西瓜品種‘蜜多’種子純度SSR標記鑒定

焦荻 商紀鵬 高素燕 王欽 郝建全 何偉 焦定量 呂敬剛 陳則明

摘? ? 要：為了準確、快速鑒定西瓜雜交種純度，建立8424類型西瓜品種的SSR分子標記純度鑒定體系?；?3對西瓜SSR核心引物，對天津市靜海區(qū)主要種植的8424類型西瓜品種‘蜜多進行分子標記純度鑒定。從供試引物中，總共篩選到4對在雙親上具有多態(tài)性差異的特異性引物，并從中選出2對多態(tài)性良好，條帶清晰的引物10號和22號，應(yīng)用于‘蜜多的分子標記純度鑒定。對4份雜交F1代樣品進行分子鑒定，結(jié)果分別為97.4%、94.9%、98.1%、97.8%，對比分子鑒定結(jié)果和田間形態(tài)學鑒定結(jié)果，結(jié)果偏差≤1.5%，表現(xiàn)出高度一致。研究結(jié)果表明，SSR分子標記適用于該品種純度鑒定，并可以取締田間表型鑒定，實現(xiàn)準確、快速檢測。

關(guān)鍵詞：西瓜;分子標記;SSR;純度鑒定

Abstract：In order to accurately and quickly identify the purity of watermelon hybrids， a SSR molecular marker purity identification system for 8424 type watermelon varieties was established. Based on the 23 pairs SSR core primers in watermelon， the molecular marker purity of 8424 type watermelon variety ‘Miduo which is mainly planted in Jinghai district of Tianjin was identified. From the test primers， a total of 4 pairs of specific primers with polymorphism differences in the parents were selected. Two pairs numbered 10 and 22， which have good polymorphisms and clear bands， were selected out of those 4 pairs to test the molecular purity of the ‘Miduo watermelon. Four hybrid F1 samples were identified by molecular identification， the results were 97.4%， 94.9%， 98.1% and 97.8%. The deviation between the results from the molecular identification and the field morphological identification is less than 1.5%， which reveals a high degree of consistency between the two methods. The results show that the SSR primers are suitable for testing the molecular purity for the ‘Miduo watermelon， and it can be used as an efficient and effective alternative method to the field morphological identification.

Key words： Watermelon;Molecular marker;SSR markers;Purity identification

我國是西瓜生產(chǎn)與消費大國，據(jù)統(tǒng)計2016年我國西瓜播種面積189.08萬hm2，總產(chǎn)量7 940萬t[1]。天津靜海地區(qū)西瓜栽培歷史悠久，栽培面積1 333 hm2左右[2]，具有代表性的地標產(chǎn)品——臺頭西瓜，是天津市靜海縣臺頭鎮(zhèn)特產(chǎn)，同樣是中國地理標志產(chǎn)品，享譽盛名。目前當?shù)卦耘嗟奈鞴掀贩N主要為8424類型，‘蜜多是天津科潤蔬菜研究所最新選育的8424類型西瓜品種，該品種果實發(fā)育期30 d左右，果實圓形，果皮淺綠色覆墨綠鋸齒條帶，瓤色鮮紅，瓤質(zhì)酥脆多汁，纖維少，口感好，產(chǎn)量較‘早佳（8424）提高，市場表現(xiàn)良好。

為了更好地保障瓜農(nóng)收益，對于種子企業(yè)來說，嚴格把控好種子質(zhì)量的四大指標（純度、凈度、水分、芽率）顯得尤為重要。西瓜種子純度鑒定一直以來多是依賴于傳統(tǒng)的田間鑒定方法，主要依靠人為進行田間的形態(tài)學觀察[3]。如果親本之間表型差異不明顯，很容易造成田間鑒定不準確，增加了人為鑒定誤差，并且費工費時，鑒定效率不高。

隨著分子標記技術(shù)的不斷發(fā)展，利用分子標記技術(shù)實現(xiàn)農(nóng)作物種子純度快速檢測成為了一種可能[4-6]。目前，基于西瓜全基因組序列開發(fā)出來的能夠最大限度代表了西瓜遺傳多樣性的23對核心SSR引物[7]，其位點覆蓋全基因組且均勻分布于西瓜的染色體上。筆者正是利用這23對核心引物，為天津地區(qū)主栽的‘蜜多西瓜品種，尋求一種快捷、準確的純度檢測方法，也為今后鑒定該類型西瓜品種種子純度、保證種子質(zhì)量提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗供試材料‘蜜多及其親本由天津科潤蔬菜研究所西瓜課題組提供（表1）。田間純度鑒定于2018年9—12月，在海南省樂東縣進行。SSR分子標記純度鑒定于2018年9—10月在天津科潤蔬菜研究所蔬菜種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室進行試驗。

表1 供試西瓜材料及形態(tài)學差異

[供試材料 種類 形態(tài)學差異 果皮顏色 果形 蜜多 子一代（F1） 綠花皮 高圓 蜜多母本 親本（♀） 淺綠花皮 圓 蜜多父本 親本（♂） 綠花皮 高圓 ]

1.2 分子標記純度鑒定方法

1.2.1 親本DNA提取 親本材料取小片子葉，DNA提取采用CTAB法[8]。

1.2.2 特異性引物篩選 特異性引物來源，參照國家蔬菜工程研究中心發(fā)表的最大限度代表西瓜遺傳多樣性的23對核心引物（表2）。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

