雙酶水解雞副產物制備蛋白胨工藝的優(yōu)化

潘風光 侯力簫 王 瑩 劉靜波

（吉林大學食品科學與工程學院營養(yǎng)與功能食品研究室 長春130062）

我國是肉雞生產大國，據統計，2014年我國肉雞產量已高達1 380 萬t，占到全球總產量的15%以上[1-2]。在這種大量生產的情況下，產生了大量的以頭、皮、腿、腳、骨頭、內臟、羽毛、糞便等形式的固體廢棄物，統稱為雞副產物[3]。雞副產物中含有大量的營養(yǎng)因子，然而目前利用率較低，多數被棄于環(huán)境中，對雞副產物進行深入研究，制備具有高附加值的產品，不但能夠降低廢棄物不當處理造成的環(huán)境污染，還能提高副產物綜合利用價值，拓展其應用領域[4-5]。

蛋白胨是蛋白質經水解分離純化后得到的一組混合物，可供作細菌培養(yǎng)基用，提供微生物生長過程中的主要N 源、C 源及生長因子[6]。其產品在醫(yī)藥行業(yè)、發(fā)酵工業(yè)、生物化工等領域均有較大的應用價值[7-8]，同時也是大米、面粉、醬油及各種保健食品中蛋白質的添加劑。目前我國關于蛋白胨產品的研究較少，大部分集中在植物蛋白胨的研究，對動物副產物加工利用領域研究不足，而用雞副產物加工制備蛋白胨的研究更少。大量高營養(yǎng)的雞副產物為蛋白胨的制備提供了豐富的原料來源。

在已有研究的基礎上，采用雙酶水解方法，通過二次通用旋轉組合設計優(yōu)化雞副產物制備蛋白胨工藝，減少試驗次數[9-10]，旨在提高資源利用率，為微生物生長提供所需的營養(yǎng)物質。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

脫脂雞副產物（干重比雞骨∶雞內臟=3∶1），其中雞內臟干重比為雞皮∶雞肝∶雞胗=1∶1∶1，吉林德惠食品有限公司；胰蛋白酶、堿性蛋白酶，美國Sigma 公司；標準蛋白胨，北京奧博星生物技術有限公司；酪素，上海永瑞生物科技有限公司；L-酪氨酸，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；氫氧化鈉、鹽酸、甲醛、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、碘化鉀、福林酚、三氯乙酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉等均為分析純級。

JJ-1 型精密定時電動攪拌器，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；STARTEER 300 型奧豪斯pH 計，上海泉佰儀器有限公司；CP124C 型電子分析天平，奧豪斯儀器有限公司；UV-2550 型紫外-可見分光光度計，日本島津儀器有限公司；DK-8D 型數顯恒溫水浴鍋，江蘇金壇榮華儀器制造有限公司；CR20B2 型高速冷凍離心機，日本Hitachi 公司；DW-86L388A 型超低溫冰箱，青島海爾特種電器有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 電位滴定法測定氨基態(tài)氮 按照GB/T 5009.39-2003 方法，采用電位滴定法測定氨基態(tài)氮。

1.2.2 水解度的測定

1.2.3 蛋白胨含量的測定 采用雙縮脲法。

1.2.3.1 試劑的配制

1） 標準蛋白胨溶液 精確稱取0.5 g 干燥至恒重的細菌學蛋白胨，用30%NaOH 溶液0.5 mL和蒸餾水3 mL 使其充分溶解，加水定容100 mL，即5 mg/mL 的標準蛋白胨溶液[11]。

2）雙縮脲試劑 溶解4.5 g 酒石酸鉀鈉于20 mL 0.2 mol/L NaOH 溶液中，加0.5 g 硫酸銅（Cu-SO4·5H2O），待溶解后，加入0.5 g 碘化鉀，用0.2 mol/L NaOH 溶液稀釋至100 mL，密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 操作步驟

1） 標準曲線的繪制 分別取標準蛋白胨溶液0，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5，1.8，2.1，2.4，2.7，3.0 mL 于11 只試管中，蒸餾水補足至3.0 mL，分別加入3.0 mL 自制的雙縮脲試劑后混合均勻。以零管作空白，在540 nm 處比色測定，記錄吸光度。每支試管做平行試驗3 次。

2） 樣品測定 將樣品稀釋至蛋白胨含量約為4～5 mg/mL，取稀釋樣品1 mL，用蒸餾水補足至3.0 mL，加入3.0 mL 雙縮脲試劑，混勻，用蒸餾水作空白，于540 nm 處進行比色測定[12]，記錄吸光度。

