妊娠對野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠右心功能的影響

梁翠 方英倫 趙芳 侯宇希 謝謹捷 馬駿 趙麗云

隨著我國二胎政策的開放及高齡產婦的增多，妊娠合并心臟的病患呈逐年增多趨勢，而妊娠合并肺動脈高壓是妊娠期致死率最高的疾病之一。肺動脈高壓患者就診時間較晚，臨床孕早中期資料不足，本研究通過超聲心動圖評估野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠在不同妊娠時期的右心功能，彌補臨床資料的不足，為臨床診治該類患者提供參考依據。

材料與方法

1.實驗動物及分組 6 周，雌性，SD 大鼠，購于斯貝福(北京)生物技術有限公司，依照首都醫(yī)科大學附屬北京安貞醫(yī)院實驗動物飼養(yǎng)與使用指南，飼養(yǎng)于北京安貞醫(yī)院實驗動物飼養(yǎng)中心。提供充足的食物和水源，飼養(yǎng)環(huán)境為24 h 的亮暗光照循環(huán)，空氣濕度50% ～60%，溫度20 ～22 ℃。由于野百合堿注射后大鼠的存活率下降及誘導肺動脈高壓大鼠妊娠的成功率較低，故采用隨機數字分組法將55 只大鼠不對等分為三組：①肺動脈高壓組(A 組，n=18)，②妊娠合并肺動脈高壓組(B 組，n=25)，③空白對照組(C 組，n=12)。

2.建立肺動脈高壓模型 適應性飼養(yǎng)1 周后，A組和B 組大鼠頸背部注射野百合堿60 mg/kg(MCT Sigma-Aldrich，美國)，空白對照組注射同等容量的鹽酸氯化鈉溶液。

3.誘導PAH 大鼠 妊娠在注射MCT 2 周后，將B 組雌鼠與雄鼠 2 ∶1 ～3 ∶1 合籠，于每晚 20：00 到早8：00 合籠，早上結束合籠時觀察陰栓，觀察到陰栓則結束合籠，否則繼續(xù)合籠，日期不超過3 d。

4.超聲監(jiān)測 觀察到陰栓的當天記為妊娠第一天。在 B 組誘導妊娠前 1 天(T0)，妊娠第 3 天(T3)、第 9 天(T9)、第 15 天(T15)對各組大鼠進行麻醉(10%水合氯醛0.3 mL/100 mg)，當翻正反射消失后，胸前區(qū)脫毛，仰臥位固定，用小動物超聲診斷儀(VisualSonics：VEVO2100)，探頭頻率為 30 MHz，將取樣容積置于肺動脈瓣上測量肺動脈瓣上流速(pulmonary valve velocity，PVV)，對頻譜進行分析，測量加速時間(acceleration time，AT)、減速時間 (deceleration time，DT)，加速度 (acceleration speed，AS)，減速度(deceleration speed，DS)，肺動脈內徑(pulmonary artery inner diameter，PAID)，主動脈內徑(aortic diameter，AD)，右心室游離壁厚度(RVWT)及右心室舒張末期內徑(RVEDD)；在主動脈根部大動脈短軸切面測量舒張期主動脈內徑(AD)；計算其比值(PAID/AD)。每一超聲測定值取3 個連續(xù)心動周期測量的均值。

5.體肺循環(huán)壓力測定 在B 組大鼠妊娠第18天，各組大鼠禁食水12 h 后經10%水合氯醛0.3 mL/100 mg 麻醉，待翻正反射消失后，調整小動物呼吸機(奧爾科特 ALC-V8，上海)潮氣量：2 mL，頻率50 次/min，吸呼比 1 ∶1，氣管切開后行機械通氣。后左股動脈穿刺置管(BD Insyte-W 24G，美國)測量股動脈壓力(SAP)，開胸后直視下經右心室穿入肺動脈并置管，測量肺動脈壓力(PAP)(換能器：Edwards，美國；監(jiān)護儀：Spacelabs-YZB/USA3926)。

6.統(tǒng)計學方法 實驗數據均通過SPSS 24.0 統(tǒng)計分析。正態(tài)分布計量資料以均數±標準差表示，超聲測量數據采用重復測量方差分析，成對比較采用LSD 法，股動脈和肺動脈壓力采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK 法。非正態(tài)分布資料采用中位數(M)及四分位數間距(P25，P75)表示。采用Kruskal-Wallis H 秩和檢驗，兩兩比較采用Nemenyi法。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1.動物存活情況 超聲各測量時點的動物存活情況如表1。在T18 時間點，麻醉后最后分組情況①A 組(n=9)，②B 組(n=7)，③C 組(n= 11)。除去B 組未妊娠的13 只，在整個研究過程中A 組死亡 9 只，B 組死亡 5 只，C 組亡 1 只。

圖1 肺動脈高壓大鼠超聲測量值； 圖2 母鼠子宮內胎鼠

表1 三組大鼠各測量時點的超聲指標值[，M(QR)]

