利用CRISPR-Cas9敲除Tyr基因制作白化C57BL/6N小鼠

常秋榮，劉麗麗，王會(huì)陽，付麗，邢鳳英，李垚，陳學(xué)進(jìn)*，李善剛,2*

(1. 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部，上海 200025； 2. 昆明理工大學(xué)靈長類轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，昆明 650500)

C57BL/6N小鼠是由Little于1921年建立的近交系之一。該近交系以補(bǔ)體活性高，各種腫瘤自發(fā)率比較低為主要特點(diǎn)[1]，在國內(nèi)外得到了廣泛應(yīng)用，C57BL/6J小鼠也是繼人類之后第二個(gè)完成基因組測(cè)序的哺乳動(dòng)物種類。我們國家被全部授權(quán)引進(jìn)的是C57BL/6N小鼠，可以自主進(jìn)行基因修飾。由于C57BL/6N的毛色為黑色，單一的毛色品種限制了C57BL/6N在基因敲除和皮膚組織移植等方面研究中的廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的基因敲除小鼠多數(shù)具有129的背景，而在大量的醫(yī)學(xué)科學(xué)研究中，C57BL/6N小鼠是常用的品系之一。這就產(chǎn)生了一個(gè)問題，生產(chǎn)的小鼠需要與C57BL/6N小鼠連續(xù)的進(jìn)行回交7～8代，才能將小鼠變?yōu)镃57BL/6N背景。為了克服這個(gè)困難，國內(nèi)外有不少的實(shí)驗(yàn)室嘗試建立了來源于C57BL/6N的胚胎干細(xì)胞[2-3]，但是這種C57BL/6N來源胚胎干細(xì)胞并沒有大量的應(yīng)用。其主要原因是C57BL/6N的毛色為黑色，而嵌合體試驗(yàn)中的受體小鼠分別是毛色為白色的BALB/c和ICR，不同品系的差別降低了嵌合的效率。如果能用擁有白毛色的C57BL/6N作為嵌合受體，將會(huì)對(duì)提高嵌合率有幫助，也能夠節(jié)省回交的時(shí)間和費(fèi)用。

經(jīng)典的基因打靶動(dòng)物模型制作是建立在基因重組技術(shù)和大量細(xì)胞篩選的基礎(chǔ)上，而最近幾年出現(xiàn)的ZFN (zinc-finger nucleases，ZFNs)[4-5]、TALEN (TALE nucleases，TALENs)[6-7]和CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)技術(shù)則為廣泛的開展基因修飾制作人類重大疾病模型提供了新的選擇[8]。CRISPR-Cas9技術(shù)通過向?qū)NA(sgRNA, single guide RNA)與基因組位點(diǎn)之間20 bp堿基的配對(duì)，再引導(dǎo)Cas9蛋白實(shí)現(xiàn)DNA切割，切斷DNA鏈，然后經(jīng)過細(xì)胞內(nèi)在的DNA連接修復(fù)功能恢復(fù)雙鏈，在這個(gè)過程中發(fā)生不同數(shù)目堿基的缺失或者插入，從而造成DNA編碼的移碼突變。由于sgRNA的設(shè)計(jì)簡(jiǎn)便，使得CRISPR-Cas9技術(shù)在近幾年風(fēng)靡一時(shí)。目前該技術(shù)已經(jīng)在小鼠[9-10]、大鼠[11]、兔[12]和猴[13]等物種上成功獲得了突變動(dòng)物，并且能夠?qū)崿F(xiàn)大片段外源基因敲入[9]和定點(diǎn)突變[14]。如在小鼠上，趙勇等利用CRISPR-Cas9技術(shù)成功構(gòu)建了miRNA-29b1基因敲除小鼠[15]。在大鼠上，馬元武等利用CRISPR-Cas9技術(shù)敲除胰島素受體底物1(Irs1)基因，得到穩(wěn)定遺傳的Irs1基因敲除大鼠[16]。