注意：1）、2）步驟在30 min 內完成，否則會產生霧狀沉淀。

1.2.3.3 計算 由標準曲線得出稀釋后樣品的質量濃度為C（mg/mL），原樣品中蛋白胨質量濃度為Cpept，則：

Cpept=C×稀釋倍數

式中：Cpept——水解液中蛋白胨含量，mg/mL；V——水解液體積，mL；M——水解液中原料干物質質量，g。

1.2.4 蛋白酶活力的測定 采用Folin-酚法。

1.2.4.1 福林試劑稀釋液的制備 將福林試劑與蒸餾水按照1∶2 的比例混合均勻，即福林試劑稀釋液。

1.2.4.2 L-酪氨酸標準曲線的繪制

1） 100 μg/mL L-酪氨酸標準溶液配制方法根據福林法測酶活，按照文獻[12]的方法配制標準溶液，具體操作見表1。繪制出L-酪氨酸標準曲線，根據所得線性方程計算吸光度常數K 值。其中K 值應在95～100 范圍。

1.2.4.3 蛋白酶活力的測定 分別稱取1～2 g 蛋白酶，用少量對應緩沖液溶解后，測定酶活力。按表2操作步驟進行，最后在波長680 nm 處測定吸光度值。

表1 L-酪氨酸標準溶液的配制Table 1 Preparation of L-tyrosine standard solution

表2 酶活力測定加樣順序Table 2 The sample order of enzyme activity determination

1.2.5 雙酶水解制備蛋白胨工藝研究 對雞副產物按照超聲波輔助堿法提取蛋白[13]。稱取定量的蛋白提取物，按照液固比4∶1 加入蒸餾水使其浸泡充分，用pH 計測定pH，加入6 000 U/g 的蛋白酶使其充分酶解，用0.1 mol/L NaOH 溶液及0.1 mol/L HCl 調節(jié)溶液的pH 值。結束后將溶液置于90 ℃水浴中滅酶10 min[14]。所得酶解液在4 000 r/min 離心10 min，取上清液測定其水解度及蛋白胨得率。接著，在40 ℃，以30 r/min 的轉速將水解上清液旋轉蒸發(fā)濃縮，之后，將濃縮液真空冷凍干燥，過120 目篩，得到蛋白胨粉末。

1.2.6 二次通用旋轉組合優(yōu)化雙酶水解工藝設計根據單因素試驗結果，以蛋白胨得率為響應值，選擇雙酶配比（堿性蛋白酶：胰蛋白酶）（X1）、酶解溫度（X2）、酶解pH（X3）、酶解時間（X4）4 個試驗因素，進行四元（1/2 實施）二次通用旋轉組合試驗設計，試驗方案如表3所示，用DPS 分析軟件優(yōu)化最佳酶解條件。

表3 四元二次通用旋轉組合設計因素水平表Table 3 Factors and levels of quadratic general rotary unitized design

2 結果與分析

2.1 酶活力測定結果

2.1.1 酶活力測定標準曲線 由圖1可知L-酪氨酸標準曲線的回歸方程為y=0.0102x+0.0016，可計算出當OD680值為1 時酪氨酸的量，即吸光度常數K 值，K=97.88。

本試驗所用蛋白酶實際酶活力計算方法如下：

式中：X——蛋白酶實際酶活力，U/g；A——樣品平行試驗的平均吸光度；K——吸光度常數；4——反應試劑總體積，mL；n——稀釋倍數；10——反應時間，min。

2.1.2 兩種蛋白酶實際酶活力 見表4。

2.2 水解液中蛋白胨含量測定標準曲線

以蛋白胨濃度為橫坐標，波長540 nm 處的吸光度值為縱坐標，繪制出標準曲線，如圖2所示。根據方程得到蛋白胨含量計算公式為：y=0.0569x×0.0034（R2=0.9992）。

2.3 四元二次通用旋轉組合設計分析結果

2.3.1 數學模型的建立與顯著性檢驗 雙酶水解制備蛋白胨的四元（1/2 實施）二次通用旋轉組合試驗設計及結果如表5所示，方差分析見表6。

圖1 L-酪氨酸標準曲線Fig.1 Standard curve of L-tyrosine

表4 兩種蛋白酶的實際酶活力Table 4 Actual enzyme activity of two kinds protease

圖2 蛋白胨溶液標準曲線Fig.2 Standard curve of peptone solution

表5 四元二次通用旋轉組合設計方案及結果Table 5 Text scheme and results in quadratic general rotary unitized design

