甲狀旁腺激素對雙足鼠脊柱側(cè)凸進展的影響

陸凌云，戴哲浩，呂國華，潘越(.廈門市第五醫(yī)院骨科，廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院同民分院，福建 廈門 360；.中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院脊柱外科，湖南 長沙 400)

特發(fā)性脊柱側(cè)凸(Idiopathic Scoliosis，IS)發(fā)病機制復(fù)雜，始動因素不明，遺傳因素、生長發(fā)育不平衡等均被認(rèn)為與IS發(fā)病和進展有關(guān)[1]。盡管如此，上述始動因素最終引起的脊柱生物力學(xué)異常則被認(rèn)為是IS進展更為直接的原因[2-3]。主流的治療方法(佩戴支架和手術(shù)矯形)也是旨在借“外力”恢復(fù)脊柱力學(xué)平衡，而非針對病因治療。因此，我們設(shè)想在脊柱側(cè)凸早期便使用促骨形成藥物(甲狀旁腺激素，Parathyroid Hormone，PTH)，通過增強“內(nèi)力”達(dá)到控制其進展的目的[4]。

1 材料和方法

1.1 實驗動物分組 雌雄對半的三周齡SD大鼠60只(由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供，SPF級，NO.430470040)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，X線攝片確認(rèn)無脊柱側(cè)彎及其他脊柱畸形，然后依體重輕重編號，采用隨機數(shù)字表分為三組：雙足鼠組、拴系-雙足鼠組、PTH干預(yù)組。每組20只，雌雄對半。

1.2 動物模型的建立

1.2.1 雙足鼠組 按40 mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉(上海生工生物有限公司)麻醉大鼠。成功后取俯臥位，切口周圍備皮、絡(luò)合碘消毒。在盂肱關(guān)節(jié)處做切口，游離皮下，在腋部縫扎上肢神經(jīng)血管束后，切開盂肱關(guān)節(jié)并離斷，徹底止血后，縫合肌肉、皮膚。隨后在尾巴根部環(huán)行切開皮膚，貼近根部進行縫扎后截除尾部，縫合皮膚。

1.2.2 拴系-雙足鼠組 麻醉成功后，在左肩胛下角處，橫行切開皮膚及皮下，長約0.5 cm，鈍性分離肌肉，顯露肩胛下角。再在骨盆髂冀水平，橫行切開皮膚及皮下，長約2 cm，顯露同側(cè)(左側(cè))骨盆髂翼，彎鉗鈍性分離兩切口之間皮下組織并測量左側(cè)肩胛下角和同側(cè)骼后上棘之間的距離?？p針帶7號絲線貫穿髂后上棘后做“8”字縫合，然后在皮下用小彎鉗將結(jié)扎在髂后上棘的縫線牽拉到肩胛下角切口處，隨后將縫線穿過肩胛下角，調(diào)整縫線長度至前述所測距離一致時做“8”字縫扎，止血后縫合皮膚。然后截去雙上肢和尾部。造模后8周末，剪斷栓系縫線。

1.2.3 PTH干預(yù)組 手術(shù)處理方式與拴系-雙足鼠組一致。從造模后第一天開始，在頸背部行PTH皮下注射，劑量為20 μg/kg·d，連續(xù)12周。以每2 mg PTH(上海吉爾生化有限公司)溶于100 mL生理鹽水中配置PTH溶液，即每100 g大鼠體重皮下注射0.1 mL液體量。造模后8周末，剪斷栓系縫線。

1.2.4 飼養(yǎng) 造模后單只飼養(yǎng)，自由進食進水。根據(jù)大鼠的生長情況，逐步抬高水和食物，促使大鼠在盡可能多的時間內(nèi)保持雙足站立或運動狀態(tài)。

