利用正交試驗(yàn)優(yōu)化建立大鼠條件恐懼記憶模型

郭冷秋，郭壯麗，朱霄，周蕾，王夢(mèng)楠，張立光，周揚(yáng)

(1. 蘇州衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)院，蘇州 215009； 2. 青島大學(xué)附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科， 青島 266003)

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和社會(huì)的進(jìn)步，情緒障礙性疾病(如焦慮、失眠、創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙等)的發(fā)病率呈現(xiàn)日益增高的趨勢(shì)。負(fù)性情緒(尤其是恐懼)記憶消除障礙是本類疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵[1]，探討如何有效消退由創(chuàng)傷經(jīng)歷引起的恐懼記憶、消除和降低病人的恐懼反應(yīng)，具有重要的意義[2]?？謶钟洃泟?dòng)物模型的建立是本類疾病發(fā)病機(jī)制研究和藥物研發(fā)的關(guān)鍵?；诎透β宸驐l件反射原理的條件恐懼(fear conditioning)模型是目前公認(rèn)的和應(yīng)用最為廣泛的恐懼記憶動(dòng)物模型[3]。該模型將條件刺激(中性刺激，CS，如：聲音)與非條件刺激(恐懼刺激，US，如：電擊)進(jìn)行多次匹配聯(lián)結(jié)(CS-US)訓(xùn)練后，即使單獨(dú)呈現(xiàn)CS 也可引發(fā)動(dòng)物的恐懼反應(yīng)[4]。CS-US連結(jié)訓(xùn)練是形成動(dòng)物恐懼反應(yīng)和建立恐懼記憶的關(guān)鍵。然而目前缺乏統(tǒng)一可循的標(biāo)準(zhǔn)和參考，不同的研究者往往采用不同的參數(shù)條件，導(dǎo)致模型的重復(fù)性和可借鑒性差，進(jìn)而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性。本研究利用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，優(yōu)選建立條件恐懼記憶模型的最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)；并對(duì)所建立的模型進(jìn)行恐懼記憶保持的短期(24 h)和長(zhǎng)期(1周、2周、4周和8周)水平檢測(cè)，以考察優(yōu)選條件下建立的模型的可靠性和穩(wěn)定性，為相關(guān)研究提供可借鑒的實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

6～8周齡清潔級(jí)SD大鼠，雄性，體重160～200 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司【SCXK(滬)2012-2002】，飼養(yǎng)在蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室【SYXK(蘇) 2016-0049】。明暗周期為12 h/12 h(光照時(shí)間7：00～19：00)、室溫22～26℃條件，自由攝食和飲水。適應(yīng)7 d，期間每天由實(shí)驗(yàn)者撫摸大鼠3 min，并放入條件恐懼箱適應(yīng)5 min，取出后用75%酒精擦拭箱體以去除遺留氣味。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(倫理審批號(hào)：SWAE201902)。

分組：(1)正交試驗(yàn)：大鼠隨機(jī)分為9組，每組7～8只，按照正交試驗(yàn)表L9(34)安排實(shí)驗(yàn)，三個(gè)因素分別為聲音強(qiáng)度(因素A)、電擊強(qiáng)度(因素B)和CS-US配對(duì)循環(huán)次數(shù)(因素C)，每個(gè)因素各取三個(gè)水平，因素水平見(jiàn)表1，9個(gè)實(shí)驗(yàn)組具體參數(shù)安排見(jiàn)表2。(2)恐懼記憶保持測(cè)試：大鼠隨機(jī)分為模型組和對(duì)照組，每組9只，模型組以實(shí)驗(yàn)(1)所確定的試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行訓(xùn)練，對(duì)照組不進(jìn)行條件恐懼訓(xùn)練，其他條件同實(shí)驗(yàn)組。

1.1.2 儀器設(shè)備

Panlab條件恐懼與驚跳結(jié)合系統(tǒng)(Startle and Fear Combined System，美國(guó)Harvard公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠正常行為模式檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)大鼠在條件恐懼箱內(nèi)適應(yīng)3 min后，記錄20 min內(nèi)的活動(dòng)情況，計(jì)算木僵反應(yīng)時(shí)間占總測(cè)試時(shí)間的百分比(freezing time ratio)。連續(xù)記錄3 d，取3 d的平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.2 大鼠對(duì)聲音(CS)的基礎(chǔ)反應(yīng)

