急性腦梗死患者血清中miR-15b表達變化及臨床意義

黃寶和 是明啟 張弘娟 黃娟

研究表明[1-2]，早期識別病因及準確預(yù)測病情變化對指導(dǎo)急性腦梗死患者治療及預(yù)后改善具有重要意義。miR-15b 作為 miR-15/16 家族成員，是廣泛存在于機體各系統(tǒng)特別是血管內(nèi)皮系統(tǒng)中的一類miRNA，與血管內(nèi)皮細胞生物學行為密切相關(guān)[3]，可通過調(diào)控血管生成相關(guān)基因表達而參與子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)生[4]，有研究指出[5]，miR-15b 作為抑制血管新生分子與腦梗死后側(cè)支循環(huán)建立相關(guān)。本研究分析急性腦梗死患者外周血中miR-15b 表達變化，探討其與患者病情及側(cè)支循環(huán)建立的相關(guān)性。

資料與方法

1.一般資料 選取2016年3月至2017年9月，在我院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的急性腦梗死患者165例，其中，男性 91 例，女性 74 例，年齡 34 ～78 歲，平均年齡(60.96±10.96)歲，納入標準：①均符合《中國急性缺血性卒中診治指南2014》中相關(guān)診斷標準；②首次發(fā)病，且入院時間距離發(fā)病在24 h 以內(nèi)；③均經(jīng)頭部影像學檢查確診。排除標準：①復(fù)發(fā)性腦梗死；②肝腎等重要臟器嚴重功能障礙者；③急慢性感染、嚴重創(chuàng)傷、惡性腫瘤、自身免疫系統(tǒng)疾病、先天性心臟病、心力衰竭、心瓣膜病、急性心包炎、肺動脈栓塞者，以及酗酒、服用避孕藥物者。同期，從體檢中心選取健康體檢者50 例作為對照組，其中，男性 27 例，女性 23 例，年齡 33 ～80 歲，平均年齡(60.86±14.37)歲，與病例組在性別、年齡差異無統(tǒng)計學意義(χ2= 0.021，P= 0.886；t= 0.743，P=0.458)，均衡可比。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準，所有研究對象均行知情同意。

2.主要試劑與設(shè)備 Trizol 試劑盒購自美國Invitrogen 公司，反轉(zhuǎn)錄和 PCR 試劑盒購自日本TaKaRa 公司，miR-15b 和內(nèi)參引物由上海生工生物公司設(shè)計合成，實時熒光定量PCR 儀購自美國ABI公司，血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和血管生成素-2(Ang-2)檢測試劑盒購自上海西唐生物有限公司。

3.方法 (1)神經(jīng)功能缺損評分：按照美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(NIHSS)對急性腦梗死患者神經(jīng)功能缺損程度進行評分，將患者分為三組：輕型組(＜4 分，n=72)、中型組(4 ～15 分，n=69)和重型組(＞15 分，n=24)。

(2)全腦數(shù)字減影血管造影(DSA)檢查：所有腦梗死患者在簽署知情同意書后，于入院5 d 時接受DSA 檢查。利用德國Neurostar 公司生產(chǎn)的雙C壁數(shù)字減影血管造影機完成檢查，用改良的Seldinger 術(shù)穿刺股動脈，用5F 的Pigtail 導(dǎo)管先對主動脈弓進行造影，觀察弓上各大血管開口情況，然后以5-F 單彎導(dǎo)管分別對雙側(cè)頸總動脈、鎖骨下動脈選擇性造影。采集速率4 幀/s，充分顯示動、靜脈期的血管影像。按照美國介入放射協(xié)會及神經(jīng)放射介入治療協(xié)會(ASITN/SIR)關(guān)于腦缺血后側(cè)支血流分級標準進行分級[6]：0 級：缺血區(qū)無側(cè)支血流；1 級：缺血區(qū)周邊有緩慢的側(cè)支血流；2 級：缺血區(qū)周邊及部分缺血區(qū)可見快速側(cè)支血流；3 級：缺血區(qū)可見緩慢的側(cè)支血流；4 級：整個缺血區(qū)均可有快速側(cè)支血流到達。0～1 級為側(cè)支循環(huán)未完全組；2 ～4 級為側(cè)支循環(huán)建立組。

(3)腦梗死體積評估：依據(jù)急性腦梗死患者MRI 影像學檢查結(jié)果，按照Pullicino 法對梗死灶體積進行評估[7]，并分為小梗死組(梗死灶體積＜5 cm3)、中梗死組(5 cm3≤梗死灶體積＜10 cm3)和大梗死組(梗死灶體積≥10 cm3)。

