馬齒莧對去卵巢小鼠骨代謝生化指標的影響

李賽玉,曲揚,萬芙,張穎

(遼寧中醫(yī)藥大學藥學院，遼寧 大連 116600)

馬齒莧(PortulacaoleraceaL.) 為馬齒莧科馬齒莧屬一年生草本植物，資源豐富，在我國各地均有分布?，F(xiàn)代藥理學研究表明馬齒莧具有抗菌、抗衰老、抗炎、抗氧化等多種藥理作用[1]。馬齒莧既可藥用，又可食用，是我國衛(wèi)健委劃定的藥食同源的野生植物之一。

隨著中國人口老齡化，老年人常見疾病骨質疏松癥(osteoporosis，OP)引起廣泛關注，中國60歲以上人群骨質疏松總體患病率為36%[2]。OP是一種全身代謝性疾病，主要特征骨量減少，骨組織顯微結構退化，可導致骨脆性增加及骨折危險性增加。雌激素與骨骼代謝密切相關，絕經后婦女卵巢功能衰退，體內雌激素水平低落，骨吸收與形成不平衡呈脫耦聯(lián)狀態(tài)，即骨質吸收增加、骨質形成減少，導致骨質疏松[3]。目前市面上的抗骨質疏松藥物雖然具有確切的預防或者治療骨質疏松的作用，但是長期服用經濟成本較高，而且可能產生副作用[4-5]。因此，迫切需要尋找安全、有效、價格合理的防治OP的藥物，更好地克服現(xiàn)有藥物存在的問題。

近期有研究證實氧化應激[6-8]是絕經后骨質疏松癥的重要發(fā)病機制，婦女絕經后受衰老和雌激素不足等因素的共同影響，體內氧化應激水平增高，使骨重建失衡，導致骨質疏松發(fā)病。有研究表明馬齒莧醇浸出物對脂多糖(LPS)誘導的骨丟失起到保護作用[1]。馬齒莧中總黃酮[9-11]及總多糖[12-14]具有抗氧化及清除自由基的作用。本實驗采用卵巢切除手術(OVX)模型，研究馬齒莧對去卵巢小鼠骨代謝的影響及其可能的機制，為馬齒莧防治骨丟失的臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境 昆明小鼠，8周齡，26～30 g，雌性，SPF級，由遼寧長生生物技術股份有限公司提供，許可證編號：SCXK(遼)2015-0001。飼養(yǎng)環(huán)境：室溫(22±1)℃，相對濕度為30%～65% RH，光照為150～200 Lx，每12 h明暗交替。

1.2 藥品與試劑 馬齒莧(東營百佳益中藥飲片有限公司，批號：151204，產地安徽)；α-硫辛酸(LA，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號：C1604033)；葡萄糖(天津市大茂化學試劑廠，生產許可證號：XK13-201-00110)；蘆丁(成都普菲德生物技術有限公司，批號：150108)；其余試劑均為分析純；堿性磷酸酶(ALP，批號：20171120)、血清鈣(Ca，批號：20171120)、磷(P，批號：20171120)、總膽固醇(TCHO，批號：20171120)、丙二醛(MDA，批號：20180110)、超氧化物歧化酶(SOD，批號：20180105)、總蛋白(TP，批號：20180110)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.3 主要儀器 智能高速冷凍離心機(湖南赫西儀器裝備有限公司，型號：3H16RI)；酶標儀(上海科華實驗系統(tǒng)有限公司，型號：ST-360)；恒溫搖床(上海?，攲嶒炘O備有限公司，型號：KYC 1102 Incubator Shaker)；石蠟切片機(北京中西遠大科技有限公司，型號：CN61M/LS-2055)；生物顯微鏡(日本Olympus公司，型號：BX51)。

2 方法

2.1 馬齒莧水提物(water extract ofPortulacaoleraceaL.，WEPO)的制備 按藥液比1∶40超聲提取，提取功率100 W，提取時間30 min。提取完成后，將馬齒莧水提液分別濃縮為0.2 g·mL-1(低劑量)與2 g·mL-1(高劑量)(折合成生藥材的濃度)，備用。

2.2 WEPO中總黃酮和總多糖的含量測定

2.2.1 WEPO中總黃酮的含量測定 以蘆丁作為對照，采用硝酸鋁顯色、紫外-可見分光光度法測定總黃酮的含量。分別將蘆丁的濃度和顯色后的吸光度作為橫軸和縱軸，得到標準曲線Y=6.412 5X-0.039 4(r=0.999 5)。將WEPO以該法測定，得到其黃酮含量分別為0.29 g·L-1和2.9 g·L-1，折合成生藥材含量為1.45 mg·g-1。

