12C6+輻照及航天誘變對無芒隱子草種子萌發(fā)、幼苗生長及葉綠素熒光特性的影響

李 潔，馬甜甜，剡轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)，閆 啟，周利斌，余 玲，張吉宇

（1. 蘭州大學草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 / 蘭州大學農(nóng)業(yè)農(nóng)村部草牧業(yè)創(chuàng)新重點實驗室 / 蘭州大學草地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心 / 蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020；2. 中國科學院近代物理研究所，甘肅 蘭州 730000）

誘變育種的主要目的是提高遺傳變異頻率，從而創(chuàng)造新種質(zhì)，它是解決常規(guī)育種中某些特殊問題和培育新品種的重要方法之一。1986年，我國首次發(fā)現(xiàn)的水稻注入重離子的誘變效應開創(chuàng)了離子束生物技術(shù)[1]。作為植物新的誘變源的重離子束受到了越來越多的重視，重離子輻照誘變育種已成為獲得植物新遺傳資源、選育新品種的重要途徑之一。利用離子束注入技術(shù)已經(jīng)獲得了一些較好的新品系或新材料。趙連芝等[2]培育出了我國首次通過重離子輻射育成的小麥(Triticum aestivum)優(yōu)良新品種隴輻2號。鄭冬官等[3]對去種皮的陸地棉(Gossypium hirsutum)種子進行離子注入，獲得了早熟、株型改善、抗倒伏等不同性狀的棉花新品系。羅紅兵等[4]利用Li離子輻射玉米(Zea mays)雜交種農(nóng)大108的種子，從中獲得雄性不育突變材料。官梅和李栒[5]對油菜(Brassica campestris)種子進行C離子輻照，從而獲得瘤狀根、矮莖、雙生角果和黃色種子等性狀的突變體。頡紅梅等[6]對豆科和禾本科的牧草種子進行了20Ne10+離子束貫穿處理，篩選出了葉片變厚、葉色深綠、生長勢增強的禾本科牧草新株系。

航天誘變育種可利用空間特殊環(huán)境(高真空、微重力、高能輻射、強磁場等)，使種子產(chǎn)生遺傳變異，獲得有益的突變體，再返回地面用常規(guī)育種方法培育新材料、新種質(zhì)[7]。我國是全世界繼前蘇聯(lián)和美國后第3個掌握了返回式衛(wèi)星技術(shù)的國家。近年來，多國在空間站開展了生物實驗，已經(jīng)培育出一百多種太空植物，為航天誘變育種打下堅實的基礎(chǔ)[8]。我國利用航天誘變技術(shù)已經(jīng)研究了水稻(Oryza sativa)、小麥、大豆(Glycine max)、陸地棉、番茄(Lycopersicon esculentum)、黃瓜(Cucumis sativus)、紫花苜蓿(Medicago sativa)、一串紅(Salvia splendens)、靈芝(Ganoderma lucidum)等植物，涉及糧、油、棉、蔬菜、瓜果、牧草、花卉和藥材等，培育出水稻“WS31”、小麥“宇航2號”、甜椒“87-2”、太空黃瓜“96-1”、番茄“TF873”等許多新品種(系)[8-11]。我國的航天育種主要集中于農(nóng)作物、蔬菜、花卉的研究[6]，而對牧草航天育種的研究起步較晚，目前處于初始階段。

無芒隱子草(Cleistogenes songorica)為多年生禾本科植物，主要分布于中國內(nèi)蒙古、陜西、寧夏、甘肅、青海及新疆等地，是我國西北地區(qū)荒漠草地重要的牧草之一[12]，其飼用價值高，抗熱性、抗旱性、耐寒性極強，對荒漠生態(tài)系統(tǒng)的恢復和保育具有重要作用[13-14]。已有研究報道了無芒隱子草的萌發(fā)[15]、種子生產(chǎn)技術(shù)[16]以及秋水仙素和60Co-γ射線對其種子和幼苗生長的影響[17]等，但對于12C6+重離子輻照及航天誘變影響其種子萌發(fā)、幼苗生長和葉綠素熒光特性未見報道。本研究以騰格里無芒隱子草 (Cleistogenes songorica ‘Tenggeli')種子為材料，研究12C6+重離子輻照及航天誘變對其種子萌發(fā)、幼苗生長和葉綠素熒光特性的影響，以期為創(chuàng)制無芒隱子草新種質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

蘭州大學選育的新品種騰格里無芒隱子草，2015年于甘肅民勤采集種子，貯藏在蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院4 ℃恒溫種質(zhì)庫中待用。2016年8月取部分無芒隱子草分為3份，一份用于12C6+輻照誘變，一份用于航天誘變，另一份作為對照。