酪氨酸酶(tyrosinase, TYR)是黑色素生成的關(guān)鍵酶，有學(xué)者通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法揭示了Tyr基因在黑線倉鼠皮膚組織中的mRNA表達(dá)水平是其白化突變系的2.5倍，白化突變系Tyr基因表達(dá)量的降低，促使黑色素細(xì)胞合成與沉積的黑色素減少，進(jìn)而導(dǎo)致白化毛色表型[17]。通過破壞Tyr基因可以獲得白化的動(dòng)物。目前已經(jīng)有日本學(xué)者在C57BL/6J小鼠上開展了Tyr基因序列點(diǎn)突變獲得白化的C57BL/6J小鼠的研究[18]。為了適應(yīng)國內(nèi)大量基于C57BL/6N小鼠的研究應(yīng)用，本課題基于CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，以C57BL/6N小鼠為研究對(duì)象，通過破壞C57BL/6N小鼠Tyr的基因序列，獲得白化的C57BL/6N小鼠，然后經(jīng)過重復(fù)回交和自交，形成C57BL/6N白化小鼠近交系。為以C57BL/6N為基礎(chǔ)的胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用和組織工程提供更加豐富的實(shí)驗(yàn)工具。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

3周齡SPF級(jí)雌性C57BL/6N小鼠6只，飼養(yǎng)一周后使用；雄性C57BL/6N小鼠6只，在8～20周齡使用；ICR雄鼠10只，結(jié)扎兩周后使用；ICR雌鼠10只體重在25～35 g之間用做胚胎移植受體。實(shí)驗(yàn)小鼠均購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司【SCXK(滬)2012-0002】。上述小鼠及后代飼養(yǎng)在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部屏障環(huán)境內(nèi)【SYXK(滬)2013-0050】。小鼠的麻醉、結(jié)扎、胚胎移植和取樣檢測(cè)均按照上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)程序進(jìn)行(IACUC No. A-2015-002)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

胚胎操作液M2(Sigma，美國)；透明質(zhì)酸酶(Sigma，美國)；胚胎培養(yǎng)基KSOM(Millipore，德國)；孕馬血清(PMSG)和絨毛膜促性腺激素(HCG)購自寧波三生藥業(yè)，分別溶于4℃生理鹽水，-20℃保存；小鼠麻醉劑由8 mL生理鹽水添加2 mL 0.05 g/mL氯胺酮(福建古田藥業(yè)，批號(hào)1507294)和16 mg xylazine(Sigma，美國)組成；石蠟油(Sigma，美國)；pT7-cas9 vector和pCD-CAS購自百奧生物技術(shù)有限公司；Cas9-mRNA體外轉(zhuǎn)錄試劑盒mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Transcription Kit和sgRNA合成試劑盒MEGAshortscript T7 high yield Transcription Kit購自Invitrogen公司；限制性核酸內(nèi)切酶XbaⅠ，Premix Taq Hot start購自Takara生物公司；引物合成由Invitrogen公司合成；DNA測(cè)序由上海鉑尚生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 Cas9-mRNA的體外合成

利用pT7-cas9質(zhì)粒中cas9基因后存在的XbaⅠ單一酶切位點(diǎn)，酶切使其線性化，在50 μL的酶切反應(yīng)體系加入5 μL 10×T Buffer (Takara)，5 μL 10× BSA，2.5 μLXbaⅠ，10 μg pT7-cas9質(zhì)粒。37℃水浴反應(yīng)3 h后，通過異丙醇沉淀方法回收線性化的pT7-cas9質(zhì)粒，經(jīng)生物分光光度計(jì)測(cè)定濃度，調(diào)整濃度范圍在500～1000 ng/μL為宜，取出2 μg用于體外合成。

參照mMESSAGE mMACHINE T7 Ultra Transcription Kit的使用說明，在體外轉(zhuǎn)錄合成Cas9-mRNA，在室溫下配置反應(yīng)體系混勻后，在PCR儀中37℃反應(yīng)2 h。向反應(yīng)體系中加入1 μL TURBO DNase，37℃反應(yīng)15 min 以去除DNA模板。然后對(duì)Cas9-mRNA添加Poly(A)尾，在PCR儀中37℃反應(yīng)45 min，反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物放置在冰上。采用LiCl沉淀法，回收Cas9-mRNA，加入40 μL RNase-free H2O稀釋，按照1 μg/管分裝至RNase-free的PCR管中，放入-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 sgRNA的體外合成

