nèi)達(dá)到一定濃度時可形成羥基自由基的催化劑，造成人體DNA的損傷，誘發(fā)癌細(xì)胞的生成[3]，世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)將喹啉銅歸為第三類致癌物質(zhì)[4]。因此建立準(zhǔn)確快速的喹啉銅殘留檢測方法，是評價蔬菜水果中喹啉銅殘留風(fēng)險和監(jiān)管農(nóng)產(chǎn)品市場的必要手段。喹啉銅的傳統(tǒng)測定方法有氧化-還原滴定法[2]，該方法是通過目測顏色變化確定終點(diǎn)，準(zhǔn)確度不高，需要大量人力及分析時間，不適于大批量樣品的檢測。喹啉銅主要檢測方法有氣相色譜法，姚杰等[5-6]采用氣相色譜法測定蘋果中喹啉銅的殘留量，該方法需要將喹啉銅進(jìn)行化學(xué)衍生反應(yīng)，通過檢測生成的8-羥基喹啉含量計算喹啉銅含量，前處理操作復(fù)雜耗時。高效液相色譜法測定喹啉銅殘留量有相關(guān)報道[7-11]，肖浩等[12]和周夢春等[13-14]采用高效液相色譜測定稻田、番茄、黃瓜和土壤樣品中喹啉銅殘留量，以液液萃取的凈化方法進(jìn)行提取，正相和反相兩次萃取之后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，凈化操作繁瑣。針對這一點(diǎn)，本研究優(yōu)化了提取和凈化方法，采用乙腈加少量鹽酸進(jìn)行提取，減少了提取劑用量和提取時間;用分散固相萃取替代液液萃取凈化的方法，操作簡單、凈化效率高;同時采用十二烷基硫酸鈉離子對磷酸鹽緩沖液流動相體系，能使喹啉銅與雜質(zhì)更好地分離，從而建立了黃瓜中喹啉銅殘留量簡單、快速、準(zhǔn)確的分析測定方法。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

Waters e2695高效液相色譜儀和2489紫外檢測器，美國沃特世公司;Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)，德國默克密理博公司;CR22N落地式高速冷凍離心機(jī)，日本日立公司;AL204電子天平，上海梅特勒·托利多儀器有限公司;KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司;UMV-2多管旋渦混合器，北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司。

98.2%喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)品，德國Dr Ehrenstorfer GmbH公司;乙腈（色譜純），賽默飛世爾科技有限公司;二甲基甲酰胺和85%磷酸（分析純），廣州化學(xué)試劑廠;磷酸二氫鈉（分析純），汕頭市光華化學(xué)廠有限公司;十二烷基硫酸鈉（分析純），F(xiàn)arco Chemical Supplies;鹽酸（優(yōu)級純），廣州化學(xué)試劑廠;多壁碳納米管（MWCNTs）和C18填料，上海安譜實驗科技股份有限公司;PSA填料，深圳藍(lán)色海貝公司;實驗用水均為一級水。

1.2 ?方法

1.2.1 ?標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 ?稱取5 mg喹啉銅，以二甲基甲酰胺超聲溶解并定容至100 mL，得到50??g/mL的喹啉銅標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用乙腈稀釋至0.01、0.05、0.1、0.5、1.5 ?g/mL 5個濃度;以喹啉銅的濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 ?樣品的提取與凈化 ?稱取10 g黃瓜樣品于50 mL塑料離心管，加入14 mL乙腈和1 mL 0.1?mol/L的鹽酸，渦旋10 min，加入10 g氯化鈉，渦旋1 min，以8000 r/min離心5 min。

稱取50 mg C18填料于15 mL塑料離心管，加入上述上清液5 mL，渦旋1 min，以8000 r/min離心5 min，上清液待上機(jī)測定。

1.2.3 ?高效液相色譜檢測條件 ?紫外檢測器（UVD）;SunFireC18色譜柱（4.6×150 mm，5??m）;進(jìn)樣量10 ?L，柱溫25?℃，十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液為2.5 mmol/L磷酸二氫鈉+1.25 mmol/L十二烷基硫酸鈉溶液，用磷酸調(diào)pH至3.0;流動相為十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液和乙腈（65∶35）體系，流速0.6 mL/min，檢測波長250 nm。在此條件下，喹啉銅的保留時間為6～8 min。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