1.3 觀察方法 造模后即刻、造模后4周、造模后8周、造模后12周(處死前)拍攝脊柱全長正位X線片，測量Cobb角，評價脊柱側(cè)凸發(fā)生和進展情況。麻醉方法為：按40 mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉。當(dāng)Cobb角大于10°時則判定為發(fā)生了脊柱側(cè)凸。攝片時，自制固定架將大鼠頭部固定，整體抬高與地平線成30°夾角，利用重力對軀干形成一定的牽引，避免麻醉導(dǎo)致的體位性側(cè)凸(見圖1)。攝片參數(shù)設(shè)定為：電流2.80 mAs，電壓41 KV，時間0.4 s，焦點距離1 m。

圖1 X線檢查示意圖

完成X線攝片后立即使用雙能X線測定骨密度儀(QDR4500A型，美國Hologic公司)掃描大鼠。將大鼠俯臥于掃描臺上，下肢盡量外展。儀器自帶分析軟件測定脊柱的面積BMD。掃描前利用自帶小動物體模質(zhì)控。

在最后一次X線攝片時，記錄拴系-雙足鼠組和PTH干預(yù)組各大鼠的頂椎位置。腹腔內(nèi)注射過量戊巴比妥處死大鼠，縱行切開背部皮膚、分離肌肉，充分顯露脊柱骨性結(jié)構(gòu)，以垂直于頂椎椎板、平行于棘突的方式扎入大頭針1枚，在頂椎下一位椎體以同法再扎入1枚大頭針，量角器量取兩者夾角，即頂椎旋轉(zhuǎn)度。

從脊柱整體中分離拴系-雙足鼠組和PTH干預(yù)組大鼠的頂椎，雙足鼠組則取L1椎體為對照。顯微CT(GE Explore Locus SP型) 掃描上述椎體標(biāo)本。將標(biāo)本沿長軸垂直放置于儀器自帶的固定容器內(nèi)，以乙醇(70%)為掃描介質(zhì)并確保介質(zhì)內(nèi)無明顯氣泡。掃描參數(shù)設(shè)定為管電壓80 kV，電流80 μA，360°旋轉(zhuǎn)，掃描時間大約為180 min平均4幀，角度增益0.4°，曝光時間3 000 ms，各向同性分辨率8.0 μm× 8.0 μm× 8.0 μm。以Fluro方式將標(biāo)本全部選入掃描窗口內(nèi)，并同時掃描隨機自帶標(biāo)準(zhǔn)體模。掃描完成后，校正CT值及旋轉(zhuǎn)中心，以41.0 μm× 41.0 μm× 41.0 μm的分辨率重建整體結(jié)構(gòu)。隨后，在椎體前后緣中點之間做連線，劃分椎體為凹凸兩側(cè)，便于分別測量。選取椎弓根上緣與椎體體部交接處為起始平面，向下2.0 mm范圍內(nèi)的區(qū)域為感興趣區(qū)域(Region of interest，ROI)，行8.0 μm× 8.0 μm×8.0 μm三維重組，完成圖像二值化及ROI內(nèi)松質(zhì)骨的三維可視化(見圖2)。利用儀器自帶分析軟件計算ROI內(nèi)松質(zhì)骨各參數(shù)，包括體積骨密度(volumetric BMD，vBMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction，bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁數(shù)量(trabecular number，Th.N)、骨小梁厚度(trabecular thichness，Tb.Th)、骨小梁間隔(trabecular separation，Th.SP)等。

圖2 顯微CT椎體松質(zhì)骨三維可視化

2 結(jié) 果

2.1 一般情況 造模后第1天，三組大鼠均少食、少動，切口有少許滲血。造模后第3天，大鼠活動量恢復(fù)，飲食如常。造模后第10天，切口愈合。各組均無大鼠死亡。較造模后即刻，造模后4周、8周、12周的雙足鼠組體重分別增加了66.87%、140.21%、176.67%，拴系-雙足鼠組體重分別增加了71.32%、147.19%、204.21%，干預(yù)組體重分別增加了66.04%、137.26%、175.50%，重復(fù)測量設(shè)計的方差分析結(jié)果：a)不同時間點的體重有差別(F=509.992，P=0.000)；b)三組的體重變化趨勢無差別(F=2.416，P=0.305，見圖3)。

