不同食品加工工藝對(duì)DNA提取和品質(zhì)的影響

董蕾

摘要基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)的食品溯源和轉(zhuǎn)基因原材料檢測(cè)，取決于DNA模板量和品質(zhì)。而在食品加工過程中，溫度、pH值、發(fā)酵、機(jī)械力作用等都會(huì)導(dǎo)致原材料DNA降解，為后續(xù)食品溯源、摻偽檢測(cè)和轉(zhuǎn)基因原料檢測(cè)帶來挑戰(zhàn)。研究發(fā)現(xiàn)，雖然加工過程會(huì)導(dǎo)致DNA降解，但加工食品DNA提取后進(jìn)行PCR擴(kuò)增仍可實(shí)現(xiàn)。本文總結(jié)食品加工過程中的溫度、pH值、發(fā)酵、機(jī)械力作用等對(duì)DNA的影響，以期為加工食品溯源、摻偽檢測(cè)和轉(zhuǎn)基因原料檢測(cè)提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 食品加工;DNA降解;聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

中圖分類號(hào) TS201.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-5739（2019）05-0212-04

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展和大量應(yīng)用，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的食品溯源檢測(cè)摻偽檢測(cè)和GMO成分分析快速發(fā)展，但食品加工過程中的多種因素會(huì)對(duì)原材料DNA造成巨大影響，導(dǎo)致DNA一級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，使DNA水解、氧化或脫氨基1-2，影響PCR的定性或定量檢測(cè)，造成檢測(cè)結(jié)果不穩(wěn)定或失敗。同時(shí)，加工食品的DNA提取方法也會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。如何最大限度地獲得加工食品中的原料DNA，去除多糖、多酚、蛋白質(zhì)等對(duì)后續(xù)PCR過程的影響或抑制，也成為食品安全分子檢測(cè)的重要考慮因素。

本文總結(jié)了近年來國內(nèi)外針對(duì)加工食品的DNA提取、檢測(cè)及檢測(cè)方法，并進(jìn)行簡(jiǎn)要分析，以期為我國食品安全檢測(cè)、食品溯源和GMO成分分析的進(jìn)一步發(fā)展提供理論參考。

1加工食品DNA提取影響因素

進(jìn)行加工食品檢測(cè)的第一步是提取DNA.DNA的品質(zhì)（數(shù)量、純度）決定后續(xù)檢測(cè)效果。對(duì)于單一原料食品，如豆腐、玉米片等，可以認(rèn)為原料同一，則提取難度降低。但對(duì)于復(fù)合原料食品，如餅干、披薩等，原料的復(fù)雜性會(huì)導(dǎo)致DNA提取難度上升。在這類食品的處理過程中，就需要確定主要檢測(cè)原料，并制訂相應(yīng)提取方案。

一般情況下，加工食品的植物性原材料DNA提取利用CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）方法進(jìn)行，該方法具有去除植物性多糖S8和成本低廉的優(yōu)勢(shì)910。另外，也有利用磁珠富集的方式進(jìn)行DNA提取，產(chǎn)物直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增"。但由于食品加工過程的許多因素都可以造成DNA降解，導(dǎo)致DNA純度或濃度下降，因而在提取過程中通?？紤]這2個(gè)因素的折中方案。表1總結(jié)了前人進(jìn)行食品DNA提取中的優(yōu)化方案，這些方案通過凝膠成像、UV分光光度計(jì)、熒光檢測(cè)、傳統(tǒng)PCR巢式PCR或RT一PCR等方法進(jìn)行驗(yàn)證，獲得最優(yōu)結(jié)果。

食品中存在許多化學(xué)成分，這些化學(xué)成分會(huì)影響DNA的提取。如各種殺菌劑加工過程中物理性質(zhì)或化學(xué)性質(zhì)的改變，使DNA附著在非溶解性物質(zhì)上，降低DNA的抽提效果21-2）;氧化劑或酶水解縮短DNA長度！P21加工過程中的一些處理，如加熱冷凍等，也會(huì)降低DNA片段長度，從而改變DNA提取效率。

