黑血動態(tài)增強(qiáng)磁共振成像技術(shù)對早期動脈粥樣硬化炎性反應(yīng)的可行性研究

董莉 申強(qiáng) 郭淼 李勐 張兆琪 陳慧軍

動脈粥樣硬化性疾病是威脅人類生命健康的“頭號殺手”。研究表明，炎癥在整個動脈粥樣硬化斑塊的形成、發(fā)展和最終到破裂導(dǎo)致心腦血管事件的過程中起著重要作用[1-5]。近期研究顯示，利用動態(tài)增強(qiáng)核磁共振(dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging，DCE-MRI)可以對在活體動脈硬化炎性反應(yīng)進(jìn)行成像和定量分析，但僅限于對中重度動脈粥樣化斑塊的檢測，對早期動脈硬化炎性反應(yīng)的檢測和定量分析方法仍需進(jìn)一步研究。本研究基于DCE-MRI 原理，探索一種新的黑血動態(tài)增強(qiáng)核磁共振成像技術(shù)在定量測量早期動脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)的價值。

材料與方法

1.動脈粥樣硬化模型建立 (1)3～4 個月齡，五指山小型豬20 頭，雌雄不限(雄性已去勢)，體質(zhì)量(29.29±1.25) kg(自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧所)。五指山小型豬20 頭連續(xù)編號，高脂高膽固醇喂養(yǎng)(基礎(chǔ)飼料+6%膽固醇+10%豬油)飲食。小型豬每日分2 次飼喂為避免動物突然喂飼高脂飲食出現(xiàn)應(yīng)激反應(yīng)，飼料量為體質(zhì)量的3%，采取喂飼高脂飲食與基礎(chǔ)飼料比逐漸增加的方法，10 d 后達(dá)到目標(biāo)量。

(2)按照中華人民共和國衛(wèi)生部實驗動物管理規(guī)定執(zhí)行(55 號文件，2001)，高脂飲食飼養(yǎng)，實驗前24 h 禁食禁水。自達(dá)到目標(biāo)量之日計算喂養(yǎng)4 周后，給予小型豬進(jìn)行腹主動脈球囊拉傷術(shù)。以3%戊巴比妥納30 mg/ kg 給予小型豬麻醉。麻醉平穩(wěn)后經(jīng)股動脈穿刺，用4 號穿刺針刺入動脈送入超滑導(dǎo)絲，造影下送入6F 直徑球囊導(dǎo)管，連接手推式壓力泵，將氣囊充氣自腹主動脈腎動脈水平(平腰3 ～4 椎體層面)向遠(yuǎn)段牽拉至髂動脈，造影下可見被球囊擴(kuò)張的血管局部明顯膨隆，每次30 s，間隔30 s，重復(fù)2～4 次，致腹主動脈內(nèi)膜剝脫及機(jī)械損傷。撤出導(dǎo)管，按壓止血。術(shù)后連續(xù)3 d 給予肌注青霉素200 萬單位，以防止術(shù)后感染。

2.影像學(xué)檢查 (1)MR 成像方法：掃描前24 h禁食，仰臥體位，使用表面線圈。所有檢查在3.0T磁共振掃描儀 3.0 T (PhilipsAchieva，Best，the Netherlands)完成。線圈采用小動物專用表面相控振線圈。根據(jù)三維時間飛躍法血管成像(time-of-flight，TOF)(TR=21 ms； TE=2.9 ms； Flip angle=15°)判斷血管位置。而后對血管壁(平腰3-4 椎體層面)進(jìn)行二維黑血多加權(quán)MR 成像，成像序列包括：軸位T1WI(TR=800 ms； TE=11 ms； ETL=10)；T2WI(TR=3 500 ms； TE=40 ms； ETL=12)。黑血動態(tài)增強(qiáng)(black blood dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging，BB DCE-MRI) 掃描采用 T1WI FSPGR 序列(TR=750 ms； TE=12 ms； TI1=325 ms； TI2=125 ms，ETL=8)，矩陣 259×259；動態(tài)增強(qiáng)掃描相位數(shù)為15，掃描3 層面，層厚為3.4 mm。對比劑為馬根維顯(Bayer Schering Pharma AG，Berlin，Germany，0.05 mmol/kg)，經(jīng)耳緣靜脈注射，注射速度為1 mL/s，隨后以同樣流率注射0.9%氯化鈉溶液20 mL。