(4)血清中miR-15b 表達水平檢測：患者于入院次日和對照組于體檢當日抽取空腹靜脈血5 mL，1 600 r/min，離心15 min 后，留取血清，保存于-80℃冰箱以備用。按Trizol 試劑盒說明提取總RNA，檢測總RNA 純度和濃度。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用實時熒光定量PCR儀，以cDNA 為模板用PCR 試劑盒進行引物擴增，每個樣品設(shè)3 個復(fù)孔。引物序列：miR-15b：上游：5 ’-AGCAGCACATCATGGTTTAC-3 ’，下 游：5 ’-GTGCA GGGTCCGAGGT-3’； U6：上 游：5’-ATGGAACGCTTCACGAAT-3’，下游：5’-TCGGCAGCACATATACT AA-3’。PCR 條件：95 ℃ 5min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，74 ℃ 30 s，連續(xù)循環(huán) 40 次。以 U6 為內(nèi)參，用 2-△△Ct法計算 miR-15b 相對表達量。

(5)酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA 法)檢測血清中VEGF 和Ang-2 濃度：取血清，利用 ELISA 法檢測血清中VEGF 和Ang-2 濃度，所有操作均在標準實驗室內(nèi)按試劑盒說明完成。

4.統(tǒng)計學分析 使用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組間比較用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.急性腦梗死患者和對照組血清中miR-15b 表達及VEGF、Ang-2 濃度 急性腦梗死患者血清中miR-15b 相對表達量、VEGF 和Ang-2 濃度均高于對照組(P＜0.05)，見表1。

表1 急性腦梗死患者和對照組血清中miR-15b表達及VEGF、Ang-2 濃度()

表1 急性腦梗死患者和對照組血清中miR-15b表達及VEGF、Ang-2 濃度()

項目 急性腦梗死患者(n=165)對照組(n=50) t 值 P 值miR-15b 相對表達量 1.62±0.27 1.00±0.07 16.107 0.000 VEGF/(ng/L) 283.33±35.18 197.61±12.25 17.688 0.000 Ang-2/(ng/L) 41.65±7.80 24.44±2.45 15.356 0.000

2.不同側(cè)支循環(huán)建立組患者血清中miR-15b 表達及VEGF、Ang-2 濃度 側(cè)支循環(huán)建立組患者血清中miR-15b 相對表達量低于側(cè)支循環(huán)未完全組，而VEGF 和Ang-2 濃度高于側(cè)支循環(huán)未完全組(P＜0.05)，見表2。

表2 不同側(cè)支循環(huán)建立組患者血清中miR-15b表達及VEGF、Ang-2 濃度()

表2 不同側(cè)支循環(huán)建立組患者血清中miR-15b表達及VEGF、Ang-2 濃度()

項目 側(cè)支循環(huán)未完全組(n=67)側(cè)支循環(huán)建立組(n=98) t 值 P 值miR-15b 相對表達量 1.93±0.12 1.57±0.10 25.197 0.000 VEGF/(ng/L) 267.94±17.22 303.35±23.96 10.396 0.000 Ang-2/(ng/L) 34.26±2.42 47.28±3.17 28.402 0.000

3.不同神經(jīng)功能缺損評分患者血清中miR-15b表達及VEGF、Ang-2 濃度 與輕型組比較，中型組和重型組患者血清中miR-15b 相對表達量升高，而VEGF 和 Ang-2 濃度降低(P＜ 0.05)，與中型組比較，重型組患者血清中miR-15b 相對表達量升高，而VEGF 和 Ang-2 濃度降低(P＜0.05)，見表3。

4.不同腦梗死體積患者血清中miR-15b 表達及VEGF、Ang-2 濃度 與小梗死組比較，中梗死組和大梗死組患者血清中miR-15b 相對表達量升高，而VEGF 和 Ang-2 濃度降低(P＜0.05)，與中梗死組比較，大梗死組患者血清中miR-15b 相對表達量升高，而 VEGF 和 Ang-2 濃度降低(P＜0.05)，見表4。

表3 不同神經(jīng)功能缺損評分患者血清中miR-15b 表達及VEGF、Ang-2 濃度()

表3 不同神經(jīng)功能缺損評分患者血清中miR-15b 表達及VEGF、Ang-2 濃度()

注：與輕型組比較，aP＜0.05；與中型組比較，bP＜0.05

項目 重型組(n=24) 中型組(n=69) 輕型組(n=72) F 值 P 值miR-15b 相對表達量 2.12±0.16ab 1.68±0.11a 1.40±0.08 434.937 0.000 VEGF/(ng/L) 240.07±20.85ab 274.09±23.31a 315.78±21.24 127.187 0.000 Ang-2/(ng/L) 31.87±3.29ab 36.66±2.90a 49.69±2.61 539.232 0.000

表4 不同腦梗死體積患者血清中miR-15b 表達及VEGF、Ang-2 濃度()