PCR擴增反應(yīng)體系為12.5 μL：10× buffer 1.25 μL，dNTPs （2.5 mmol·L-1） 1 μL，每條引物（10 μmol·μL-1） 0.5 μL，TaqDNA聚合酶（2.5 U·μL-1） 0.2 μL，H2O 7.05 μL，DNA 2 μL。TaqDNA聚合酶購自全式金公司TransStar TaqDNA Polymerase。PCR擴增反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性 5 min;94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，34個循環(huán);72 ℃延伸5 min。4 ℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，進行銀染顯色，統(tǒng)計分析結(jié)果。

1.2.3 雜交種DNA提取及純度鑒定 每份待檢測樣品取100粒種子催芽。DNA提取采用堿式快速提取法，取1 cm長度的新鮮種子芽，放入2 mL離心管中，放入2個鋼珠，加入100 μL NaOH（0.1 mol·L-1）。用組織打碎儀將葉片打碎后沸水浴1 min。取10 μL上清液加入100 μL Tris-HCL（10 mmol·L-1，pH 2.0），吸打混勻，置于4 ℃冰箱保存待用。PCR擴增反應(yīng)和聚丙烯酰胺凝膠電泳方法同上，分析電泳結(jié)果。

1.3 田間形態(tài)學鑒定方法

通過觀察幼瓜果皮顏色和果實形狀，在坐果期和幼瓜期進行形態(tài)學鑒定，并將田間鑒定結(jié)果和分子鑒定結(jié)果進行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本特異性引物篩選結(jié)果

利用23對SSR核心引物，在‘蜜多品種親本上進行擴增。結(jié)果顯示（圖1），共有3、8、10、22等4對引物，在雙親之間表現(xiàn)出特異性差異，可作為雜交種純度鑒定候選引物。其中10號和22號引物，親本之間差異明顯，擴增條帶清晰，無雜帶。適用于雜交種純度鑒定，并進行進一步驗證。

2.2 ‘蜜多品種雜交種分子標記純度鑒定

待檢測‘蜜多品種雜交種每份樣品取100粒種子進行催芽，選取出芽的94粒種子進行純度檢測。選用10號和22號引物進行分子標記純度鑒定，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳，統(tǒng)計試驗結(jié)果（圖2）。10號引物擴增結(jié)果：94粒種子中有2個母本帶型，純度結(jié)果為97.9%。22號引物擴增結(jié)果：94粒種子中有1粒未跑出條帶，其余共有3個母本帶型，純度鑒定結(jié)果為96.8%。10號引物與22號引物鑒定結(jié)果吻合率為96.8%/97.9%≈98.9%。2對引物鑒定結(jié)果基本一致，分子鑒定結(jié)果取平均值為97.4%。

2.3 分子標記鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果比對

2018年9—12月，對分子標記純度鑒定的同批次種子在海南進行田間純度鑒定驗證。根據(jù)田間形態(tài)學觀察統(tǒng)計田間鑒定結(jié)果，并與分子鑒定結(jié)果進行比對（表3）。

結(jié)果顯示，分子鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果基本相同，兩者的純度偏差≤1.5%，符合允許的誤差范圍（≤2%）。因此可以應(yīng)用10號引物和22號引物對‘蜜多品種進行分子標記純度鑒定，從而代替田間表型鑒定。

3 討論與結(jié)論

諸如8424類型的西瓜品種及本研究中涉及到‘蜜多西瓜品種，在制種過程中都容易受到外界環(huán)境影響而出現(xiàn)兩性花，授粉過程中去雄不及時的話，便可能產(chǎn)生自交瓜，導致制種純度下降。為了保證種子純度，一方面，我們要嚴格按照制種流程，規(guī)范化制種，授粉過程中，對兩性花株要及時去除雄蕊[9]。另一方面，要加強對生產(chǎn)出來的種子，進行嚴格、準確的純度鑒定。筆者通過在雙親材料上對23對核心SSR引物進行篩選，得到了4對特異性引物，為該類型品種進行分子標記純度鑒定時提供了一個參考。但是，此種方法篩選到雜株均為親本帶型的自交材料，對于外緣的機械混雜和‘蜜多品種種子真實性鑒定還存在局限性[10]。

為了進行西瓜種子純度和真實性方面的檢測，目前的方法多是在核心引物的基礎(chǔ)上進一步擴大引物篩選，通過建立不同品種的DNA指紋圖譜[11]，利用多對既可以在2個親本上表現(xiàn)出特異性，又可以在不同品種雜交種F1代間表現(xiàn)出差異的引物進行鑒定。根據(jù)所運用的引物對數(shù)，進行多次PCR反應(yīng)，最終分析純度和真實性結(jié)果[12-13]。但是此種方法反應(yīng)步驟多，較為繁瑣。目前已有研究報道，利用多對SSR引物通過建立多重PCR檢測體系，實現(xiàn)了對種子純度和真實性的共同檢測[14-15]。今后在核心引物的基礎(chǔ)上擴大引物篩選，通過多重PCR體系構(gòu)建，可以實現(xiàn)對種子純度和真實性的共同檢測。

筆者針對目前天津市主要栽培的8424類型西瓜品種‘蜜多進行分子標記純度鑒定，其分子鑒定結(jié)果與田間鑒定結(jié)果偏差≤1.5%，符合允許的誤差范圍（≤2%），因此可以應(yīng)用分子鑒定的方法來代替田間純度鑒定方法。但是考慮到同類型不同品種的遺傳背景差異性，在進行分子標記進行純度鑒定前提，還應(yīng)該進行多次的田間試驗驗證，已確保所篩選到的特異性SSR標記鑒定結(jié)果可以真實、準確反映品種在田間的表型差異。

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