(2)圖像處理和分析：由兩名經(jīng)專業(yè)培訓(xùn)的影像科醫(yī)生和影像學(xué)工程師閱讀分析圖像，應(yīng)用分析軟件CASCADE(美國華盛頓大學(xué)自行研發(fā))[6]輔助完成。參與分析圖像的工作人員對小型豬信息保持未知(盲法)并采取意見統(tǒng)一原則。根據(jù)血管壁圖像質(zhì)量評分標(biāo)準(zhǔn)，圖像質(zhì)量低(imagingquality，IQ＜2)認(rèn)為無法分析，予以排除(表1)。通過軟件，測量各層面管腔面積(lumen area，LA)、管壁面積(wall area，WA)、管壁標(biāo)準(zhǔn)化指數(shù)(normalize wall index，NWI)。計算血管壁容積傳輸常數(shù)(Ktrans)，血漿容積(Vp)，血管外細(xì)胞外容積(Ve)和曲線下面積(AUC)。

表1 圖像質(zhì)量判定的詳細(xì)標(biāo)準(zhǔn)

圖1 MR 圖像和相關(guān)病理對照圖 A：DCE-MRI 掃描動脈粥樣硬化斑塊可見強(qiáng)化(白色箭頭)；B 和C：相應(yīng)層面病理切片HE 染色顯示動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)新生血管(黑色箭頭)(B：HE 染色，×40；C：HE 染色，×100)

圖2 MR 圖像和相關(guān)病理免疫組化對照圖 A：DCE-MRI 掃描，管壁可見不均勻強(qiáng)化(白色箭頭)；B：IL6 免疫組化標(biāo)記巨噬細(xì)胞，C：TNF 免疫組化標(biāo)記巨噬細(xì)胞，棕色為陽性表達(dá)區(qū)域，藍(lán)紫色為細(xì)胞核(×400)

3.病理免疫組化分析 模型制備成功后于2周、16 周分別處死實驗動物以獲得不同的炎癥程度。取出腹主動脈至髂總動脈分叉處的主動脈，對掃描范圍內(nèi)血管進(jìn)行固定(0.9%氯化鈉溶液沖洗干凈后，10%甲醛浸泡固定)。使用HE 染色觀察血管的形態(tài)及動脈粥樣硬化斑塊形態(tài)。由于IL6 和TNF參與動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的炎性反應(yīng)，是巨噬細(xì)胞的主要介質(zhì)[7]，免疫組化方法使用IL6 和TNF 染色標(biāo)記動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)炎性細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)。以細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒且著色強(qiáng)度高于背景染色者判定為陽性。使用BA400 顯微鏡(攝像掃描裝置：Moticcam 2306)對病理切片進(jìn)行掃描，利用Image-ProPlus5.0 圖像軟件分析，計數(shù)每張切片400倍高倍視野下斑塊內(nèi)新生血管及巨噬細(xì)胞的數(shù)目。

4.統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。利用Spearman 相關(guān)分析，與病理微血管及巨噬細(xì)胞數(shù)目對照。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1.模型建立 15 頭五指山小型豬(15/20，75%)成功建立模型。死亡5 頭小型豬原因：球囊拉傷術(shù)前麻醉過量死亡2 頭；球囊拉傷術(shù)中誤吸死亡1 頭；球囊拉傷術(shù)后拉傷部位血栓形成致死2 頭。另3 頭建模成功的小型豬在建模后行磁共振掃描時(2 周 2 頭、16 周 1 頭)可疑藥物(對比劑)過敏死亡。與模型建立前水平對比，建模成功后小型豬體質(zhì)量顯著增加[(29.29±1.25)vs.(46.86±6.87) kg，P=0.0007]。