1.2 試驗方法

1.2.1 誘變處理

12C6+輻照誘變：將用于12C6+輻照的材料分為8份，用封口膜包裹。于2017年2月24日在中國科學院近代物理研究所蘭州重離子加速器國家實驗室(NL-HIAL)重離子研究裝置(HIRFL) TL2終端上進行輻照誘變，在室溫和正常大氣條件下，初始能量為100 MeV·u-1的12C6+離子束，經(jīng)過束流管道的鎳窗、電離室、空氣和降能片后照射樣品(無芒隱子草種子)，輻照劑量分別為25、50、100、150、200、300、400 和 500 Gy，劑量率為 45 Gy·min-1。誘變后的種子保存在4 ℃恒溫種質(zhì)庫中。

航天誘變：將用于航天誘變的無芒隱子草種子從4 ℃恒溫種質(zhì)庫中取出，按要求密封送往中國甘肅酒泉衛(wèi)星發(fā)射基地，搭乘神舟十一號飛船，于2016年10月17日07:30發(fā)射升空，衛(wèi)星軌道距地面393 km，經(jīng)33 d的航行，于11月18日13:59返回地面。飛行過程中樣品置于飛行返回艙，待返回地面后取出樣品，將處理后的種子送回蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，保存在4 ℃恒溫種質(zhì)庫中。

對照為4 ℃恒溫種質(zhì)庫中的未作任何誘變處理的種子。

1.2.2 種子發(fā)芽試驗

2018年3月13日，從恒溫種質(zhì)庫中取出對照和不同誘變處理后的種子各500粒，用5.25%[18]的次氯酸鈉表面消毒5 min，蒸餾水至少沖洗3次，后置于鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，25 ℃下培養(yǎng)(16 h光照，8 h黑暗)[19]。每處理每皿100粒種子，5個重復，每天加等量蒸餾水以保濕。每天統(tǒng)計各培養(yǎng)皿的發(fā)芽種子數(shù)量。培養(yǎng)14 d后，統(tǒng)計最終發(fā)芽數(shù)[17]并測定幼苗胚芽胚根長及生物量。之后選取長勢一致的各處理無芒隱子草幼苗移植至54 cm × 28 cm的48孔穴盤中(基質(zhì)為草炭土∶蛭石=3∶1，質(zhì)量比)在溫室培養(yǎng)(自然光照)，測量株高，測定葉綠素熒光參數(shù)并統(tǒng)計各處理無芒隱子草幼苗的存活率。

1.3 測定指標及方法

發(fā)芽指數(shù)的測定：第7天計算發(fā)芽指數(shù)，發(fā)芽指數(shù)(GI)的計算公式[20]為：GI = ∑(Gt/Dt)，其中：Gt代表發(fā)芽第t天的種子發(fā)芽率，Dt為相應的種子發(fā)芽天數(shù)。

幼苗胚芽胚根長及生物量的測定：第14天每皿隨機取10個正常發(fā)芽的種子，先用蒸餾水沖洗干凈，經(jīng)吸水紙吸干后，測定幼苗的胚芽胚根長度以及生物量。胚芽胚根長度用刻度尺測量，生物量用1/10 000分析天平稱量(生物量一次測10個幼苗)。

幼苗株高的測定：移栽穴盤后，第10天每處理隨機選20株幼苗測量株高。

葉綠素熒光的測定：移栽穴盤后的第15天，利用調(diào)制葉綠素熒光成像系統(tǒng)MAIX-IMAGING-PAM(WALZ，德國)進行葉綠素熒光參數(shù)的測定，測定前先將穴盤在室內(nèi)放置4～6 h，待其充分適應室內(nèi)環(huán)境后，用黑布遮住整個穴盤，暗處理30 min后進行測定。每處理分別測定3個長勢相同的葉片。經(jīng)充分的暗適應后，先用弱的測量光照射葉面，測出初始熒光(F0)，此時，再打開一次飽和光脈沖使熒光上升到Fm，并測得可變熒光(Fv= Fm-F0)。當熒光從Fm快回落到F0時，立即打開光化光和IMAGING-PAM提供的測量光。然后等熒光下降到穩(wěn)態(tài)熒光(Fs)時，再打開一次同樣強度的飽和脈沖光，測定Fm'。根據(jù)給出的參數(shù)，計算出充分暗適應下PSⅡ的潛在最大光化學量子效率Fv/ Fm= (Fm-F0) /Fm，由儀器直接導出光化學淬滅系數(shù)(qP)、非光化學淬滅系數(shù)(NPQ)和電子傳遞速率(ETR)。