利用從Invitrogen公司合成的引物P-sgF0F和T7R1，以pCD-CAS質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)合成sgF0。PCR程序?yàn)?0℃退火30 s，53℃退火30 s，產(chǎn)物經(jīng)異丙醇回收后獲得sgF0模板序列。根據(jù)張鋒實(shí)驗(yàn)室在線設(shè)計(jì)程序，針對(duì)Tyr基因的Exon1和Exon2的序列，設(shè)計(jì)兩對(duì)sgRNA(sgTYR1F/ sgTYR1R/sgTYR2F/sgTYR2R)(見表1)，將設(shè)計(jì)好的Tyr基因sgRNA的四個(gè)引物分別與反向引物T7R1混合，以sgF0為模板進(jìn)行一次PCR反應(yīng)(60℃退火30 s)，再以該產(chǎn)物為模板，以引物T7primer和T7R1進(jìn)行二次PCR反應(yīng)(61℃退火30 s，45℃退火30 s)，采用異丙醇回收DNA的方法純化二次PCR產(chǎn)物，用做體外轉(zhuǎn)錄sgRNA的模板。將一次PCR和二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物取出5 μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，預(yù)計(jì)長度為120 bp左右。該產(chǎn)物用于sgRNA的體外合成。

按照Invitrogen公司MEGAshortscript T7 high yield Transcription Kit說明書的操作，進(jìn)行體外sgRNA合成，在PCR儀中，37℃反應(yīng)16 h。根據(jù)MEGAclear-96 Purification of Transcription Reactions in 96 well format試劑盒的操作指導(dǎo)，完成sgRNA回收，回收產(chǎn)物加入RNase-free的PCR管中，使用生物分光光度計(jì)測(cè)定濃度后，按照1 μg/管的使用標(biāo)準(zhǔn)將其分裝至RNase-free的PCR管中，放入-80℃保存。

表1 sgRNA合成相關(guān)引物及基因型鑒定引物Table 1 Primers related to sgRNA synthesis and genotype identification

1.2.3 小鼠受精卵的獲得

每只C57BL/6N雌小鼠腹腔注射5 U的PMSG(下午1～2點(diǎn))，46～48 h后注射10 U的HCG，與雄小鼠合籠，第2天將有陰道栓的小鼠頸椎脫臼法處死，取出輸卵管。在體式顯微鏡下用1 mL注射器針尖劃破輸卵管壺腹部，釋放細(xì)胞團(tuán)，放入含有0.3%透明質(zhì)酸酶的M2培養(yǎng)液中，3 min后用玻璃吸管收集原核明顯和有第二極體的受精卵，移到覆蓋石蠟油的KSOM培養(yǎng)液滴中。

1.2.4 小鼠受精卵的顯微注射

將Cas9-mRNA和四種sgRNA按照20 ng/μL和40 ng/μL的使用濃度進(jìn)行混合，混勻后在10 cm培養(yǎng)皿蓋子上做成微滴，同時(shí)用添加0.2% PVA的M2做成30 μL的操作滴。用P97(Sutter，美國)拉針儀拉制注射針，在鍛針儀上斷成約2 μm粗細(xì)大小的開口，向注射針中注入0.5 cm左右的水銀，然后裝在配有Piezo的顯微操作儀上，吸入Cas9-mRNA和sgRNA混合液。用持卵針將受精卵固定住，用注射針打破透明帶，沿赤道面水平插入細(xì)胞質(zhì)2/3的位置，使用低的脈沖打破細(xì)胞膜，輕微旋動(dòng)注射針手柄，使大約5 pL的Cas9-mRNA和sgRNA的混合液進(jìn)入到受精卵胞質(zhì)中。注射后的胚胎移入KSOM培養(yǎng)基，在37℃，5% CO2飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.2.5 注射后受精卵的胚胎移植

選自然發(fā)情的ICR雌鼠與結(jié)扎公鼠交配，以見到陰道栓的作為受體鼠，麻醉后進(jìn)行胚胎移植。受精卵注射后24 h，選擇發(fā)育到2細(xì)胞的胚胎進(jìn)行胚胎移植。將內(nèi)徑130 μm，經(jīng)過拋光的移胚針裝在顯微注射器的針桿前端，擰動(dòng)螺旋，按照順序吸入第一個(gè)氣泡，胚胎和第二個(gè)氣泡，然后在輸卵管上用1 mL注射器針尖扎一個(gè)小口，將移胚針自小口處插入輸卵管，擰動(dòng)螺旋將玻璃管中的胚胎和氣泡注入輸卵管膨大部，以在膨大部看到氣泡為移植成功。