2.影像與病理結(jié)果對照 與微血管數(shù)目比較發(fā)現(xiàn)，Ktrans 與其具有較好的相關(guān)性(r=0.913，P=0.0003，圖1)。與巨噬細(xì)胞數(shù)目相比，Ktrans 亦與其具有較好的相關(guān)性(r=0.781，P＜0.0001，圖2)。

3.影像結(jié)果 (1)模型建立前后血管形態(tài)學(xué)比較：與模型建立前比較發(fā)現(xiàn)，管腔變小[(72.35±10.72vs.(67.09±10.14) mm2，P=0.0003]，管壁增厚 [(1.10 ± 0.07)vs.(1.20 ± 0.13) mm2，P=0.0361]，標(biāo)準(zhǔn)化血管壁指數(shù)變大 [(0.0149 ±0.0019)vs.(0.0173±0.0018)，P＜0.0001，表2]。

(2)模型建立前后血管功能學(xué)比較：模型建立前、后比 較發(fā) 現(xiàn)，Ktrans [(0.0173 ± 0.0032)vs.(0.0307±0.0037)，P＜0.0001]、Vp[(0.0157±0.0041)vs.(0.0321±0.0122)，P= 0.0025]、Ve[(0.0988 ± 0.0229)vs.(0.1678 ± 0.0368)，P＜0.0001]，AUC[(11784±2013)vs.(18822±4948)，P=0.0057]數(shù)值均顯著增高(圖3)。

表2 模型建立前后血管形態(tài)學(xué)結(jié)果比較()

表2 模型建立前后血管形態(tài)學(xué)結(jié)果比較()

項目 模型建立前 模型建立后 P 值管腔(LA)/mm2 Max 76.83±9.76 71.49±8.68 0.0001 Min 67.12±7.66 61.82±8.32 0.0002 Mean 72.35±10.72 67.09±10.14 0.0003管壁(WA)/mm2 Max 1.19±0.08 1.39±0.14 0.0003 Min 0.80±0.06 0.91±0.08 0.0008 Mean 1.10±0.07 1.20±0.13 0.0361標(biāo)準(zhǔn)化血管壁指數(shù)(NWI)MaxNWI 0.0159±0.0028 0.0209±0.0037 0.0003 MeanNWI 0.0149±0.0019 0.0173±0.0018 ＜0.0001

討 論

易損斑塊與穩(wěn)定斑塊的增強(qiáng)曲線有很大不同，通過斑塊不同的MRI 強(qiáng)化方式，有助于判斷斑塊的易損性[8-10]。DCE-MRI 灌注強(qiáng)度的定量值不僅反映斑塊內(nèi)新生血管中對比劑的強(qiáng)度，也同時包括了彌散至細(xì)胞外基質(zhì)中的對比劑，從而引起對斑塊內(nèi)的新生血管密度的過度評估，若將該定量指標(biāo)應(yīng)用于臨床，還需進(jìn)行一系列相關(guān)實驗得出其可靠的校正系數(shù)[11-12]。

從DCE-MRI 的動力學(xué)模型中可以得到一些反映血液供應(yīng)和通透性的參數(shù)[13]。在以往亮血DCEMRI 的研究表明，動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)的濃度變化使用藥代動力學(xué)模型進(jìn)行分析所得到的灌注參數(shù)：分?jǐn)?shù)血漿容量(fractional plasmavolume，Vp)與新生血管的面積相關(guān)[14]，而對比劑的轉(zhuǎn)移常數(shù)(transfer constant，Ktrans)與新生血管的通透性相關(guān)[14]。證明Vp 和Ktrans 能夠反應(yīng)血管壁通透性和細(xì)胞外間隙，從而反映斑塊內(nèi)的炎性反應(yīng)。Ktrans 值越大，則新生微血管數(shù)量越多，炎癥反應(yīng)越重[15]。然而，亮血DCE-MRI 對中重度的斑塊可以進(jìn)行測量，而動脈粥樣硬化早期由于斑塊負(fù)荷沒有中重度的斑塊負(fù)荷程度重，從而限制了其使用[16]。