實(shí)驗(yàn)大鼠在條件恐懼箱內(nèi)適應(yīng)3 min后，不同組別大鼠按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表(見(jiàn)表2)分別給予相應(yīng)強(qiáng)度的CS，每次持續(xù)10 s，共10次，間隔90～150 s(平均120 s，隨機(jī)出現(xiàn))。記錄大鼠在CS持續(xù)時(shí)間內(nèi)的freezing time ratio。

1.2.3 條件恐懼記憶模型的建立

實(shí)驗(yàn)大鼠在條件恐懼箱適應(yīng)3 min后，按照正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表(見(jiàn)表2)，進(jìn)行CS-US配對(duì)訓(xùn)練(CS持續(xù)10 s，結(jié)束之前0.5 s給予電擊(US)，聲音電擊同時(shí)結(jié)束)，此為一個(gè)循環(huán)(trial)；此后每間隔90～150 s(平均120 s，隨機(jī)出現(xiàn))1個(gè)trial。統(tǒng)計(jì)大鼠在10個(gè)trial中的freezing time ratio。

表1 實(shí)驗(yàn)因素與水平Table 1 Experimental factors and levels

1.2.4 恐懼記憶表達(dá)檢測(cè)

條件恐懼記憶建立24 h后，再次將大鼠放入條件恐懼箱，3 min后給予訓(xùn)練時(shí)的CS(不給予US)，共10次，每次持續(xù)10 s，間隔時(shí)間為120 s。統(tǒng)計(jì)大鼠在CS持續(xù)時(shí)間內(nèi)的freezing time ratio。對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析，明確影響恐懼記憶形成的因素主次，確定最優(yōu)試驗(yàn)條件。

1.2.5 恐懼記憶保持檢測(cè)

利用上述實(shí)驗(yàn)確定的最優(yōu)試驗(yàn)條件，建立大鼠恐懼記憶模型，并對(duì)大鼠進(jìn)行短時(shí)(24 h)和長(zhǎng)時(shí)(1周、2周、4周和8周)恐懼記憶的保持檢測(cè)。方法同1.2.4。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 大鼠正?；顒?dòng)模式

各組大鼠在條件恐懼建立前正?；顒?dòng)的freezing time ratio見(jiàn)圖1，單因素方差分析結(jié)果表明，各組之間差異無(wú)顯著性(P=0.9996，F(xiàn)=0.07885)。

圖1 各組大鼠正?；顒?dòng)時(shí)木僵反應(yīng)時(shí)間百分比Figure 1 Freezing time ratio of the rats in each group during normal activities

2.2 大鼠對(duì)CS的基礎(chǔ)反應(yīng)

各組大鼠在CS持續(xù)時(shí)間內(nèi)freezing time ratio見(jiàn)圖2，單因素方差分析結(jié)果表明，各組之間差異無(wú)顯著性(P=0.9998，F(xiàn)=0.06774)。

圖2 各組大鼠對(duì)CS的基礎(chǔ)反應(yīng)Figure 2 Basic response of the rats to CS in each group

2.3 恐懼記憶的表達(dá)

條件恐懼記憶建立后24 h各組大鼠freezing time ratio見(jiàn)表2。比較各因素的極差R，發(fā)現(xiàn)各因素影響能力排序?yàn)锳=C>B。其中5號(hào)實(shí)驗(yàn)(A2B2C3)結(jié)果最好，木僵時(shí)間達(dá)到82%，故建立大鼠條件恐懼模型最佳條件為A2B2C3，即聲音75 dB，電擊強(qiáng)度0.8 mA，循環(huán)15次；方差分析結(jié)果(表3)表明，因素C對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著影響(P< 0.05)，因素A，B對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響不顯著(P> 0.05)。因此C為主要因素，A、B為次要因素。按照方差分析觀點(diǎn)，只需對(duì)有顯著影響的因素選擇最佳水平，而其他對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小的因素，可按實(shí)際需要選擇適當(dāng)?shù)乃健Ｒ虼藢?shí)驗(yàn)中最優(yōu)條件是A2B2C3，與直觀分析結(jié)果一致。

2.4 恐懼記憶的保持

利用優(yōu)化后的實(shí)驗(yàn)參數(shù)建立條件恐懼記憶模型，在建模后的第24 h和1周時(shí)，模型組大鼠freezing time ratio與對(duì)照組比較差異具有顯著性(P< 0.001和P< 0.05)。第2周后，恐懼記憶逐漸消退，與對(duì)照組比較差異無(wú)顯著性(P> 0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及直觀分析結(jié)果Table 2 Design of the orthogonal test and results of intuitive analysis