1.2.6 新生小鼠和F1代小鼠的基因型鑒定

對(duì)所有新生的小鼠在一周時(shí)進(jìn)行剪腳趾編號(hào)，剪下的腳趾作為樣品分別放入離心管，加入100 μL的50 mmol/L NaOH溶液，98℃加熱30 min，然后加入10 μL濃度為1 mol/L的Tris-HCl(pH=7.5)，混勻后作為DNA模板。根據(jù)靶基因所在位點(diǎn)向上下延伸200 bp左右，利用Premier 5分別設(shè)計(jì)出兩對(duì)鑒定引物JDTYR1F/JDTYR1R和JDTYR 2F/JDTYR2R(見表1)。小鼠基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)擴(kuò)增目的條帶。針對(duì)Exon1的鑒定引物是JDTYR1F/JDTYR1R(60.1℃退火30 s，54.5℃退火30 s)，目的片段201 bp；針對(duì)Exon2的鑒定引物是JDTYR2F/JDTYR2R(52.5℃退火30 s)，目的片段258 bp?？鐑?nèi)含子PCR擴(kuò)增引物是JDTYR1F/ JDTYR2R(54.5℃退火30 s)。

將擴(kuò)增產(chǎn)物取5 μL進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳分析，部分產(chǎn)物送上海鉑尚測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.2.7 白化C57BL/6N小鼠的繁殖和種系維持

將F0代小鼠與野生型C57BL/6N交配獲得F1代小鼠；對(duì)F1代的小鼠采取自交的方法，獲得F2代小鼠。F2代小鼠有黑色和白色(Tyr-/-)兩種，只將白的小鼠留種，與野生型的C57BL/6N進(jìn)行交配獲得F3代雜合子。F3代的黑鼠進(jìn)行自交獲得F4代，F(xiàn)4代的黑鼠繼續(xù)與野生型的C57BL/6N回交。如此周而復(fù)始直至回交4次后，采用白色C57BL/6N進(jìn)行自交繁殖以維持種系。

1.2.8 白化C57BL/6N小鼠的下頜骨測(cè)定

取3只白化C57BL/6N小鼠和4只野生型C57BL/6N小鼠，分別頸椎脫臼法處死，剪開皮膚取頭骨至沸水中煮2～3 min后剃下右側(cè)下頜骨，用2% NaOH加熱至80～90℃持續(xù)10 min以去除下頜骨殘肉并拔掉門齒，洗凈并室溫干燥后[19]，用掃描儀(Epson，日本)進(jìn)行掃描。對(duì)掃描圖像進(jìn)行重合(Merge)分析。

2 結(jié)果

2.1 Cas9 mRNA和 sgRNA的合成

pT7-Cas9質(zhì)粒經(jīng)過XbaⅠ單酶切后(見圖1A)，將該質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，獲得Cas9 mRNA，并測(cè)定其濃度為1479 ng/μL。利用異丙醇回收的sgF0片段為模板，經(jīng)過兩步PCR反應(yīng)后獲得sgRNA的轉(zhuǎn)錄模板，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析后，得到長度約為120 bp的單一條帶(見圖1B)，用作sgRNA的轉(zhuǎn)錄模板。經(jīng)過轉(zhuǎn)錄后，獲得濃度分別為3234、3225、3793、4455 ng/μL的四個(gè)sgRNA。

注：A. M1：DL10 000 DNA Marker；a: pT7-Cas9質(zhì)粒；b: XbaⅠ酶切pT7-Cas9質(zhì)粒；B. 1-4：一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； M2：DL1000 DNA Marker；5-8：二次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖1 線性化的pT7-Cas9質(zhì)粒及體外轉(zhuǎn)錄sgRNA的模板Note. A. M1, DL10 000 DNA marker. a, pT7-Cas9 vector. b, pT7-Cas9 vector was cut by XbaI. B. 1-4: Products of the first PCR. M2, DL 10 000 DNA marker. 5-8, Products of the second PCR.Figure 1 Linearized pT7-Cas9 plasmid and templates of sgRNA transcription in vitro

注：A. F0代小鼠；B. F1代小鼠；C. F2代小鼠；D. 白化C57BL/6N小鼠近交系。圖2 Tyr基因敲除小鼠后代Note: A. Offspring of F0 generation. B. Offspring of F1 generation. C. Offspring of F2 generation. D. Albino C57BL/6N mouse inbred line.Figure 2 Offsprings of the Tyr knockout mice