2.2.2 WEPO中總多糖的含量測定 以葡萄糖作為對照，采用苯酚-硫酸法測定總多糖的含量。分別將葡萄糖的濃度和顯色后的吸光度作為橫軸和縱軸，得到標準曲線Y=26.15X+0.000 8(r=0.999 9)。WEPO經Savage法除蛋白后以該法測定，得到其多糖含量分別為0.262 g·L-1和2.62 g·L-1，折合成生藥材含量為1.31 mg·g-1。

2.3 實驗動物分組及處理 小鼠適應性飼養(yǎng)1周后，按體重隨機選出10只小鼠假手術(SHAM)和其余40只接受卵巢切除手術(OVX)。OVX小鼠20%烏拉坦[0.13 mL·(10 g)-1]腹腔注射麻醉，無菌條件下經腰背部雙側切口，找到子宮，完整切除雙側卵巢，切口縫合。術后連續(xù)3 d灌胃羅紅霉素0.003 9 mg·kg-1，防止傷口感染。術后恢復5 d后進行治療。將小鼠隨機分為5組，每組10只，分別為SHAM組(生理鹽水)、模型(OVX)組(生理鹽水)、陽性藥組(LA，0.078 g·kg-1)、WEPO低劑量組(生藥2 g·kg-1)、WEPO高劑量組(生藥20 g·kg-1)，各給藥組灌胃給予相應劑量的藥物溶液，0.1 mL·kg-1，每天1次，連續(xù)7周。期間每隔2 d稱重1次并記錄。7周后小鼠摘眼球采血，3 000 rpm離心10 min，分離血清；隨后脫臼處死，摘除胸腺、子宮與脾稱重并記錄；取肝臟用生理鹽水按1∶9制成10%肝勻漿，3 000 rpm離心10 min，取上層清液。將待測生物樣本于-80 ℃保存待測。取兩側股骨，其中一側股骨放于10%福爾馬林固定，另一側股骨稱重并用游標卡尺測量長度。

2.4 指標檢測

2.4.1 生化指標及抗氧化指標的測定 血清ALP、Ca、P、TCHO，肝勻漿MDA、SOD、TP按試劑盒說明測定。

2.4.2 骨組織學分析 骨組織經脫鈣、脫水、透明、浸蠟包埋、切片、脫蠟、染色、透明、封固后，光學顯微鏡觀察。

3 結果

3.1 WEPO對小鼠體重增長率的影響 實驗7周，OVX組小鼠體重增長率顯著高于SHAM組小鼠(P<0.05)。與OVX組比較，WEPO高劑量組的小鼠體重增長率顯著降低(P<0.05)，WEPO低劑量組、LA組小鼠與OVX組相比體重增長率有所降低，但無統(tǒng)計學差異(P>0.05)，結果見表1。

表1 小鼠體重增長率

注：與SHAM組相比，#P<0.05；與OVX組相比，*P<0.05

3.2 WEPO對OVX小鼠子宮、脾、胸腺指數(shù)及骨重和骨長的影響 與OVX組比較，WEPO低劑量組和高劑量組小鼠子宮的重量顯著增加(P<0.001)、骨長顯著增加(P<0.05)；與OVX組相比，WEPO高劑量組小鼠胸腺指數(shù)顯著降低(P<0.001)；WEPO能夠改善OVX小鼠的骨重，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，結果見表2。

表2 小鼠子宮、胸腺、脾臟指數(shù)及骨重與骨長

注：與SHAM組相比，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001；與OVX組相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3.3 WEPO對血清生化指標的影響 表3為WEPO治療7周后不同組動物血清生化指標的結果。與SHAM組相比，OVX組小鼠ALP顯著升高，用WEPO治療后ALP均降低，WEPO高劑量組顯著降低(P<0.05)。與SHAM組相比，OVX組血清Ca水平顯著升高(P<0.05)，用WEPO治療后Ca水平略有降低，低劑量組的差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與SHAM組相比，OVX組血清P水平升高，與OVX組相比，用WEPO治療后血清P水平降低，低劑量組有顯著性差異(P<0.01)。與SHAM組相比，OVX組小鼠血清TCHO水平顯著升高(P<0.05)，與OVX組相比，用WEPO治療后血清TCHO水平呈下降的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

3.4 WEPO對抗氧化指標的影響 與SHAM組相比，OVX組肝組織中SOD水平顯著降低(P<0.01)，用LA或WEPO治療后小鼠肝組織中SOD水平均增加，且WEPO低劑量組與OVX組相比有顯著性差異(P<0.01)。OVX組MDA含量較SHAM組低，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與OVX組相比，WEPO治療后MDA水平均降低，且WEPO高劑量組與OVX組相比有顯著性差異(P<0.01)，結果見表4。

3.5 WEPO對骨微結構的影響 與SHAM組相比OVX可見透明軟骨膜表面損壞、不光滑，軟骨細胞排列紊亂、有的部位可見大量浸潤的炎性細胞；與OVX組相比，在WEPO治療后可見透明軟骨膜修復較好，表面較光滑，軟骨細胞排列基本整齊，可見部分炎性細胞。