圖3 體重變化示意圖

2.2 脊柱側(cè)凸情況 X線片檢查在雙足鼠組中未發(fā)現(xiàn)脊柱側(cè)凸、椎體旋轉(zhuǎn)和楔形變(見圖4a)；在拴系-雙足鼠組和PTH干預(yù)組中，大鼠均發(fā)生了側(cè)凸(見圖4b、4c，見表1)，兩組Cobb角資料見表2及圖5，采用兩因素重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，判斷PTH注射隨著時間變化對栓系大鼠Cobb角的影響。通過對學(xué)生化殘差的分析，經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗，各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布(P>0.05)；通過學(xué)生化殘差是否超過±3倍的標(biāo)準(zhǔn)差判斷，各組數(shù)據(jù)無異常值。經(jīng)Mauchly’s球形假設(shè)檢驗發(fā)現(xiàn)其不滿足球?qū)ΨQ假設(shè)(P<0.001)，說明重復(fù)測量數(shù)據(jù)之間存在相關(guān)性，因此，對是否使用PTH干預(yù)及時間因素進行單獨效應(yīng)的檢驗。

a 雙足鼠組 b 拴系-雙足鼠組 c PTH干預(yù)組

圖4 造模后12周大鼠脊柱X線片

表1 大鼠側(cè)凸情況比較(例)

結(jié)果表明：a)在造模后4周、8周、12周，PTH干預(yù)組與拴系-雙足鼠組的Cobb角的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(見表2，圖5)；b)在拴系-雙足鼠組中時間的單獨效應(yīng)存在4個水平，因變量不符合球形假設(shè)(P<0.001)，Greenhouse-Geisser方法計算的Epsilon=0.387，F(xiàn)=259.716(1.161，22.066)，P<0.001，時間因素對于Cobb角的單獨效應(yīng)具有統(tǒng)計學(xué)意義，兩兩比較顯示各時間點之間Cobb角的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)；c)在PTH干預(yù)組中，時間因素不符合球形假設(shè)(P<0.001)，Greenhouse-Geisser方法計算的Epsilon=0.420，F(xiàn)=340.919(1.261，23.960)，P<0.001，兩兩比較顯示各時間點之間Cobb角的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。大鼠處死后，測量頂椎旋轉(zhuǎn)度，PTH干預(yù)組的頂椎旋轉(zhuǎn)度為(4.4±1.5)°，拴系-雙足鼠組為(6.0±2.2)°，采用兩獨立樣本t檢驗分析，兩組之間的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.687；P=0.011)。

2.3 DXA掃描結(jié)果 采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，判斷不同干預(yù)方式隨著時間變化對大鼠脊柱BMD的影響。通過對學(xué)生化殘差的分析，經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗，各組數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布(P>0.05)；通過學(xué)生化殘差是否超過±3倍的標(biāo)準(zhǔn)差判斷，各組數(shù)據(jù)無異常值。經(jīng)Mauchly’s球形假設(shè)檢驗發(fā)現(xiàn)其不滿足球?qū)ΨQ假設(shè)(P<0.001)，說明重復(fù)測量數(shù)據(jù)之間存在相關(guān)性(見表3，圖6)，因此，對干預(yù)方式及時間因素進行單獨效應(yīng)的檢驗，結(jié)果表明：a)各組大鼠的脊柱BMD均隨著增齡顯著性增加，提示此時期是大鼠的生長期，可作為干預(yù)的窗口期；b)造模后即刻(0周)各組大鼠的脊柱BMD之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；c)造模后4周、8周、12周，干預(yù)方式對于大鼠脊柱BMD的影響具有統(tǒng)計學(xué)意義，兩兩比較顯示：與拴系-雙足鼠組和雙足鼠組比較，PTH干預(yù)組大鼠脊柱BMD顯著增高(P<0.001)，而拴系-雙足鼠組和雙足鼠組之間脊柱BMD的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(在造模后4周、8周、12周，P值分別為1.000，0.693，1.000)。