幼苗成活率的測定：移栽穴盤后的第14天和第35天分別測定幼苗的成活率，其計算公式為：幼苗成活率 = (成苗數(shù)/發(fā)芽的種子數(shù)) × 100%。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用EXCEL 2016對不同處理后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計和制圖。運用SPSS 21進行方差分析(ANOVA)，當P ＜ 0.05時，認為差異有統(tǒng)計學意義。利用Imaging Win軟件(WALZ，德國)采集熒光參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 12C6+重離子輻照及航天誘變對無芒隱子草種子萌發(fā)的影響

不同劑量12C6+重離子輻照無芒隱子草后的種子發(fā)芽率呈現(xiàn)出先降低后增高的趨勢，但均低于對照(91.8%)。其中，150、200、300和400 Gy輻照劑量處理的種子發(fā)芽率分別為85.2%、84.6%、80.6%和83.0%，顯著低于對照(P ＜ 0.05)。除25 Gy外，種子的發(fā)芽指數(shù)均顯著低于對照(P ＜ 0.05)。在300 Gy輻照劑量時，種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均最低。經(jīng)航天誘變后無芒隱子草的種子發(fā)芽率顯著低于對照(P ＜ 0.05)，第14天的最終發(fā)芽率為65.2%，較對照組的發(fā)芽率降低了26.8%，發(fā)芽指數(shù)也顯著低于對照 (P ＜ 0.05) (圖 1、圖 2)。

2.2 12C6+重離子輻照及航天誘變對無芒隱子草幼苗生長的影響

經(jīng)不同劑量12C6+重離子輻照處理后的無芒隱子草種子，發(fā)芽14 d的幼苗胚芽胚根長各不同。幼苗的胚芽長均低于對照，其中，150、300、400和500 Gy輻照劑量處理的幼苗胚芽長顯著低于對照(P ＜ 0.05)。500 Gy輻照劑量處理的幼苗胚芽長(4.49 mm)最小，300 Gy次之(5.27 mm)。就胚根長而言，所有處理的胚根長與對照均無顯著差異(P ＞0.05)，且300 Gy輻照劑量處理的幼苗胚根長達到最小(0.97 mm)。無芒隱子草種子經(jīng)航天誘變處理后，發(fā)芽14 d的幼苗胚芽長顯著低于對照(P ＜ 0.05)，胚根高于對照，但差異不顯著(P ＞ 0.05) (圖3)。

圖 1 12C6+輻照及航天誘變對無芒隱子草種子發(fā)芽的影響Figure 1 Effects of 12C6+ irradiation and space mutation on seed germination of Cleistogenes songorica

圖 2 12C6+輻照及航天誘變對無芒隱子草種子發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)的影響Figure 2 Effects of 12C6+ irradiation and space mutation on seed germination percentage and germination index of Cleistogenes songorica不同小寫字母表示同一指標不同處理間差異顯著(P ＜ 0.05)；Control：未作處理對照；SP：航天誘變。下同。Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments for the same indicator at the 0.05 level； SP: Space mutation； similarly for the following figures.

經(jīng)12C6+重離子輻照處理后，300和500 Gy輻照劑量的幼苗生物量顯著低于對照(P ＜ 0.05)。25、100和150 Gy輻照劑量的生物量高于對照(P ＞ 0.05)，其中25和150 Gy輻照劑量處理的生物量與對照基本持平(對照為 9.0 mg，25 Gy為 9.3 mg，150 Gy為9.1 mg)。300 和500 Gy 輻照劑量的生物量顯著低于對照(P ＜ 0.05)，且300 Gy輻照劑量的生物量最低，為6.4 mg。不同劑量12C6+重離子輻照無芒隱子草后株高各不相同。150、200和500 Gy輻照劑量處理的幼苗株高與對照之間存在顯著差異(P ＜0.05)。其中，150 Gy劑量處理的幼苗株高最高，比對照高出3.91 cm。500 Gy劑量處理的幼苗株高最矮，比對照低3.2 cm。航天誘變明顯促進了無芒隱子草幼苗的生長，幼苗生物量高于對照，株高高于對照2.05 cm (圖4)。

圖 3 12C6+輻照及航天誘變對無芒隱子草胚芽和胚根長的影響Figure 3 Effects of 12C6+ irradiation and space mutation on plumule and radicle length of Cleistogenes songorica

