痹痛合劑對佐劑性關節(jié)炎大鼠滑膜組織的影響

董莉莉，吳素玲，馬春華，隆紅艷，沙明慧

(南京中醫(yī)藥大學實驗動物中心，江蘇 南京 210000)

類風濕關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種自身免疫性疾病，其主要特征為慢性滑膜炎癥,對稱性多關節(jié)慢性炎癥是其主要表現[1]。RA的發(fā)病機制目前來說基本達成了共識：RA患者可以誘導T、B細胞活化、局部浸潤，產生多種炎性介質、細胞因子，引起關節(jié)滑膜炎癥，出現慢性炎癥癥狀。慢性炎癥反應在RA的發(fā)展中起重要作用，其中，核因子-κB (NF-κB)的活化可以促進多種促炎癥基因轉錄[2],包括:腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-2等等，導致RA炎癥反應及結構破壞。

類風濕關節(jié)炎屬于中醫(yī)“尪痹”范疇，其致病因素為風寒濕邪，風、寒、濕相互交結成為本病的病理關鍵，“尪痹”多從風寒濕論治。痹痛合劑(蘇藥制字Z04000864)是江蘇省南京市中醫(yī)院的院內制劑。綜觀全方,組方精當,可使風濕除、肝腎強、筋骨壯而痹痛愈。臨床觀察驗證了本方可有效地改善關節(jié)炎患者關節(jié)疼痛和活動受限的臨床表現[4],是治療類風濕關節(jié)炎癥的有效方藥。且以往研究顯示，痹痛合劑能夠延緩關節(jié)炎大鼠關節(jié)軟骨的退變，提高關節(jié)軟骨細胞中Bc1-2基因的表達[5]，抑制炎癥因子IL-1的表達[6]。本課題組通過佐劑性關節(jié)炎大鼠模型，觀察不同濃度的痹痛合劑對佐劑性關節(jié)炎大鼠血清中相關炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達的影響，探討痹痛合劑對于類風濕關節(jié)炎的作用機制和靶點，為痹痛合劑治療類風濕關節(jié)炎提供實驗依據。

1 材料

1.1 動物 SPF級SD大鼠40只，體重：200～220 g，由南京市中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供，許可證編號：SYXK(蘇)2014-0001。所有動物于室溫(22±1)℃，空氣濕度40%～50%，晝夜交替時間12 h條件下普通飼料喂養(yǎng)，自由飲水。適應性喂養(yǎng)1周。動物飼養(yǎng)按照國家實驗動物管理條例進行。

1.2 藥物與試劑 痹痛合劑(蘇藥制字Z04000864，每瓶250 mL，南京市中醫(yī)院)；雙氯芬酸鈉片(中國藥科大學制藥有限公司，國藥準字H10960217，每片50 mg)；弗式完全佐劑(南京納晟生物科技有限公司，批號:ex210804)；蒸餾水(實驗室自制)；生理鹽水(哈爾濱三聯藥業(yè)股份有限公司，批號：150920D02)；蘇木精水溶液、二甲苯、伊紅乙醇染色液。大鼠IL-1β酶聯免疫吸附測定試劑盒(批號：E-EL-R0012c)、大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)酶聯免疫吸附測定試劑盒(批號：E-EL-R0019c)、大鼠白介素6(IL-6)酶聯免疫吸附測定試劑盒(批號：E-EL-R0015c)均購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.3 儀器 全波長酶標儀(Bio-Tek Epoch)；熒光顯微鏡(奧林巴斯 BX43)；垂直電泳系統(Bio-Rad Mini Protean Tetra)；轉膜印跡系統(Bio-Rad Mini Trans-Blot)；低溫冰箱(海爾 DW-25L262)；臺式離心機(美國貝爾曼)；超純水系統(美國Thermo LabTower)；全自動高壓滅菌鍋(日本 Tomy SX-500)；微量分析天平(瑞士梅特勒 IKA T10)。