表3 血清ALP、Ca、P與TCHO水平的變化

注：與SHAM組相比，#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001；與OVX組相比，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

表4 肝勻漿SOD、MDA含量

注：與SHAM組相比，##P<0.01；與OVX組相比，**P<0.01

圖1 骨微結構的變化[蘇木精-伊紅(HE)染色，×20]

3 討論

卵巢功能退化，體內雌激素水平下降，雌激素缺乏是絕經后骨組織損傷及骨質疏松主要誘因，多表現(xiàn)為骨量下降、骨脆性增加、骨代謝指標的變化[15]。雌性小鼠的卵巢被切除以后，能夠較準確地模擬婦女絕經后高轉換型骨質疏松的骨丟失狀態(tài)以及對各種干預因素的反應[16]。本實驗采用去卵巢雌性小鼠模型，能夠準確反映馬齒莧提取液對雌激素缺失狀態(tài)下改善骨代謝的作用。

小鼠去卵巢后，由于雌激素缺乏直接影響子宮的重量，子宮萎縮及體重(BW)增加被用作OVX成功的證據(jù)[17]。在本研究中，OVX小鼠顯示BW增加和子宮重量減少，證實手術成功。在WEPO治療后，BW降低，WEPO卻能維持正常子宮重量，提示WEPO能拮抗去勢造成的子宮質量減輕[18]。OVX也誘導胸腺T和B細胞的增加，導致胸腺和脾臟重量增加，進而導致更多的骨丟失[19]。本次實驗發(fā)現(xiàn)用WEPO治療的OVX小鼠胸腺重量減少。另一項研究報道，OVX小鼠的骨量和長度低于假手術小鼠[20]。在本研究中也證實了WEPO能夠改善OVX小鼠骨骼的重量和長度。

骨是人體中鈣、磷的最大儲庫，通過成骨與溶骨作用不斷與細胞外液進行鈣磷交換，以維持血鈣與血磷的平衡[21-23]。骨轉換標記已被廣泛用作測量藥物對骨重塑的影響的工具[24]。 OVX小鼠的骨轉換增加[25]。本實驗中，小鼠去卵巢后，血清鈣磷水平增加，用WEPO 治療后有所降低，可提示WEPO可抑制骨吸收，降低骨質疏松小鼠骨轉換率。ALP是參與骨代謝的重要蛋白質，通過分解磷酸酯的無機磷促進基質礦化，骨形成與ALP的活性高度相關，ALP是反映成骨細胞的重要標志[21-23]。實驗中OVX組小鼠血清ALP活性顯著升高，提示去卵巢小鼠骨代謝呈高轉換狀態(tài)，一般認為這種血清堿性磷酸酶活性的升高是伴隨著骨吸收亢進而出現(xiàn)的代償性骨形成增強引起的[16]。雌激素可以調節(jié)膽固醇的代謝和沉積，卵巢切除后，雌激素水平下降，脂質代謝紊亂，血漿總膽固醇升高[26-27]。用WEPO治療7周后降低了血清Ca、P和ALP水平，提示WEPO可以降低OVX誘導的高骨轉換率。

研究表明，雌激素水平下降，體內活性氧增加，可能是引起絕經后骨質疏松癥的重要原因之一[28]。馬齒莧總黃酮對氧自由基和羥基自由基都有良好的清除能力[9-11]，另外有研究表明馬齒莧總多糖具有顯著的體外抗氧化活性[12-14]。MDA是氧自由基引起脂質過氧化的終末代謝產物，其含量反映了脂質過氧化程度并間接反映氧自由基含量。在生理情況下，自由基的產生和清除過程維持著動態(tài)平衡。如果自由基產生過多或清除不足，細胞就會受到損傷甚至死亡[26]。SOD主要由肝細胞產生，存在于肝細胞胞漿和線粒體，是重要的超氧陰離子清除劑，可減緩、抵御自由基損害，保護細胞。本次實驗發(fā)現(xiàn)WEPO可以有效調節(jié)OVX小鼠肝臟中MDA及SOD水平的變化， WEPO可能改善去卵巢小鼠的氧化應激狀態(tài)，進而調節(jié)骨代謝的動態(tài)平衡。

綜上所述，WEPO能夠改善骨代謝水平及機體的氧化應激水平，其效果與陽性藥組相似，這些證據(jù)可提示馬齒莧可能是通過改善氧化應激來改善骨代謝的。在所測定的指標中BW、ALP和MDA等指標呈劑量相關性，而血清Ca、P和SOD等指標中則是低劑量組優(yōu)于高劑量組，其原因可能是由于給藥劑量的不同，藥物吸收程度不同，或者是由于藥物濃度不同，藥物成分間的相互影響程度不同[29]。馬齒莧來源廣，毒副作用小，價格便宜，具有廣闊的開發(fā)前景，但是其成分復雜，其作用機制可能與多種因素有關，確切的作用機制還需要進一步研究。