2.2 F0代小鼠的獲得和鑒定

通過顯微注射的方式，將使用濃度為20 ng/μL的Cas9-mRNA和使用濃度均為10 ng/μL的sgTYR1F，sgTYR1R，sgTYR2F和sgTYR2R混勻后，將Cas9-sgRNA的混合液注射入原核期受精卵的胞質(zhì)中。第2天將35枚發(fā)育至2細(xì)胞的經(jīng)過基因編輯的胚胎通過胚胎移植技術(shù)移植入兩只代孕受體的兩側(cè)輸卵管中，20 d妊娠期結(jié)束后生產(chǎn)2只小鼠，其中一只為白色，一只為黑色(見圖2A)。

將兩只小鼠的DNA經(jīng)過PCR鑒定，2%瓊脂糖凝膠電泳以后(見圖3A)發(fā)現(xiàn)，白色小鼠Exon1擴(kuò)出了兩條帶，其中一條帶明顯短于目的條帶；Exon2擴(kuò)增的帶沒有差異，跨內(nèi)含子的引物沒有擴(kuò)增出明顯的帶型。對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，白色小鼠的Exon1和Exon2都有移碼突變，但是無法做具體分析。黑色F0代小鼠測(cè)序結(jié)果為野生型。

2.3 F1代小鼠的獲得和鑒定

將F0代白色小鼠和野生型小鼠交配，獲得4只F1代小鼠(見圖2B)，針對(duì)Exon1的PCR檢測(cè)結(jié)果顯示1號(hào)小鼠和2，3，4號(hào)小鼠基因型不同(見圖3B)，1號(hào)小鼠擴(kuò)出1條帶，2，3，4號(hào)小鼠均擴(kuò)出2條帶；針對(duì)Exon2的PCR檢測(cè)結(jié)果顯示1，2，3，4號(hào)小鼠基因帶型相同(見圖3B)。

注：A， 1：F0代黑色小鼠Exon1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；2：F0代白色小鼠Exon1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3：F0代黑色小鼠Exon2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；4：F0代白色小鼠Exon2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；5：F0代黑色小鼠跨內(nèi)含子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；6：F0代白色小鼠跨內(nèi)含子PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M1：DL1000 DNA Marker。B， M2：DL1000 DNA Marker；1-4: 4只F1代黑色小鼠Exon1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；M3：DL1000 DNA Marker；5-8: 4只F1代黑色小鼠Exon2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。C， M4：DL1000 DNA Marker；1-5∶5只純合代白色小鼠Exon1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。D， M5：DL1000 DNA Marker；1-5: 5只純合代白色小鼠Exon2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖3 F0代、F1代、純合后代的Exon1和Exon2 PCR結(jié)果Note. A, 1. Exon1 PCR product of black F0 generation. 2. Exon1 PCR product of white F0 generation. 3. Exon2 PCR product of black F0 generation. 4. Exon2 PCR product of white F0 generation. 5. Transintron PCR product of black F0 generation. 6. Trnasintron PCR product of white F0 generation. M1: DL1000 DNA marker. B, M2: DL1000 DNA marker. 1-4, Exon1 PCR products of four black offsprings of F1 generation. M3:DL1000 DNA marker. 5-8, Exon2 PCR products of four black offsprings of F1 generation. C, M4: DL1000 DNA marker. 1-5, Exon1 PCR products of five white offsprings of homozygous generation. D, M5: DL1000 DNA marker. 1-5, Exon2 PCR products of five white offsprings of homozygous generation.Figure 3 PCR products of Exon1 and Exon2 between F0, F1 and homozygous generations

2.4 F2代小鼠的獲得和持續(xù)回交

利用F1代的3號(hào)和4號(hào)小鼠交配獲得了F2代(見圖2C)，選擇F2代中的白色小鼠與野生型黑色C57BL/6N進(jìn)行回交。目前已經(jīng)回交4次，現(xiàn)在維持白化C57BL/6N小鼠近交系(見圖2D)。采用全同胞兄妹交配方式維持。將白化后代的PCR產(chǎn)物(見圖3C&D)切膠后送測(cè)序經(jīng)Blast比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，白色小鼠在Exon1有兩種突變類型，分別缺失45 bp和14 bp，Exon2也有兩種突變類型，分別缺失7 bp和3 bp，通過純合類型的分析發(fā)現(xiàn)其中E1-45和E2-3在同一條染色體上，E1-14和E2-7在同一條染色體上(見圖4)。