2 方法

2.1 動物分組 40只SD大鼠隨機分成5組:空白組、模型組、雙氯芬酸鈉組、痹痛合劑高劑量組、痹痛合劑低劑量組，每組8只。

2.2 模型制備 0.2 mL弗氏完全佐劑皮內注射大鼠右后足趾，經過變態(tài)反應后形成佐劑性關節(jié)炎大鼠模型，正常組注射等體積的生理鹽水在相同部位注射。

2.3 給藥方法 造模成功后，計算給藥劑量，痹痛合劑成人劑量為869 mg·kg-1，雙氯芬酸鈉成人劑量為1.66 mg·kg-1，以“人和動物體表面積折算的等效劑量比率表”為標準，痹痛合劑大鼠劑量為536 mg·(100 g)-1，雙氯芬酸鈉組每天劑量為0.5 mg·(100 g)-1，故痹痛合劑高劑量組每天劑量為536 mg·(100 g)-1痹痛合劑低劑量組每天劑量為268 mg·(100 g)-1痹痛合劑，空白組、模型組給予等體積蒸餾水。每組大鼠根據設定劑量連續(xù)灌胃給藥21 d。給藥21 d后，腹腔注射麻醉藥劑，頸動脈放血處死大鼠。

2.4 觀察指標及方法

2.4.1 關節(jié)滑膜組織蘇木素-伊紅染液染色(HE染色) 于大鼠的右后肢正中縱行切開皮膚，分離肌肉露出膝蓋骨，繼續(xù)向下分離便能看見滑膜組織，手術刀分離關節(jié)囊的滑膜層、纖維層，取出滑膜層組織。取右后肢關節(jié)滑膜組織固定，在甲醛中過夜，固定包埋于石蠟后切成 4 mm 厚的切片。用二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水，HE染色；蓋玻片覆蓋在載玻片上封片，置于光學顯微鏡下觀察并記錄病變。

2.4.2 ELISA試劑盒檢測大鼠滑膜組織中的炎癥因子的含量 取大鼠關節(jié)滑膜組織，加入一定量磷酸鹽緩沖液，3 500 rpm離心15 min，取其上清。檢測關節(jié)滑膜組織中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

2.4.3 Western blot分析 采用Western blot檢測大鼠NF-κB信號通路相關蛋白IKBa(1∶1 000)、MyD88(1∶1 000)、P65(1∶1 000)、TLR4(1∶1 000)、p-IκBα(1∶1 000)、和 P-P65(1∶1 000)表達。關節(jié)滑膜組織總蛋白用RIPA裂解液進行提取，12 000 rpm條件下離心15 min，收集上清。采用BCA試劑盒進行蛋白定量。蛋白樣品置于SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中直至樣品到達分離膠的底部，并將其轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。轉膜完畢后，將條帶浸入5%脫脂牛奶中封閉2 h。封閉結束后將PVDF膜分別浸入一抗中于4 ℃ 孵育過夜。第2天棄一抗加入第二抗體于搖床室溫孵育2 h。二抗孵育結束后，棄抗體，取出PVDF膜用TBST清洗3次。使用凝膠成像系統進行曝光并用凝膠掃描成像系統掃描條帶分析各條帶灰度值。

3 結果

3.1 大鼠關節(jié)滑膜組織病理學改變 空白組：軟骨表面光滑，軟骨細胞排列整齊，且四層結構清晰可辨，潮線完整，軟骨基質染色為粉紅色，著色均勻，未見炎性細胞浸潤及血管增生現象；模型組：關節(jié)軟骨破壞最為嚴重，軟骨表面粗糙糜爛不整，形成缺損區(qū)，可見大量的炎性細胞浸潤；陽性藥組：細胞四層結構基本清晰，潮線基本完整；痹痛合劑低劑量組：細胞四層結構基本清晰，有少許軟骨細胞存在輕度變性；痹痛合劑高劑量組：潮線可見基本完整，關節(jié)軟骨存在少許炎性細胞浸潤，關節(jié)軟骨細胞具有輕度變性，表面仍有粗糙現象，結果見圖1。