以標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)樣，待測農(nóng)藥的濃度（?g/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定線性范圍，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算相關(guān)系數(shù)，證明在實驗條件范圍內(nèi)儀器響應(yīng)與進(jìn)樣濃度呈線性關(guān)系。以保留時間進(jìn)行定性分析，以外標(biāo)法進(jìn)行定量分析。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?方法的線性關(guān)系、靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度

在上述條件下以喹啉銅質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)，在0.01～1.5 ?g/mL范圍內(nèi)的線性關(guān)系為y=221 000x3 700，r2=0.998。通過在黃瓜空白樣品添加喹啉銅0.02、0.2、2 mg/kg 3個濃度、每個濃度5個平行的加標(biāo)回收實驗，加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）結(jié)果見表1，色譜圖見圖1。結(jié)果表明，喹啉銅不同添加濃度的回收率在92.3%～107.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.0%～7.7%，用添加法測定喹啉銅的最低含量，得出黃瓜中喹啉銅的檢出限（LOD）為0.08?mg/ kg，最大殘留限量（MRL）為2 mg/kg，因此該方法的靈敏度、準(zhǔn)確度和精密度均符合農(nóng)藥殘留分析要求。

2.2 ?提取條件的優(yōu)化

喹啉銅不溶于多數(shù)有機(jī)溶劑，微溶于稀酸、吡啶等，在水中溶解度也很小，僅為0.0001%。因此本方法采取在乙腈中加入酸的方式對黃瓜中喹啉銅進(jìn)行提取率的實驗，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，用乙腈提取的黃瓜空白樣品，在目標(biāo)物保留時間處有雜峰干擾，而用鹽酸乙腈溶液提取的無雜峰干擾，說明加入一定濃度的鹽酸可去除部分雜質(zhì)，從而提高了準(zhǔn)確度。同時考察了乙腈中加入不同濃度鹽酸對回收率的影響，結(jié)果見圖3。當(dāng)樣品中喹啉銅添加水平為0.1 mg/kg，濃度較高時，直接用乙腈和乙腈加入0.1 mol/L鹽酸提取沒有太大的差別，回收率均為94.5%，乙腈加入0.5 mol/L和2 mol/L鹽酸提取，回收率偏低，分別為45.0%和39.0%;當(dāng)樣品中喹啉銅添加水平為0.02?mg/ kg，濃度較低時，直接用乙腈提取，喹啉銅保留時間為6～8 min;A：乙腈加入0.1 mol/L鹽酸提取;B：直接用乙腈提取。

2.3 ?流動相的優(yōu)化

本研究考察了乙腈水、乙腈磷酸鹽緩沖液、乙腈十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液3個不同體系的流動相，色譜圖見圖4。乙腈水流動相體系中喹啉銅響應(yīng)很小，乙腈磷酸鹽緩沖液流動相體系中喹啉銅保留時間在2 min左右，無法與黃瓜基質(zhì)中的雜峰分開。

乙腈十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液體系中分離效果好，響應(yīng)高，其主要原因是十二烷基硫酸鈉為離子對試劑，加入到流動相后與喹啉銅生成不帶電荷的中性離子，增加喹啉銅與固定相的作用，使分配系數(shù)增加，喹啉銅的保留時間由此前的2 min延長為7 min左右，從而達(dá)到更好的分離效果。但是十二烷基硫酸鈉對C18柱有一定程度的損傷，影響其使用壽命，濃度越高，損傷越大。本研究同時考察了pH為3時2.5、1.25、0.625?mmol/L 3個濃度的十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液流動相，以期得到喹啉銅峰形較好，十二烷基硫酸鈉濃度較低的流動相。結(jié)果表明，十二烷基硫酸鈉濃度為2.5 mmol/L時，流動相易產(chǎn)生乳白色沉淀，難以抽濾;濃度為0.625 mmol/L時，喹啉銅出峰較早，保留時間為4 min左右，受雜峰干擾;濃度為1.25 mmol/L時，喹啉銅峰形較好，響應(yīng)較高，周圍無雜峰干擾，因此選擇1.25?mmol/L十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液流動相體系。

A：乙腈水;B：乙腈磷酸鹽緩沖液;C：乙腈0.625 mmol/L十二烷基硫酸鈉酸鹽緩沖液;

D：乙腈1.25 mmol/L十二烷基硫酸鈉酸鹽緩沖液。

A： Acetonitrile and water; B： PBS-acetonitrile; C： PBS and SDS （0.625 mmol/L）-acetonitrile;

D： PBS and SDS （1.25 mmol/L）-acetonitrile.