表6 試驗結果方差分析Table 6 Variance analysis of results

根據試驗結果得到擬合方程的各項系數，且蛋白胨得率方程為：

Y=29.2586+1.1782X1+0.8304X2+0.9769X3+0.8305X4-1.9362X12-2.4524X22-1.6039X32-1.9203X42-3.1338X1X2-0.4488X1X3+1.9038X1X4。

對該模型進行顯著性分析，結果如表6所示。該回歸方程的失擬性檢驗F1=2.7020＜F0.05（5，3）=9.01，結果不顯著，表示未知因素對試驗結果干擾較小；顯著性檢驗F2=16.3893＞F0.01（11，8）=5.74，結果極顯著，表示該模型預測值與實測值擬合性良好。單因素中X2和X4不顯著，X1和X3均達到顯著水平，且二次項均極顯著。剔除α=0.10 的不顯著項得到回歸方程：

Y=29.2586+1.1782X1+0.9769X3-1.9362X12-2.4524X22-1.6039X32-1.9203X42-3.1338X1X2+1.9038X1X4

最高值的各因素水平組合為：X1=1.682，X2=-1，X3=0，X4=1，即雙酶配比1.84∶1，酶解 溫 度50℃，酶解pH 8.0，酶解時間4 h，此時Ymax=29.86%。

2.3.2 蛋白胨得率單因素效應分析 根據試驗結果分析單因素效應（其它因子為零水平），結果如表7所示。圖3為各單因素與蛋白胨得率之間的關系圖。

表7 單因素效應分析Table 7 Effect analysis of single factor

由表7和圖3得知，蛋白胨得率隨各因素水平的升高呈現先增大后減小的趨勢，且影響順序是X1＞X3＞X4＞X2，即雙酶配比＞酶解pH＞酶解時間＞酶解溫度。

由表6可看出，交互作用存在且達到顯著水平的因素有X1X2及X1X4，僅對這兩組因素的交互作用進行效應分析。選取2 個因素零水平，考察另外2 個因素的交互作用，得到圖4。由圖4a 可看出在酶解溫度一定時，增大雙酶配比可顯著提高蛋白胨得率，而在雙酶配比一定時，升高溫度使蛋白胨得率呈先上升后平穩(wěn)的趨勢；圖4b 表明雙酶配比和酶解時間的交互作用對蛋白胨得率同樣有較大影響。

2.3.3 酶解工藝優(yōu)化與驗證 根據分析結果，發(fā)現試驗不僅有單因素效應，還有因素間的相互作用，很難僅從這兩項分析中確定最優(yōu)酶解條件，而且四元二次回歸數學模型無法確定蛋白胨得率的極大值。本試驗綜合采用頻率法分析該回歸模型[15]，確定最佳酶解條件。表8為蛋白胨得率大于23.86%的121 個方案中各變量取值的頻率分布。

圖3 各單因素與蛋白胨得率的關系Fig.3 Relationship of single factors and yield of peptone

由表8可知，在95%置信區(qū)間內蛋白胨得率大于23.86%的各變量取值區(qū)間分別為0.301～0.680，-0.509～-0.157，0.274～0.591，0.084～0.427，即雙酶配比為1.115 ∶1～1.34 ∶1（質量比），酶解溫度52.455～54.215 ℃，酶解pH8.137～8.296，酶解時間3.084～3.427 h。結合實際可行性，確定最優(yōu)酶解工藝為：雙酶配比1.3 ∶1、酶解溫度54 ℃、酶解pH 8.2、酶解時間3.4 h，按照回歸方程計算出蛋白胨得率預測值為29.83%。按此條件做驗證試驗，平行測定3 次，結果分別為28.66%，29.42%，29.76%，取平均值為29.28%，和預測值相近，驗證了該回歸模型的合理性。

圖4 雙酶配比與酶解溫度（a）和酶解時間（b）交互作用效應Fig.4 Interaction effect of double enzyme ratio with hydrolytic temperature（a）and hydrolytic time（b）

表8 各變量取值的頻率分布Table 8 Probability distribution of variables

3 結論

以脫脂雞副產物為原料，以水解度及蛋白胨得率為考察指標，通過單因素試驗分別比較胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、復合蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶5 種酶在各自最適條件下的水解度及蛋白胨得率，最終確定水解效果最佳、條件差異較小的兩種酶是胰蛋白酶和堿性蛋白酶，其在各自最適條件下水解度及蛋白胨得率分別為：14.49%，23.82%和14.61%，24.40%，因此選擇這兩種酶進行后續(xù)雙酶解試驗。選用胰蛋白酶和堿性蛋白酶對脫脂雞副產物混合蛋白進行復合酶解制備蛋白胨。

以蛋白胨得率為指標，通過四元二次通用旋轉組合設計優(yōu)化雙酶水解雞副產物制備蛋白胨工藝的數學回歸模型。在本試驗范圍該模型可預測脫脂雞副產物混合蛋白復合酶解制備蛋白胨的提取率。確定各因素最優(yōu)水平為雙酶配比1.3∶1、酶解溫度54 ℃、酶解pH 8.2、酶解時間3.4 h，該條件下蛋白胨得率實測值為29.28%。