A.空白組;B.模型組;C.陽性藥組;D.痹痛合劑低劑量組;E.痹痛合劑高劑量組圖1 大鼠關節(jié)滑膜組織病理

3.2 大鼠關節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平 與空白組相比，模型組大鼠關節(jié)滑膜組織中IL-1β、 IL-6 和 TNF-α等炎性細胞因子含量顯著增加。與模型組相比，陽性藥組、痹痛合劑低劑量組、痹痛合劑高劑量組關節(jié)滑膜組織中IL-1β、IL-6 和 TNF-α等炎性細胞因子含量顯著降低(P<0.05)。表明痹痛合劑可以通過減少炎癥因子的表達緩解大鼠關節(jié)滑膜炎癥的癥狀，結果見表1。

表1 佐劑性關節(jié)炎大鼠血清中 IL-1β、IL-6、TNF-α的表達水平(pg·mL-1,n=8)

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，△P<0.05；與陽性藥組比較，☆P<0.05；與合劑低劑量組比較，▲P<0.05

3.3 采用Western blot檢測痹痛合劑對NF-κB信號通路相關蛋白的改善作用。如圖2～3所示，與空白對照組相比，模型組大鼠IKBa、MyD88、P65、TLR4、p-IκBα和 P-P65的表達上調，在痹痛合劑低劑量組和痹痛合劑高劑量組治療后，這些蛋白的表達顯著下調，結果表明，痹痛合劑是通過NF-κB信號通路體現其對關節(jié)炎大鼠的治療作用。

A.空白組；B.模型組；C.陽性藥組；D.痹痛合劑低劑量組；E.痹痛合劑高劑量組圖2 痹痛合劑對關節(jié)炎大鼠關節(jié)滑膜組織NF-κB信號通路相關蛋白表達的影響

4 討論

類風濕關節(jié)炎病變主要累及滑膜組織，主要病理特點是滑膜細胞增生，炎性細胞浸潤。研究發(fā)現，多種炎性細胞因子如 IL-1β、干擾素(IFN) -γ、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-17等參與了RA的病理過程，此類細胞因子是導致軟骨和骨損傷，介導RA發(fā)生及發(fā)展的重要因素。因此，抑制、阻斷這類細胞因子及其受體是研究治療RA藥物的一個方向[7-8]。

痹痛合劑是經過我院研究開發(fā)的院內制劑。本方以牛膝、狗脊為君,治以強筋骨、補肝腎,懷牛膝是為引經藥;防風、獨活祛除風寒濕邪;徐長卿、威靈仙舒筋通絡;雞血藤、土鱉蟲、桂枝活血通絡,通達四肢關節(jié);川草烏(制)散寒止痛;白術(炒)、茯苓健脾利濕;虎杖清熱活血解毒,同時防諸藥辛燥太過。臨床觀察驗證，本方可有效地改善患者關節(jié)疼痛和活動受限的臨床表現,是治療RA的有效方藥[4]。

本課題觀察了痹痛合劑對RA大鼠滑膜組織炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和NF-кB表達的影響，觀察發(fā)現造模后，RA大鼠滑膜組織中 IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-кB的表達量均比正常組明顯增高。痹痛合劑高低劑量組和雙氯芬酸鈉組中IL-1β、IL-6、TNF-α、NF-кB的表達量均有所降低，且痹痛合劑高劑量組較雙氯芬酸鈉組在降低 IL-6，NF-кB表達方面更為顯著。實驗的結果說明痹痛合劑可通過降低RA大鼠關節(jié)滑膜組織炎癥因子的表達，來有效減輕RA大鼠滑膜組織的炎癥反應。

C.空白組；M.模型組；Y.陽性藥組；D.痹痛合劑低劑量組；G.痹痛合劑高劑量組圖3 佐劑性關節(jié)炎大鼠血清中P-NF-кBP65/NF-кBP65、P-IkBa/IKBa、TLR4/GAPDH、MyD88/GAPDH的表達 注：與空白組比較，*P<0.05;與空白組和治療組比較，**P<0.05；與空白組比較，##P<0.05，治療組之間比較無統計學差異