無芒隱子草經(jīng)12C6+重離子輻照航天誘變和處理，各處理第35天的幼苗存活率均低于第14天(圖5)。在12C6+重離子輻照下，100 Gy輻照劑量處理的無芒隱子草第35天的幼苗存活率最高，為73.96%，500 Gy輻照劑量處理的無芒隱子草幼苗存活率最低，僅為10.14%。航天誘變后的無芒隱子草第35天的幼苗成活率略低于對照。

2.3 12C6+重離子輻照及航天誘變對無芒隱子草幼苗葉綠素熒光參數(shù)的影響

不同劑量12C6+重離子輻照和航天誘變后對無芒隱子草幼苗的Fv/Fm、qP、NPQ和ETR值有一定的影響。不同劑量12C6+重離子輻照無芒隱子草后幼苗的Fv/Fm值均顯著低于對照(P ＜ 0.05)，500 Gy輻照劑量處理時的Fv/Fm值最小(表1)。qP值和NPQ值均與對照無顯著差異(P ＞ 0.05)，且qP值與NPQ值的變化趨勢相反。除25和150 Gy輻照劑量外，無芒隱子草幼苗的ETR值均顯著低于對照(P ＜ 0.05)。300 Gy輻照劑量處理時幼苗的ETR值最小。航天誘變無芒隱子草后，幼苗的Fv/Fm值和ETR值均顯著低于對照(P ＜ 0.05)。幼苗的qP值低于對照，NPQ值高于對照，但二者均與對照無顯著差異(P ＞ 0.05)(表1)。圖6展示了利用MAXI-IMAGING-PAM測量不同劑量12C6+重離子輻照和航天誘變處理下無芒隱子草幼苗葉綠素熒光參數(shù)的部位和部分指標。

圖 5 12C6+輻照及航天誘變對無芒隱子草幼苗存活率的影響Figure 5 Effects of 12C6+ irradiation and space mutation on the seedling survival rate of Cleistogenes songorica

圖 6 基于IMAGING-PAM測量不同處理下無芒隱子草幼苗的Fv / Fm值Figure 6 Fv / Fm values of seedlings of Cleistogenes songorica under different treatments based on IMAGING-PAM

表 1 12C6+輻照及航天誘變后對無芒隱子草幼苗Fv/Fm、qP、NPQ和ETR的變化Table 1 Changes of Fv/Fm, qP, NPQ, and ETR in Cleistogenes songorica after 12C6+ irradiation and space mutation

3 討論與結(jié)論

與X射線和γ射線等相比，重離子束照射對植物材料M1代生理損傷輕、M2代突變率較高、性狀穩(wěn)定、育種周期短。因此近年來，許多國內(nèi)外科研機構(gòu)都進行了重離子束照射突變育種[21-22]。前人研究表明，12C6+重離子輻照對不同種類的植物種子萌發(fā)與幼苗生長存在劑量型效應。侯歲穩(wěn)等[23]發(fā)現(xiàn)，低劑量12C6+重離子輻照對胡麻(Sesamum indicum)的發(fā)芽及株高等指標有促進作用，高劑量輻照則對其有抑制作用。此外，在菘藍(Isatis indigotica)的研究中顯示，其株高和根長隨輻照劑量的增加而降低[24]。本研究表明，12C6+重離子輻照無芒隱子草后，其發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、胚芽胚根長整體均呈現(xiàn)出隨輻照劑量的增加而緩慢降低的趨勢，這與陸錫宏等[24]的研究結(jié)果相似。劉青芳等[25]用12C6+離子輻照小麥種子，以輻照劑量10 Gy為界限，發(fā)芽率、幼苗胚根長及株高呈現(xiàn)先上升后減小的趨勢。因此推測，在本研究中當初始劑量低于25 Gy時，無芒隱子草的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、胚芽胚根長可能會出現(xiàn)先上升后降低的趨勢是未可知的。在本研究中，幼苗的生物量和株高整體呈現(xiàn)出隨著輻照劑量的增加先降低后增加再降低的“類馬鞍形”曲線。這可能是12C6+離子對無芒隱子草的輻照處理根據(jù)劑量的不同產(chǎn)生了低劑量的輕微刺激和高劑量的損傷效應導致的，這與余麗霞等[26]的研究結(jié)果基本一致。但杜艷等[27]的研究結(jié)果表明，經(jīng)C離子束處理后幼苗的生物量和株高都隨輻照劑量的增加而降低。這與本研究的結(jié)果存在部分不同之處，可能與輻照材料、材料對輻照的敏感性以及輻照方式和輻照劑量的不同有關(guān)。12C6+離子輻照無芒隱子草種子后，在25～150 Gy輻照劑量之間時，除50 Gy幼苗的存活率略低于對照以外，其余輻照劑量均高于對照，在150 Gy時，幼苗的存活率急速下降，之后幼苗的存活率保持在10%～30%，說明在整體上離子束對幼苗存活具有一定程度的抑制作用。Du等[28]用0～600 Gy的12C6+離子輻照擬南芥(Arabidopsis thaliana)種子，發(fā)現(xiàn)生長21 d的幼苗存活率隨輻照劑量的增加呈現(xiàn)出短暫上升，然后快速下降，最后基本保持穩(wěn)定的趨勢，這與本研究關(guān)于幼苗存活率的結(jié)果較一致。在升高過程中，50 Gy處理下幼苗存活率略低于對照，可能是由于外界復雜的環(huán)境因素造成的，例如水、光照條件等。