2DNA的數(shù)量、純度與PCR的關(guān)系

DNA的數(shù)量：與純度決定PCR擴(kuò)增效率。一般通過檢測(cè)DNA片段長度或平均分子量來判斷所提DNA的質(zhì)量，而DNA的質(zhì)量與所檢材料種類、加工過程和DNA提取方法相關(guān)（262）。在轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè)中，通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)片段（外源基因片段）分析是否為轉(zhuǎn)基因加工食品。

食品基質(zhì)中存在的大量化學(xué)物質(zhì)對(duì)于DNA純度有嚴(yán)重影響。DNA提取過程的選擇和優(yōu)化，可以消除潛在干擾和反應(yīng)抑制物，使基于DNA基礎(chǔ)的檢測(cè)技術(shù)獲得成功80-31。首先，原料自身包含的蛋白質(zhì)、多糖、脂類或多酚可能引起DNA污染25.31-32;其次，提取DNA時(shí)所用的CTABEDTA、酚類氯仿、SDS、乙醇、異丙醇等，都會(huì)干擾Taq酶活性，從而抑制PCR反應(yīng)18.3-31;再次，緩沖液中包含的鹽類、糖類以及其他化合物也會(huì)不同程度地降低PCR反應(yīng)效率35-37。因此，在進(jìn)行加工食品PCR擴(kuò)增時(shí)，往往需要稀釋DNA提取液，通過降低干擾物的濃度來提高PCR反應(yīng)效率陽通過分光光度計(jì)進(jìn)行DNA純度檢測(cè)，確定在230、260、280nm處的吸光值，計(jì)算A2xo/A280和Azo/A20當(dāng)A20/A280吸收值為1.5～2.0、A206A20超過1.7時(shí)，所提取DNA適用于PCR反應(yīng)839。眾多研究發(fā)現(xiàn)，用于PCR的樣品需要DNA的數(shù)量在20～200ng之1間4.31.4042，濃度過高影響反應(yīng)效率明，而過低則容易導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。

加工食品中往往包含多種原材料，并且經(jīng)過多重工序。由于原材料的特性不同，就會(huì)影響DNA的提取效率。對(duì)于不同食品，往往無法適用一種或幾種通用的提取方法，需要根據(jù)不同材料優(yōu)化不同提取過程。

3目標(biāo)片斷選擇和引物設(shè)計(jì)與PCR的關(guān)系

提取DNA是為了進(jìn)行后續(xù)的PCR檢測(cè)。普通PCR是使用最普遍的一種分子檢測(cè)手段。一般認(rèn)為，普通PCR作為一種定性分析手段，對(duì)目標(biāo)片段有很好的擴(kuò)增性。表2總結(jié)了大豆轉(zhuǎn)基因食品PCR評(píng)估DNA方法。另外，在小麥146-48]、精煉菜籽油149、馬鈴薯加工23.50-54等加工食品的研究中也常用普通PCR進(jìn)行。

與其他材料的PCR過程相似，加工食品DNA檢測(cè)的PCR過程，其引物序列、引物濃度、酶體系大小和程序設(shè)定都會(huì)對(duì)檢測(cè)結(jié)果有重要影響。而由于加工食品的DNA隨著加工步驟的不斷進(jìn)行已經(jīng)出現(xiàn)不同程度的降解，終產(chǎn)品的目標(biāo)片段長度往往僅有100～300bp，因而目標(biāo)片段選擇和弓物設(shè)計(jì)至關(guān)重要。

4加工過程對(duì)原材料DNA的影響

加工過程種類繁多，溫度、pH值、微生物發(fā)酵等均對(duì)食品原材料的DNA有影響，不同材料對(duì)于不同的加工過程也會(huì)有不同的降解效率，從而影響后續(xù)PCR反應(yīng)1586-9）。因此，了解不同加工過程對(duì)不同原料DNA的影響十分關(guān)鍵。

4.1溫度

高溫容易使DNA發(fā)生物理降解，即變性，其作用機(jī)理是高溫引起DNA的脫氨基或脫嘌呤作用。雖然高于100C會(huì)導(dǎo)致DNA鏈斷裂，二級(jí)結(jié)果被破壞5961，但高溫滅菌或灌制時(shí)使用121C進(jìn)行15min處理并不會(huì)導(dǎo)致全部DNA破壞。因此，這種加工過程處理后的食品，進(jìn)行DNA有效提取后仍可進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)40但如果再有后續(xù)的烹煮、烘烤、干燥等加熱過程，會(huì)5|起DNA的進(jìn)一步降解，而這些過程會(huì)導(dǎo)致DNA被切斷成小片段，使PCR效率降低。

