二氫楊梅素對(duì)乳腺癌模型小鼠的抑瘤作用及其對(duì)小鼠肝、腎毒性的影響

張明亮，劉先富，陳 晨，唐經(jīng)緯，張曉靜，許 波

(蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，安徽 蚌埠 233002)

黃酮類化合物具有抗菌消炎、護(hù)肝利膽、保護(hù)心肌、抗腫瘤等多種藥用功效。其藥物制劑如，黃芪、銀杏、水飛薊等療效確切，副作用小，已在臨床廣泛應(yīng)用。二氫楊梅素作為黃酮類化合物的重要成員之一，大量文獻(xiàn)已證實(shí)其具有抗菌消炎、增強(qiáng)免疫功能、減輕放化療毒副作用的功效[1-2]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素還具有一定的抗腫瘤作用，它可以通過調(diào)節(jié)抑癌基因PTEN蛋白的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和代謝[3]。我們的前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素可以通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路，在體外抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖[4]。本研究進(jìn)一步觀察了二氫楊梅素在荷瘤動(dòng)物體內(nèi)的抑瘤效果?，F(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞株 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株(上海奧陸生物科技有限公司)。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)用小鼠為SPF級(jí)，BALB/c裸鼠，雌性，15只，鼠齡為(45.0±1.3)d，體重(20.0±0.8)g，均由蚌埠醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)編號(hào)：SYXK(皖)2010-012。蚌埠醫(yī)學(xué)院科研中心代為飼養(yǎng)與保管，動(dòng)物飼料及飲水均經(jīng)過紫外線滅菌處理。

1.1.3 主要試驗(yàn)儀器和試劑 PUS-2018半自動(dòng)生化分析儀(北京普朗醫(yī)療)，離心機(jī)(日本Hema)，TDX血藥濃度檢測(cè)儀(美國(guó)雅培)，二氫楊梅素(南京景竹)。

1.2 方法

1.2.1 SKBR3裸鼠乳腺癌模型建立 根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)記載[5]，將穩(wěn)定生長(zhǎng)傳代的MCF-7細(xì)胞株濃度調(diào)整為1×104/μL，每日取50μL細(xì)胞懸液注射于裸鼠右腋下皮下組織，待肉眼可見成瘤后，用卡尺測(cè)量移植瘤長(zhǎng)、短徑，并記錄。當(dāng)瘤體生長(zhǎng)至100mm3時(shí)，停止接種，小鼠一般情況良好，為建模成功。接種后第14天，從中選取已成瘤小鼠12只，瘤體體積在100mm3以上，高出身體皮膚表面，活動(dòng)度差，質(zhì)地硬，血管豐富。隨機(jī)編號(hào)，分2組，每組6只，分別對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組。

1.2.2 給藥方法 對(duì)照組每日給予足量餌料外同時(shí)給予1mL生理鹽水(安慰劑)灌胃，實(shí)驗(yàn)組每日給足量餌料外同時(shí)給予含有二氫楊梅素與生理鹽水混合的半流質(zhì)1mL灌胃。二氫楊梅素最終確定實(shí)驗(yàn)給藥劑量方法如下：稱取一定量二氫楊梅素粉劑，與1mL生理鹽水混合成半流質(zhì)，從5mg/g(小鼠體重，下同)初始劑量開始，每日逐步增加二氫楊梅素劑量10mg/g、15mg/g、20mg/g、25mg/g、30mg/g灌胃給藥，每日1次，灌胃后6h測(cè)定血藥濃度和心(LDH、CK)、肝(ALT、AST)、腎(Cr)功能，至出現(xiàn)血清LDH、CK、ALT、AST、Cr任何一項(xiàng)指標(biāo)異常，退回到上一劑量，并作為實(shí)驗(yàn)維持給藥劑量，最終確定每日實(shí)驗(yàn)給藥劑量為二氫楊梅素25mg/g小鼠體重。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 20.0軟件，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，組間比較采用t檢驗(yàn)、方差分析，GraphPad Prism 7.0作圖軟件，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)裸鼠一般情況受試裸鼠飲食、飲水、排便、一般活動(dòng)、毛色外觀均無(wú)異常。兩組小鼠均每日定時(shí)定量喂食水，在治療過程中無(wú)小鼠發(fā)生死亡。

2.2 二氫楊梅素耐受劑量及血藥濃度從25mg/g遞增到30mg/g時(shí)，其中1只小鼠的肝功能出現(xiàn)輕度異常，ALT 38.8U/L(正常值4～30U/L)，且進(jìn)食量明顯下降，原因可能與二氫楊梅對(duì)胃腸道刺激反應(yīng)有關(guān)。之后維持在25mg/g·d灌胃，小鼠肝腎功能血清指標(biāo)均可維持在較為平穩(wěn)水平，血藥濃度(25.2±2.1)μg/mL。見圖1。