2.4 顯微CT測定椎體骨微結(jié)構(gòu)參數(shù) 大鼠椎體兩側(cè)骨微結(jié)構(gòu)的情況見表4。組內(nèi)椎體(頂椎)兩側(cè)各參數(shù)比較，采用配對t檢驗，在雙足鼠組，兩側(cè)各參數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.893)；在拴系-雙足鼠組，凹側(cè)的vBMD、BV/TV、Tb.Th高于凸側(cè)，Tb.Sp低于凸側(cè)，而Tb.N差異無統(tǒng)計學(xué)意義；在PTH干預(yù)組，凹側(cè)BMD、BV/TV、Tb.Th高于凸側(cè)，Tb.Sp低于凸側(cè)，Tb.N差異無統(tǒng)計學(xué)意義。組間比較采用單因素方差分析，與雙足鼠組比較，拴系-雙足鼠組的凸側(cè)BMD(P=0.000)及凹側(cè)BMD、BV/TV、Tb.Th增高(P值分別為0.000；0.000；0.003)，而且凹側(cè)Tb.Sp減小(P=0.000)。與雙足鼠組和拴系-雙足鼠組對比，PTH干預(yù)組大鼠無論是凸側(cè)還是凹側(cè)的BMD、BV/TV、Tb.Th數(shù)值均增加，Tb.Sp降低，Tb.N差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在拴系-雙足鼠組，頂椎的凹側(cè)BMD、BV/TV、Tb.Th較凸側(cè)分別高出了7.6%、14.4%、13.9%；在PTH干預(yù)組，僅分別高出了6.9%、7.9%、10.5%，三者在凸凹側(cè)的變化程度具有顯著差異性(見圖7)。

表2 大鼠Cobb角情況比較(°)

表3 不同時期各組大鼠DXA掃描結(jié)果比較(mg/cm2)

圖5 Cobb角不同時間點變化趨勢 圖6 骨密度不同時間點變化趨勢

3 討 論

IS病因不明，但是脊柱生物力學(xué)異常被認(rèn)為是導(dǎo)致IS進展最為直接的原因[2-3]。當(dāng)下的主流治療方法(佩戴支架和手術(shù)矯形)也是旨在借“外力”恢復(fù)脊柱力學(xué)平衡，以期阻止IS進展，而非針對病因治療[5]。Machida等[6]發(fā)現(xiàn)補充褪黑素可以控制褪黑素水平低下的IS患者的側(cè)凸進展，而褪黑素在體內(nèi)能發(fā)揮積極的抗骨質(zhì)疏松作用[7]。同時，大量研究證實IS患者存在全身性的BMD降低和骨質(zhì)量低下[8]。Uchiyama等[9]指出骨小梁BMD與骨彈性模量成正相關(guān)，因而IS患者骨彈性模量低下，應(yīng)力下抗變形能力差，在生長發(fā)育過程中容易出現(xiàn)脊柱畸形。這提示我們通過提高脊柱BMD和骨質(zhì)量，增強“內(nèi)力”以對抗異常脊柱生物力學(xué)，是減緩或阻止IS進展的另一新途徑。