4.1.1干熱加工。高溫伴隨干燥過程對(duì)DNA影響很大。在薯片制作過程中，70C、2h烘干會(huì)導(dǎo)致馬鈴薯DNA降解！21。而溫度越高，DNA的降解速率越快。94C、5min烘烤玉米過程就會(huì)導(dǎo)致玉米DNA577bp大小的片段全部消失;同時(shí)，研究人員發(fā)現(xiàn)，在玉米片加工過程中1009C烘烤會(huì)導(dǎo)致玉米基因組DNA降解7，但大部分經(jīng)過烘烤加工的食品中仍有小分子片段存在，使PCR擴(kuò)增成為可能。

4.1.2濕熱加工。Ogasawara等6對(duì)比利用千豆和濕豆制作豆奶制品的過程，同樣是100C60min以上的處理，千豆DNA未出現(xiàn)明顯的改變，而濕豆的830bp和1022bp片段都發(fā)生嚴(yán)重降解。加熱DNA溶液是影響DNA片段最簡(jiǎn)便的方法（通過改變時(shí)間和溫度）.Hupfer等I62發(fā)現(xiàn)，95C60min后，DNA片段長度損失600bp以上。同樣，Debode等網(wǎng)發(fā)現(xiàn)，在99C7h烹煮后，DNA平均片段仍保持在400bp。微波處理0～15min800W條件下，每次保持最長時(shí)間（15min）3次，中間冷卻，會(huì)導(dǎo)致DNA嚴(yán)重降解，但DNA片段大小仍大于目標(biāo)片段。

煮沸過程中添加化學(xué)成分也會(huì)增加DNA的損失。在玉米粉制作過程中，添加1%石灰粉煮沸20min，這一聯(lián)合效果使DNA片段降解到585bp以下。但后續(xù)沉降蛋白質(zhì)所加人酸和氯化鈣并不會(huì)導(dǎo)致DNA進(jìn)一步降解19但在豆腐制作過程中，酸和CaCl的添加并未影響目標(biāo)595bp大片段的擴(kuò)增61。在polenta（一種玉米淀粉制作的粥狀食物）制作過程中，玉米面粉溶解在0.4%氯化鈉溶液中30min煮沸，1914bp片段消失，然而211bp片段在105min加熱后仍可檢測(cè)到6。這些結(jié)果均顯示，水煮加熱時(shí)間越長，對(duì)片段的降解程度越高。

4.1.3油炸。在薯片的加工過程中，植物DNA在175C3min和150C1min下嚴(yán)重降解，只有96bp片段能夠被擴(kuò)增（終產(chǎn)品中）8。然而在油豆腐中，175C對(duì)其影響比較小，595bp擴(kuò)然增仍然能陂擴(kuò)增161。另外，對(duì)比油炸濕masa和烤干masa，油炸濕masa降解較低，表明水分的存在緩沖了油炸的熱沖擊。

4.2pH值

4.2.1酸性環(huán)境。水果或蔬菜的汁液通常均為酸性環(huán)境，或處理過程中環(huán)境為酸性。如番茄汁，pH值在4.0～4.4之間網(wǎng)。DNA在酸性環(huán)境下，純度下降，同時(shí)導(dǎo)致DNA斷裂網(wǎng)。在酸性環(huán)境下，輔以熱處理也會(huì)加速酸催化反應(yīng)66.70，BauerT等發(fā)現(xiàn)，在番茄醬制作過程中，pH值為4.3、溫度為65C時(shí)會(huì)導(dǎo)致DNA快速降解，在面粉發(fā)酵過程中，由于酵母菌發(fā)酵降低面團(tuán)pH值，使小麥DNA出現(xiàn)酸降解現(xiàn)象1-7）。濕磨玉米（酸性環(huán)境下浸泡）比單獨(dú)濕磨玉米更容易使DNA降解7。4.2.2堿性環(huán)境。相比酸性環(huán)境，DNA在堿性環(huán)境下穩(wěn)定性較高。pH值為8.5～9.5之間時(shí)，DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解鏈但并不會(huì)斷裂6。在墨西哥卷餅制作的最初階段，需要添加pH值較高的溶液同時(shí)加熱，形成pH值為11.0的加熱水溶液，這一過程導(dǎo)致DNA降解。在墨西哥，許多食物（如trilla，玉米片、tacoshells）均需要這種堿性溶液加熱處理。Kharazmi等發(fā)現(xiàn)，585bp片段擴(kuò)增失?。?0），但Hupfer卻發(fā)現(xiàn)，pH值9.0加熱60min，仍能夠檢測(cè)到1914bp片段大小DNA。