表4 不同腦梗死體積患者血清中miR-15b 表達及VEGF、Ang-2 濃度()

注：與小梗死組比較，aP＜0.05；與中梗死組比較，bP＜0.05

項目 大梗死組(n=39) 中梗死組(n=69) 小梗死組(n=57) F 值 P 值miR-15b 相對表達量 1.91±0.15ab 1.58±0.10a 1.48±0.07 201.696 0.000 VEGF/(ng/L) 256.60±17.35ab 279.23±21.36a 316.52±19.72 107.601 0.000 Ang-2/(ng/L) 28.52±2.83ab 43.95±2.95a 56.93±3.58 1025.818 0.000

討 論

miRNA 在血管內(nèi)皮細胞增殖、凋亡、侵襲、成管等多種生物學行為中發(fā)揮重要作用[8]，同時，參與了神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育及功能形成過程[9-10]。動物實驗表明[11]，急性腦缺血大鼠腦組織中miRNA 表達譜改變。亦有研究指出[12]，急性腦梗死患者外周血中miRNA 表達譜發(fā)生了改變。本研究結(jié)果顯示，急性腦梗死患者血清中miR-15b 相對表達量較對照組升高，說明miR-15b 可能參與了急性腦梗死發(fā)生過程。

有研究指出[13]，側(cè)支循環(huán)建立是提高急性腦梗死患者缺血區(qū)血流灌注的關(guān)鍵。對減少梗死區(qū)域體積、改善患者預(yù)后及減少復(fù)發(fā)具有重要意義[14]。缺血性卒中梗死灶周圍血管新生建立側(cè)支循環(huán)涉及眾多的細胞因子，包括直接介導(dǎo)血管新生的因子(如VEGF、內(nèi)皮祖細胞和Ang)，以及間接介導(dǎo)血管新生的因子(如蛋白金屬蛋白酶、肽類因子、人肝細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、低氧誘導(dǎo)因子-1α、轉(zhuǎn)化生長因子-β1 等)[15]。VEGF 作為一種直接介導(dǎo)血管新生的因子，可通過促進血管內(nèi)皮細胞增殖、增加血管通透性、維護血管完整性等而參與了血管生成[16]。動物實驗表明[17]，VEGF 表達上調(diào)可促進腦缺血組織區(qū)新生血管形成，對缺血性卒中具有保護作用。有研究用鼠神經(jīng)生長因子肌肉注射治療急性腦梗死患者發(fā)現(xiàn)[18]，鼠神經(jīng)生長因子可促進患者外周血中VEGF 表達，從而改善腦梗死后神經(jīng)功能缺損癥狀。Ang-2 作為分泌型細胞因子，可與VEGF 產(chǎn)生協(xié)同作用，增強內(nèi)皮細胞對VEGF 的敏感性，促進血管新生[19]。本研究結(jié)果顯示，急性腦梗死患者血清中 VEGF 和 Ang-2 濃度升高，說明VEGF 和Ang-2 與急性腦梗死發(fā)病有關(guān)，與以往報道結(jié)果相同[20]。本研究結(jié)果顯示，與側(cè)支循環(huán)未完全組比較，側(cè)支循環(huán)建立組患者血清中miR-15b 相對表達量降低，而VEGF 和Ang-2 濃度升高，進一步說明miR-15b 可能作為一種抑制血管生成的因子而參與了側(cè)支循環(huán)建立過程。但由于DSA 所評估的側(cè)支循環(huán)與VEGF 誘導(dǎo)生成的新生血管是否匹配還需要進一步論證，因此，miR-15b 與側(cè)支循環(huán)建立間的關(guān)系尚待進一步研究明確。

有研究指出[21]，有側(cè)支循環(huán)開放患者的入院時神經(jīng)功能好于無側(cè)支循環(huán)。本研究結(jié)果顯示，隨著神經(jīng)功能缺損評分增加，患者血清中miR-15b 表達量升高，而 VEGF、Ang-2 濃度降低，說明 miR-15b 表達可能通過影響側(cè)支循環(huán)建立而與神經(jīng)功能缺損嚴重程度有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，隨著腦梗死體積增加，患者血清中 miR-15b 相對表達量均升高，而VEGF 和Ang-2 濃度降低，說明 miR-15b 表達與腦梗死體積有關(guān)，分析原因，在缺血、缺氧狀態(tài)下，繼發(fā)氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)，且腦梗死體積越大、病情越重，這種反應(yīng)越激烈[22]。

綜上所述，miR-15b 在急性腦梗死患者血清中呈高表達，可能通過靶蛋白VEGF 而參與側(cè)支循環(huán)建立，且與患者病情嚴重程度及腦梗死體積呈正相關(guān)，有望為急性腦梗死早期診斷及病情評估提供依據(jù)，但仍需要擴大樣本量進一步研究。