表1 三組大鼠各測量時點的超聲指標值[，M(QR)]

時間 組別 PVV/(cm/s) AT/ms RVWT/mm RVEDD/mm PAID/mm AD/mm PAID/AD T0 A 組(n=17) 791±112 23.7±2.42 0.429±0.088 3.44±0.838 2.83±0.0754 2.58±0.678 1.10(1.02，1.16)B 組(n=23) 780±73.0 24.8±1.17 0.427±0.051 3.52±0.355 2.94±0.0775 2.67±0.0540 1.11(1.06，1.17)C 組(n=12) 870±97.9 27.3±4.61 0.415±0.053 2.84±0.449 2.62±0.0970 2.80±0.0600 0.97(0.96，1.09)T3 A 組(n=17) 776±72.0 22.8±2.84 0.487±0.102 3.57±0.601 2.96±0.0676 2.59±0.0791 1.16(1.10，1.24)B 組(n=10) 727±94.5 23.7±0.67 0.464±0.048 3.60±0.267 3.11±0.0962 2.76±0.0729 1.12(1.10，1.20)C 組(n=12) 875±74.2 26.9±4.08 0.424±0.046 2.90±0.366 2.68±0.0698 2.81±0.0560 0.99(0.91，1.01)T9 A 組(n=17) 661±90.7 19.5±2.25 0.699±0.215 3.98±0.547 3.00±0.106 2.58±0.0694 1.17(1.02，1.35)B 組(n=10) 688±95.5 21.8±1.34 0.497±0.078 3.66±0.346 3.05±0.119 2.84±0.110 1.12(0.97，1.27)C 組(n=12) 835±128 27.8±3.87 0.448±0.062 2.78±0.393 2.74±0.0637 2.81±0.0961 0.98(0.92，1.03)T15 A 組(n=14) 559±119 17.7±3.25 0.759±0.245 4.71±1.134 3.02±0.116 2.45±0.100 1.15(1.08，1.38)B 組(n=8) 695±82.4 21.4±2.59 0.567±0.155 3.75±0.548 3.26±0.077 2.95±0.0733 1.10(1.03，1.15)C 組(n=12) 872±84.8 27.6±5.86 0.402±0.070 2.91±0.400 2.68±0.0513 2.77±0.0994 0.96(0.87，1.06)

2.超聲心動圖測量數值及比較結果 超聲心動圖示肺動脈高壓組大鼠出現PVV 降低、AT 減少，PAID/AD、RVWT 和 RVEDD 增加，見圖1。妊娠合并肺動脈高壓組大鼠子宮內可見胎鼠(圖2)，證實建立妊娠合并肺動脈高壓模型。三組大鼠不同測量時點的超聲指標見表1，三組內各時間點成對比較結果見表2，各時點三組間成對比較見表3。

表2 三組內各時點間成對P 值比較的結果

表3 各時點三組間成對P 值比較的結果

3.三組內各測量時點比較的結果及變化趨勢A 組大鼠隨時間的進展，其PVV 明顯降低、AT 明顯減少、RVWT 和 RVEDD 明顯增加；B 組大鼠隨妊娠天數的增加，PVV 降低、AT 減少的程度較A 組有所緩解，其 T9 較 T0 的 PV 明顯降低，T9、T15 較 T0 的AT 明顯減少，T9 較 T3 的 AT 明顯減少，RVWT 和RVEDD 無明顯差異；C 組隨時間增加各測量值無明顯差異(表2)。各組隨時間進展超聲測量指標的變化趨勢不同(肺動脈瓣上流速F=10.565，P＜0.05；加速時間F=28.844，P＜0.05；右心室游離壁厚度F=6.651，P＜0.05，圖3～6)。

圖3 各組PVV 變化趨勢；圖4 各組AT 變化趨勢

圖5 各組PRVWT 變化趨勢；圖6 各組RVEDD 變化趨勢

4.各測量時點三組間比較的結果 T0 時間點，三組間 PVV、AT、RVWT、RVEDD 無明顯差異，而 A組、B 組較 C 組的 PAID/AD 明顯增加。T3 時間點，A 組較 C 組 PVV 降低、AT 延長、RVEDD 增加、PAID/AD 升高，B 組較 C 組 PVV 降低、RVEDD 增加、PAID/AD 升高。T9 時間點，A 組較 B 組RVEDD 增加，A 組較 C 組 PVV 降低，AT 延長、RVWT 增厚、RVEDD 增加、PAID/AD 升高，B 組較 C組的 PVV 降低、AT 延長、RVEDD 增加。T15 時間點，A 組較 B 組 PVV 降低、RVEDD 增加，A 組較 C組 PVV 降低，AT 延長、RVWT 增厚、RVEDD 增加、PAID/AD 升高，B 組較 C 組的 PVV 降低、AT 延長、PAID/AD 升高。

5.妊娠晚期股動脈和肺動脈壓力的比較 三組間的 SAP 無明顯差異。A 組(34.11±4.62)、B 組(28.71±4.19)較 C 組(18.45±3.01)PAP 明顯升高；且B 組較A 組明顯降低(圖7)。