2.4 ?凈化條件的選擇

本研究比較了多壁碳納米管、C18和PSA填料凈化對回收率的影響，結(jié)果見圖5。多壁碳納米管具有較高比表面積和較強(qiáng)的物理吸附能力[15]，有利于色素類和極性物質(zhì)的去除。多壁炭納米管不同用量下的回收率表明，多壁碳納米管用量超過10 mg時，回收率低于70.0%，達(dá)不到農(nóng)藥殘留分析要求。C18填料是一種硅膠基質(zhì)吸附劑，通過疏水作用吸附非極性和弱極性化合物。C18填料不同用量下的回收率表明：C18填料用量50 mg時回收率為100.4%，用量100 mg時回收率為97.0%，當(dāng)用量超過300 mg時，回收率低于70.0%，達(dá)不到農(nóng)藥殘留分析要求。PSA填料為乙二胺基-N-丙基硅烷，極性比C18填料強(qiáng)，對中等極性的多種化合物具有較好的吸附能力。PSA填料不同用量下的回收率表明：PSA填料用量對回收率的影響不明顯，均在95.9%～102.2%之間。從凈化效果來說，多壁碳納米管用量超過10 mg，色素去除較為干凈，上機(jī)液澄清，C18和PSA填料用量增加，上機(jī)液顏色變化不大;從色譜圖來看，50 mg C18填料凈化后雜峰更少，因此選擇50?mg C18填料進(jìn)行凈化。

A： 多壁碳納米管; ?B： C18和PSA

A： Multi-walled carbon nanotubes; B： Octadecylsilane and primary-secondary amine absorbent

3 ?討論

本研究以分散固相萃取-高效液相色譜法進(jìn)行分析，快速、簡單、準(zhǔn)確度高，目前喹啉銅尚無檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，據(jù)文獻(xiàn)報道，喹啉銅分析方法現(xiàn)在主要有氣相色譜法[5-6]和高效液相色譜法，氣相色譜法需要將喹啉銅衍生化為8-羥基喹啉，前處理操作繁瑣，易引起目標(biāo)物的損耗。液相方法無需衍生，其方法準(zhǔn)確度更高，王志新等[5]用氣相色譜法檢測了蘋果中喹啉銅，其回收率在79.8%～98.3%之間，本方法回收率在92.3%～ 107.7%之間。同時我們對提取和凈化方法進(jìn)行了優(yōu)化，目前喹啉銅的提取方法有超聲、振蕩和勻漿，王志新等[5]用30 mL提取劑振蕩60 min提取，肖浩等[12]用80 mL提取劑超聲30 min提取，提取劑用量大，提取時間長，本研究以15 mL鹽酸乙腈溶液渦旋10 min提取，節(jié)省了提取劑用量和提取時間。本研究采用分散固相萃取法進(jìn)行凈化，相比現(xiàn)有的固相萃取法[7]和液液萃取法[10]凈化，前處理操

作簡單，節(jié)省人力和時間。在色譜分離方面，肖浩、周夢春等人用高效液相色譜法[12-14]測定水稻、土壤、番茄和黃瓜中喹啉銅，均采用5 mmol/L十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液流動相體系，本方法采用1.25 mmol/L的十二烷基硫酸鈉磷酸鹽緩沖液流動相體系，十二烷基硫酸鈉濃度低，分離效果好，并且對C18柱及色譜系統(tǒng)的損傷更小。通過回收率試驗證明，本方法精密度和準(zhǔn)確度高、檢出限低、結(jié)果重現(xiàn)性好，回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均達(dá)到農(nóng)藥殘留分析要求，可用于大批量黃瓜樣品中喹啉銅殘留的分析檢測。

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