注：紅色字母表示PAM，綠色字母表示sgRNA位點(diǎn)。圖4 sgRNA位點(diǎn)和純合子小鼠的基因突變形式Note. The red letters indicate PAM and the green letters indicate sgRNA sites.Figure 4 sgRNA sites and mutant forms of the homozygous mice

圖5 白化C57BL/6N小鼠與野生型C57BL/6N小鼠下頜骨掃描圖像比較Figure 5 Comparison of the mandibular scan images between albino C57BL/6N and wild-type C57BL/6N mice

2.5 白化C57BL/6N小鼠的下頜骨測(cè)定

通過對(duì)3只白化C57BL/6N小鼠與4只野生型C57BL/6N小鼠下頜骨掃描圖像的重合比較，我們發(fā)現(xiàn)白化C57BL/6N小鼠的下頜骨與野生型C57BL/6N小鼠的下頜骨非常一致(見圖5)。沒有明顯的變異發(fā)生。

3 結(jié)論

本研究設(shè)計(jì)了兩對(duì)sgRNA，針對(duì)小鼠Tyr基因的兩個(gè)外顯子進(jìn)行敲除，通過一次胚胎注射實(shí)驗(yàn)，移植兩只受體就獲得了白化的C57BL/6N小鼠，產(chǎn)生突變的效率約50%，和CRISPR-Cas9在其他物種上的基因敲除結(jié)果類似[11-12]，而且該小鼠具有繁殖能力，順利地產(chǎn)生了后代，這也說明CRISPR-Cas9技術(shù)的簡(jiǎn)便高效。

在試驗(yàn)中簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)方法，將通過引物退火后插入到酶切后的質(zhì)粒中獲得sgRNA表達(dá)載體的方法改為通過兩次PCR的方式直接擴(kuò)增sgRNA體外合成的模板，這樣可以將質(zhì)粒構(gòu)建，抽提，測(cè)序驗(yàn)證的步驟省略，可以節(jié)約3～5 d的時(shí)間和一部分實(shí)驗(yàn)費(fèi)用。這對(duì)規(guī)?；肅RISPR-Cas9技術(shù)制作小鼠模型很有幫助。

在小鼠胚胎移植的過程中，我們?cè)谳斅压芸拷虼蟛恳浦驳姆椒ɑA(chǔ)上做了進(jìn)一步改進(jìn)[20]，將移胚針裝在顯微注射器上使用，由于顯微注射器操作靈敏，可以輕松的吸入微小的氣泡，并且將移植胚胎緊密排列在移胚針內(nèi)。吹入輸卵管膨大部的液體較少，而且通過油壓傳動(dòng)和螺旋推動(dòng)，可以輕松克服輸卵管內(nèi)的液體壓力，保證移植的成功率。

CRISPR-Cas9技術(shù)的一個(gè)缺點(diǎn)是脫靶效應(yīng)，這主要是由于基因功能序列的相似性和模糊識(shí)別造成的。所以說CRISPR-Cas9技術(shù)在基因突變方面有很大的優(yōu)勢(shì)，但是還不能完全替代傳統(tǒng)的ES細(xì)胞打靶技術(shù)。為了克服潛在的脫靶，我們對(duì)白化C57BL/6N小鼠的后代進(jìn)行了連續(xù)的回交。下頜骨測(cè)定的結(jié)果顯示白化C57BL/6N小鼠與野生型C57BL/6N小鼠沒有區(qū)別。

在實(shí)驗(yàn)過程我們發(fā)現(xiàn)注射后的胚胎發(fā)育到期率比較低，這可能與注射的sgRNA數(shù)量較多有關(guān)，而且兩個(gè)外顯子同時(shí)敲除也給鑒定帶來了麻煩。所以針對(duì)一個(gè)外顯子設(shè)計(jì)1～2條sgRNA或許是一個(gè)好的思路，這樣可以減少變異類型，方便獲得基因突變小鼠后的基因型鑒定。

本研究通過CRISPR-Cas9技術(shù)敲除小鼠Tyr基因，成功建立了C57BL/6N白化小鼠近交系，為將來的嵌合體制作、組織移植提供了新的工具，本小鼠種系可以無償提供給有需求的研究者。