討 論

由于妊娠合并肺動脈高壓患者的生理狀態(tài)不斷改變，對孕婦及胎兒造成嚴重影響，給臨床工作帶來了巨大挑戰(zhàn)[1-2]，而目前尚未有一套完整的處理流程，因此亟需大量針對此類疾病的研究。目前監(jiān)測肺動脈高壓的金標準是右心導管，但技術創(chuàng)傷大，實驗動物存活率低，不利于后續(xù)觀察，本研究首次采用多普勒超聲來評價妊娠對野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠右心功能的影響[3-4]，具有簡便、快捷及重復性好等優(yōu)勢[5-8]，證實超聲心動圖可以代替右心導管診斷和評估肺動脈高壓。

圖7 各組SAP 和PAP 比較

由于肺動脈高壓使右心后負荷加重，超聲心動圖常表現為PVV 降低，峰值前移，呈匕首狀，AT 縮短，DT 延長，RVWT 增厚，RVEDD 增加，PAID 增寬，嚴重者可出現室間隔左移，左右心射血分數減少，右心衰竭[8]。大鼠注射野百合堿后，超聲心動圖出現上述典型現象，且在妊娠第18 天，直視下經右心室穿刺進入肺動脈測壓顯示PAP 明顯增加，母鼠子宮內可見胎鼠，證實本研究成功建立妊娠合并肺動脈高壓模型。

本研究發(fā)現野百合堿使大鼠右心功能不斷惡化，而在妊娠后，惡化程度減輕，包括RVWT(T9)、PVV(T15)、RVEDD(T15)的惡化較單純肺高壓組明顯減輕。在妊娠第18 天，妊娠合并肺動脈高壓大鼠的PAP 較肺高壓組降低，右心后負荷減少，導致右心功能惡化減輕，且肺動脈高壓組病死率較妊娠合并肺高壓組更高，證實妊娠過程對PAH 存在保護作用。在妊娠期，母體內雌激素不斷增加，雌激素可通過受體啟動eNOS 酶表達導致NO 合成酶增加、抑制內皮素ET-1 mRNA 的表達、促進前列環(huán)素PGI2的增加，保護和調節(jié)肺血管內皮細胞舒縮功能、促進血管擴張及抑制平滑肌細胞增殖，改善肺動脈高壓中的血流動力學和氣體交換[9]。故本研究結果可能與孕期雌激素的增長有關。目前研究表明外源性雌激素對肺動脈高壓有保護作用。動物實驗證明雌激素能抑制 PAH 的進展，對低氧或 MCT 誘導的PAH 均能起到緩解作用，改善PAH 嚴重程度，緩解右心室肥厚[10-12]，卵巢切除術后會使PAH 惡化[13]，且Olsson 等[14]發(fā)現雌激素可以增加右心室射血分數來治療肺動脈高壓。

Lahm 等[15]發(fā)現雌激素也能促進PAH 的發(fā)生和進展，流行病學研究發(fā)現女性PAH 患病率比男性高，但女性患者預后較好，雌激素對肺血管的保護作用與肺動脈高壓患者中女性多發(fā)相矛盾[14.16]?？赡苁窃擃惢颊叽萍に厥荏w不足或者細胞內信號傳導異常，減弱了雌激素對肺血管系統(tǒng)的保護作用，也可能與血栓形成有關。在妊娠期，血中雌激素的微小波動也能對血管功能產生巨大影響，雌激素對肺血管的影響較復雜且尚不明確[17]。

PAH 患者在妊娠后，出現血容量增加、心輸出量增加、血管阻力降低等的生理改變[18]，大量臨床資料統(tǒng)計顯示，死亡事件多發(fā)生于終止妊娠之后，分娩后的第一周內和直到產后6 周被認為是臨床上最危險的時間段，比妊娠期病死率高[17]，是否與分娩后雌激素水平下降有關不得而知。本研究結果的出現可能是在早中期雌激素的保護作用可以拮抗妊娠對心臟的沖擊作用，而在晚期雌激素的保護作用不足以拮抗心臟負荷的加重。

本研究的局限性是注射野百合堿后隨時間進展大鼠出現嚴重的肺高壓，麻醉后體循環(huán)壓力降低，低于肺循環(huán)壓力，出現肺動脈高壓危象甚至右心衰竭[17]，超聲觀察可見右心室顯著變大，室間隔向左移動，左右心室射血減少，導致大鼠出現死亡。由于個體差異，大鼠的心率對麻醉藥的反應不同導致注射野百合堿后大鼠的DT、AS 和DS 與空白組無明顯差異。在之后的實驗過程中，應選擇合適的麻醉藥及注意監(jiān)測麻醉深度，減少大鼠病死率。

綜上，妊娠過程對PAH 存在保護作用，可以一定程度上緩解野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠右心功能的惡化，為進一步研究雌激素對妊娠合并肺動脈高壓患者的保護作用及雌激素的替代療法奠定基礎。