4.3發(fā)酵

在發(fā)酵過程中，由于微生物以食品原材料為原料進(jìn)行消化代謝，所產(chǎn)生的DNA酶對(duì)DNA有強(qiáng)烈降解效果[64]。Pan等叫發(fā)現(xiàn)，miso（日本豆面醬）的制作過程中經(jīng)過120d的發(fā)酵后，35S啟動(dòng)子無法檢測(cè)到。發(fā)酵結(jié)束放置5～6個(gè)月的miso中，DNA片段降解到200bp以下67。通過普通PCR和巢式PCR，可以檢測(cè)到95bp大小的DNA片段。因此，巢式PCR技術(shù)對(duì)于降解成小片段的DNA有更好的擴(kuò)增效果。

4.4機(jī)械力作用

在食品加工過程中，物理作用（如打磨、壓榨）也會(huì)使DNA原始片段出現(xiàn)斷裂。尤其在豆類加工制品、各種面粉的制作過程中，打磨是最基礎(chǔ)、最初的步驟，這些物理作用力將DNA降解成小片段，破壞DNA結(jié)構(gòu)。

對(duì)預(yù)包裝食品往往進(jìn)行輻照滅菌，以延長其貨架期。輻照射線也會(huì)對(duì)食品中的DNA產(chǎn)生強(qiáng)烈影響。Villavicencio等叫對(duì)豆粕制品施以1000Gy強(qiáng)度的輻照，DNA的破壞程度與輻照強(qiáng)度成正比。

5結(jié)論與展望

食品加工過程中的許多過程都會(huì)影響DNA的各級(jí)結(jié)構(gòu)。其中高溫和酸度是破壞DNA結(jié)構(gòu)的最主要因素。隨著PCR技術(shù)的不斷發(fā)展，利用各種變異型的PCR技術(shù)（如熒光定量PCR、巢式PCR技術(shù)等），使被降解為小分子的DNA片段檢測(cè)成為可能。但為了提高檢測(cè)的成功率和靈敏性，目標(biāo)片段的選擇成為關(guān)鍵因素。

由于人們對(duì)食品安全的關(guān)注度越來越高，食品摻偽、溯源和GMO檢測(cè)成為食品安全檢測(cè)的重要發(fā)展方向，利用分子生物學(xué)手段進(jìn)行原料檢測(cè)，使食品安全檢測(cè)更加快速、準(zhǔn)確。但由于食品加工過程中的各種過程會(huì)對(duì)原材料DNA分子造成破壞。因此，了解各種加工過程對(duì)DNA的影響，尤其是常見的、重要的加工過程，對(duì)于不同食品原料的影響，在產(chǎn)品溯源和GMO檢測(cè)時(shí)顯得非常關(guān)鍵。

未來，在食品原材料的分子檢測(cè)中，最應(yīng)關(guān)注的是小目標(biāo)片段的篩選以及針對(duì)不同食品建立特異性強(qiáng)的目標(biāo)片段及對(duì)應(yīng)引物體系，檢測(cè)確定在加工過程中各食品原材料的更穩(wěn)定基因，同時(shí)結(jié)合近年來發(fā)展起來的蛋白組學(xué)轉(zhuǎn)錄組學(xué)和核酸適配體等技術(shù)，為食品安全檢測(cè)提供更加便捷、準(zhǔn)確的方法革新。

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