圖1 不同給藥濃度對(duì)應(yīng)血藥濃度變化

2.3 小鼠荷瘤體積的變化對(duì)照組腫瘤生長(zhǎng)快速，體積逐漸增大，從喂養(yǎng)第7天，荷瘤體積已增大到接近初始的3倍，第14天時(shí)，平均腫瘤體積達(dá)(953±105)mm3。應(yīng)用二氫楊梅素治療組，腫瘤體積增加速度顯著放緩，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，該組小鼠荷瘤體積平均值為(467±65)mm3。數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，實(shí)驗(yàn)組相比對(duì)照組可顯著抑制腫瘤的生長(zhǎng)速度，差異具有顯著性(P<0.05)。見表1。

表1 不同時(shí)間段腫瘤體積變化(mm3)

2.4 小鼠移植瘤重量變化及抑瘤率情況對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組同時(shí)處理14d后，處死小鼠，仔細(xì)剝?nèi)×鲶w，拍照并稱重。經(jīng)t檢驗(yàn)分析處理，實(shí)驗(yàn)組瘤體重量顯著小于對(duì)照組(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組抑瘤率達(dá)43.35%，見表2。

表2 不同治療方法對(duì)小鼠移植瘤重量的影響(g)

注：*P<0.05。

2.5 小鼠血清LDH、CK、ALT、AST、Cr水平的差異實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組不同方式處理14d后，兩組小鼠血清LDH、CK、ALT、AST、Cr指標(biāo)水平變化情況如下表，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)t檢驗(yàn)分析統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，兩組均無(wú)顯著差異(P>0.05),見表3。

表3 二氫楊梅素對(duì)小鼠血清LDH、CK、ALT、AST、Cr水平的影響

3 討論

乳腺癌是當(dāng)今世界嚴(yán)重威脅婦女生命安全的常見惡性腫瘤。最新的2018年經(jīng)國(guó)家癌癥中心數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，乳腺癌已躍居女性惡性腫瘤發(fā)病率的第一位。每年全球大約有140萬(wàn)新增病例，約45萬(wàn)人死于乳腺癌。隨著科技的發(fā)展，新的抗乳腺癌藥物不斷上市，但仍然不能滿足乳腺癌患者對(duì)癌癥治療的渴求，當(dāng)前從天然植物中尋找抗腫瘤的有效成分是腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)之一。純天然成分二氫楊梅素是從藤茶類植物中提取而成，隸屬于黃酮類化合物，具備抗氧化、抗血栓、護(hù)肝、消炎等多種功效。最近研究發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素還具備抗腫瘤的功效，能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[6-7]。聯(lián)合化療藥物應(yīng)用時(shí)，可以增強(qiáng)化療藥物抗腫瘤作用，并能夠減輕化療造成的骨髓、肝、腎損害[8]。我們的前期細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，二氫楊梅素可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號(hào)通路，抑制乳腺癌SKBR3細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡[4]。國(guó)內(nèi)也有學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)二氫楊梅素可以調(diào)節(jié)STAT3/Bcl-2信號(hào)通路，起到抗腫瘤作用[9]。

在本研究中，我們通過注射MCF-7乳腺細(xì)胞株于裸鼠腋下，成功建立乳腺癌的小鼠模型，并觀察二氫楊梅素在活體體內(nèi)的抗腫瘤效果。通過口服給藥這種相對(duì)安全的給藥方法，按藥物濃度梯度逐日加量給藥，初步確定藥物在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的最大安全劑量，我們發(fā)現(xiàn)按25mg/g·d二氫楊梅素劑量灌胃，可將小鼠體內(nèi)血藥濃度維持在(25.2±2.1)μg/mL。維持在此劑量下，在飼養(yǎng)14d后，觀察對(duì)腫瘤的抑制效果。第14天時(shí)，對(duì)照組平均腫瘤體積達(dá)(953±105)mm3，超過初始體積達(dá)9倍，質(zhì)量達(dá)(2.63±0.55)g。而實(shí)驗(yàn)組腫瘤體積僅(467±65)mm3，質(zhì)量為(1.49±0.47)g。兩組腫瘤在體積與質(zhì)量上均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，治療2周后的抑瘤率達(dá)43.35%。而代表心肌功能的重要指標(biāo)血清乳酸脫氫酶LDH、肌酸激酶CK；代表肝功能的重要指標(biāo)血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT、谷草轉(zhuǎn)氨酶AST，代表腎功能的重要指標(biāo)血清肌酐Cr，在兩組小鼠中均無(wú)顯著差異。表明通過灌胃途徑給藥，二氫楊梅素的常規(guī)毒副作用不明顯。

本文僅通過初步的研究，證實(shí)了二氫楊梅素在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)的抗腫瘤效果，并且無(wú)明顯的毒副作用。但是，由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的數(shù)量較少，給藥時(shí)間較短(僅2周)，加之灌胃給藥途徑雖然操作簡(jiǎn)單，但藥物利用度在不同小鼠之間吸收度可能不同，以及手實(shí)驗(yàn)者操作方法的影響，其給藥的精確度不如靜脈給藥，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有待更大樣本量的佐證。此外通過這種方法單藥二氫楊梅素給藥，可明顯減緩了腫瘤的生長(zhǎng)速度，那么聯(lián)合應(yīng)用化療或靶向藥物能否進(jìn)一步控制腫瘤的生長(zhǎng)，二氫楊梅素通過何種途徑在體內(nèi)起到抗腫瘤作用，均有待進(jìn)一步研究。