表4 各組大鼠椎體兩側(cè)骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)比較

本研究中，與頂椎凸側(cè)比較，凹側(cè)BMD增高、骨小梁增厚且間距縮小，骨小梁更加強韌。與雙足鼠組相比，拴系-雙足鼠組的凸側(cè)BMD，凹側(cè)BMD、BV/TV、Tb.Th數(shù)值增高，且凹側(cè)Tb.Sp縮小，這表明頂椎凹凸兩側(cè)均在通過自我調(diào)整BMD和骨微結(jié)構(gòu)以匹配各自微環(huán)境的變化，其差異是由于凹側(cè)骨小梁增生更活躍導(dǎo)致。我們推測該結(jié)果是由于不對稱力學(xué)因素出現(xiàn)后，凸側(cè)軟骨生長板在張應(yīng)力刺激下提高了骨建造水平，新骨加速形成從而表現(xiàn)出BDM增高及椎體高度增加；而凹側(cè)在壓應(yīng)力的作用下抑制了骨建造活性，導(dǎo)致新骨形成不足。該過程與Hueter-Volkmann定律相符。凹側(cè)成骨不足，不能有效抵抗壓應(yīng)力，骨小梁微骨折、高度進一步丟失、椎體楔形變、側(cè)凸進展，形成“惡性循環(huán)”。然而，微骨折會激活骨重建，隨著骨重建水平的提高，凹側(cè)變得強韌，在一定程度上打破“惡性循環(huán)”的過程、阻礙椎體的楔形變和側(cè)凸的進行性加重，該過程又與沃爾夫定律(骨的結(jié)構(gòu)與功能相匹配)相符。因此，我們觀察到凸凹兩側(cè)BMD均顯著增加的現(xiàn)象。剪斷栓系縫線后，Cobb角沒有持續(xù)增大，可能原因是大鼠此時進入成熟期，生長潛能降低，骨建造作用消退，而凹側(cè)骨重建機制持續(xù)性激活，不斷重塑凹側(cè)骨小梁，使其強度不斷增大，直到足以對抗不對稱的力學(xué)因素。這合理詮釋了側(cè)凸在患者生長高峰期時進展迅猛，而一旦發(fā)育成熟、椎體骨骺閉合，其進展的風(fēng)險便明顯下降的現(xiàn)象。

a 雙足鼠組椎體冠狀位及橫斷位二維結(jié)構(gòu)，兩側(cè)骨小梁厚度、骨小梁數(shù)量、骨小梁間隔無明顯差別

b 拴系-雙足鼠組椎體冠狀位及橫斷位二維結(jié)構(gòu)，與凸側(cè)比較，凹側(cè)(白色箭頭)骨小梁明顯增厚、增多，骨小梁間距縮小

c PTH干預(yù)組椎體冠狀位及橫斷位二維結(jié)構(gòu)，與拴系-雙足鼠組比較，骨小梁明顯增厚，骨小梁間距縮小

圖7 椎體松質(zhì)骨二維結(jié)構(gòu)示意圖

PTH是目前上市的唯一一種促骨合成藥物[10-11]。在本研究中，PTH提高了大鼠脊柱BMD。顯微CT的數(shù)據(jù)進一步表明，PTH改善了頂椎兩側(cè)的vBMD和骨微結(jié)構(gòu)，雖然其仍存在顯著性差異，但是該差異已較拴系-雙足鼠組明顯減小。宏觀上，PTH干預(yù)組大鼠的Cobb角從造模后第4周開始便顯著小于拴系-雙足鼠組，頂椎旋轉(zhuǎn)度也顯著減小。

本研究證實了脊柱側(cè)凸的凹凸兩側(cè)在Hueter-Volkmann定律和沃爾夫定律的支配下通過自我調(diào)整BMD和骨微結(jié)構(gòu)以順應(yīng)各自的微環(huán)境改變，而且逐漸提高的骨重建水平增強了凹側(cè)骨骼強度，在某種程度上打破“惡性循環(huán)”并阻止脊柱側(cè)凸進展。PTH的應(yīng)用，提前提高了骨重建水平，增強了“內(nèi)力”以對抗生物力學(xué)異常，從而達(dá)到控制側(cè)凸進展的目的。我們的嘗試為治療脊柱側(cè)凸提供了新的思路。