圖3 血管功能學(xué)比較圖 A-D：炎性指標(biāo)血管壁容積傳輸常數(shù)(Ktrans)，血漿容積(Vp)，血管外細(xì)胞外容積(Ve)，曲線下面積(AUC)模型建立前后變化

相對于亮血 DCE-MRI 技術(shù)而言，黑血 DCEMRI 具有以下優(yōu)勢：①去除血流信號對管腔邊界的干擾；②較高的空間分辨率和信號噪聲比[17]。Haikun 等研究發(fā)現(xiàn)，對亮血及黑血技術(shù)進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)黑血技術(shù)對管壁增厚不明顯的血管可以測量Ktrans 指標(biāo)，從而定量測量炎性反應(yīng)的影像指標(biāo)[17]。本研究使用新型黑血DCE-MRI，發(fā)現(xiàn)其檢測指標(biāo)Krans 與新生微血管數(shù)目及巨噬細(xì)胞數(shù)目二者具有較好的相關(guān)性。新生微血管是動脈粥樣硬化易損斑塊的重要病理學(xué)標(biāo)志之一，而斑塊內(nèi)新生微血管的形成是由斑塊內(nèi)的炎癥反應(yīng)引起的[18-19]。有學(xué)說認(rèn)為斑塊內(nèi)新生微血管是巨噬細(xì)胞進(jìn)入纖維帽和斑塊肩部的主要途徑，斑塊內(nèi)的巨噬細(xì)胞、金屬蛋白酶與內(nèi)彈性膜的破裂和纖維帽膠原纖維溶解，增加斑塊破裂和動脈血栓形成的風(fēng)險[20-21]。處于活動期的動脈粥樣硬化斑塊新生微血管數(shù)目多，斑塊內(nèi)的炎性反應(yīng)水平高。斑塊炎性過程可以引起細(xì)胞外容積的增加和細(xì)胞內(nèi)皮的通透性。新型黑血DCE-MRI 成像基于此特點，對比劑可以快速的進(jìn)出斑塊細(xì)胞外的空間，顯像組織的微循環(huán)、灌注及毛細(xì)血管通透性的情況，有助于提高動脈粥樣硬化易損斑塊的檢出和病變程度[22-23]。而且，新型黑血DCE-MRI 可以監(jiān)測炎性反應(yīng)的差異，可作為一種監(jiān)測動脈粥樣硬化炎性反應(yīng)變化的無創(chuàng)性影像學(xué)指標(biāo)。

本研究采用五指山小型豬的動脈粥樣硬化模型，其管腔內(nèi)徑與人類的血管內(nèi)徑接近，可模擬人類血管的動脈粥樣硬化。通過研究五指山小型豬模型建立前后血管形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)與模型建立前比較，管腔變小，管壁增厚，標(biāo)準(zhǔn)化血管壁指數(shù)變大。這與人類動脈粥樣硬化的演變相一致，今后能夠作為人類動脈粥樣硬化研究的動物模型。

本研究不足之處在于實驗動物數(shù)量較少，動脈粥樣硬化模型建立及核磁共振掃瞄時時實驗動物病死率高。其原因主要包括實驗中麻醉過量死亡，誤吸死亡及血栓形成導(dǎo)致術(shù)后死亡。這些需在今后的模型建立中予以注意。另外，由于ktrans 所需的藥代動力學(xué)分析中的血管輸入函數(shù)無法直接測量，通過肌肉組織作為對照進(jìn)行計算，有可能引入誤差。最近的LaBBI 技術(shù)[17]可以同時采集黑血和亮血圖像，有望可以獲得更高的精度。

總之，黑血動態(tài)增強(qiáng)MR 成像方法可以反映早期動脈粥樣硬化斑塊炎癥特征。并可以定量測量炎性反應(yīng)的影像指標(biāo)，為早期動脈粥樣硬化提供了一種無創(chuàng)的影像監(jiān)測手段。