航天育種作為農(nóng)作物誘變育種的新興領(lǐng)域，可以創(chuàng)造出更多新的種質(zhì)資源，培育優(yōu)良的品種[29]。不同的植物材料由于對空間環(huán)境的敏感程度及空間飛行期間所處的環(huán)境不同，因此經(jīng)空間飛行后的種子生活力各不相同[30]。本研究表明，航天誘變處理后無芒隱子草的種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、胚芽長顯著低于對照，幼苗胚根長和生物量略高于對照，但與對照無顯著差異。說明無芒隱子草的種子經(jīng)航天搭載處理后種子活力整體上減弱。幼苗株高和生物量高于對照，說明航天誘變對無芒隱子草幼苗的生長有一定的促進作用。移栽穴盤后的幼苗存活率略低于對照，但與對照差異不大，說明航天搭載對無芒隱子草成苗后的幼苗適應性影響不大，這與何明霞等[31]的研究結(jié)果一致。但是，逄明達等[32]用神舟十號飛船搭載小麥品種濟麥22，對生長5 d的幼苗生長勢、苗高、鮮重和根長等主要指標進行對比分析，發(fā)現(xiàn)處理后的幼苗與地面對照相比生物量略有降低，胚芽鞘變長，根長變短，株高變高，這與本研究結(jié)果不太一致。這可能是因為航天誘變會因物種或者搭載的環(huán)境不同而對植物生長的影響產(chǎn)生差異。航天誘變由多因素綜合作用且存在未知的誘變因素，對植物的生長影響具有獨特性和復雜性[12,33-34]。但由于進行空間搭載的機會限制，目前空間環(huán)境對無芒隱子草生長影響的研究僅有此一例，搭載神舟十一號飛船對無芒隱子草種子發(fā)芽特性和幼苗生長的影響是只表現(xiàn)在搭載當代還是已經(jīng)影響了遺傳而在后代繼續(xù)表達，是什么機制導致了其種子發(fā)芽和幼苗生長還有待進一步深入研究。

葉綠素熒光和植物的光合作用聯(lián)系緊密，植物的葉綠素熒光參數(shù)可以直觀地反映其最大的光合作用能力、抗脅迫能力及本身的生長狀態(tài)[35]。本研究結(jié)果表明，不同劑量的12C6+重離子輻照和航天誘變處理后幼苗的Fv/Fm和ETR值總體顯著低于對照，qP值與NPQ值與對照無顯著差異，這說明12C6+重離子輻照和航天誘變影響了幼苗的最大光合作用能力，降低了光合電子傳遞速率，但對幼苗葉片的光合活性和光能耗散程度基本無影響。對于12C6+輻照對植物葉綠素熒光的影響，在擬南芥中也有過類似的報道，輻照處理導致擬南芥幼苗光吸收效率降低，PSII反應系統(tǒng)受損，電子傳遞速率下降[36]。陸璃[37]與逄明達等[32]對小麥的航天誘變研究結(jié)果也表明，航天誘變會影響小麥光合系統(tǒng)活性中心的發(fā)育，對幼苗生長產(chǎn)生脅迫作用。

本研究表明，12C6+重離子輻照和航天誘變對無芒隱子草種子萌發(fā)、幼苗生長及葉綠素熒光參數(shù)整體上有抑制作用，但并未確定無芒隱子草的半致死劑量以及最適宜的輻照劑量，還有待進一步深入研究。結(jié)合生理代謝指標及細胞學效應等的研究，為12C6+重離子輻照和航天誘變有效運用于無芒隱子草誘變育種提供依據(jù)。