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

注：恐懼記憶建立后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)，與對(duì)照組比較，*P< 0.05，***P< 0.001。圖3 恐懼記憶保持測(cè)試結(jié)果Note. Compared with the control group at different times after fear memories built up, *P< 0.05, ***P< 0.001.Figure 3 Results of the fear memory retention test

3 討論

建立具有較好的穩(wěn)定性和可重復(fù)性的動(dòng)物模型是研究疾病發(fā)病機(jī)制和治療藥物的前提和基礎(chǔ)。基于巴普洛夫條件反射原理的條件恐懼記憶動(dòng)物模型，廣泛用于恐懼癥、PTSD等恐懼相關(guān)性疾病的研究[5]。然而模型建立的成功與否受到諸多因素的影響，如電擊(US)的強(qiáng)度、聲音刺激(CS)強(qiáng)度及CS-US配對(duì)訓(xùn)練次數(shù)等。成功的模型以既能引起動(dòng)物產(chǎn)生明確的恐懼反應(yīng)，且又不對(duì)動(dòng)物造成生理性的傷害為目標(biāo)[6]。目前各研究室采用的實(shí)驗(yàn)條件不盡相同，雖然都能在一定程度上反映動(dòng)物的恐懼記憶，但是不同條件建立的模型的穩(wěn)定性和持續(xù)性往往存在差異，因而難以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的一致性和可靠性。宋海濱等[7]曾比較和評(píng)價(jià)了KM和C57BL/6小鼠在用不同電擊強(qiáng)度進(jìn)行訓(xùn)練時(shí)恐懼性記憶建立的差異；郭呈斌等[8]報(bào)道了足底電擊誘導(dǎo)樹(shù)鼩條件恐懼記憶模型的建立及抹除方法。但目前關(guān)于大鼠恐懼記憶建立的方法學(xué)評(píng)價(jià)，尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究在文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上[9-12]，利用正交試驗(yàn)，考察和評(píng)價(jià)了電擊(US)強(qiáng)度、聲音(CS)強(qiáng)度和CS-US配對(duì)訓(xùn)練次數(shù)3個(gè)因素在3個(gè)不同水平上對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響的。正交試驗(yàn)直觀分析表明，各因素影響能力依次為聲音強(qiáng)度=循環(huán)次數(shù)>電擊強(qiáng)度(表2)；方差分析表明，循環(huán)次數(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有顯著性影響(P< 0.05)，聲音強(qiáng)度和電擊強(qiáng)度影響不顯著(P> 0.05)(表3)。因此確定最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件為：聲音75 dB，電擊強(qiáng)度0.8 mA，CS-US配對(duì)循環(huán)訓(xùn)練15次。模型穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果表明，大鼠在1周內(nèi)恐懼記憶保持良好，與對(duì)照組比較差異顯著；2周后，恐懼記憶逐漸消退，與對(duì)照組比較差異不顯著(圖3)。

因CS-US配對(duì)訓(xùn)練次數(shù)是影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯著因素，提示我們，若要建立穩(wěn)定表達(dá)的恐懼記憶動(dòng)物模型，可以適當(dāng)增加訓(xùn)練的次數(shù)或訓(xùn)練周期。表3可見(jiàn)，電擊強(qiáng)度為1 mA時(shí)freezing time ratio最高為77%，而0.8 mA的結(jié)果為82%，提示并非電擊強(qiáng)度越大恐懼記憶表達(dá)越好，這種現(xiàn)象可能反映了應(yīng)激反應(yīng)的程度對(duì)記憶固化過(guò)程的影響，此結(jié)果與Anagnostaras等[13]的研究一致。此外，模型建立前我們還檢測(cè)了大鼠正常的活動(dòng)模式以及對(duì)CS的基礎(chǔ)恐懼反應(yīng)，考察模型的可靠性。結(jié)果可見(jiàn)，大鼠在條件恐懼建立后的freezing time ratio(表2)與正?；顒?dòng)模式(圖1)相比較有明顯提高；大鼠對(duì)CS的基礎(chǔ)反應(yīng)(圖2)與正?；顒?dòng)模式(圖1)比，無(wú)明顯變化。這些結(jié)果表明，CS-US配對(duì)訓(xùn)練后freezing time ratio的增加并非是對(duì)聲音的恐懼所導(dǎo)致的，而是條件恐懼記憶建立的結(jié)果。

綜上所述，本研究明確了建立大鼠條件恐懼記憶模型影響因素的主次，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)條件，并考察和評(píng)價(jià)了模型的穩(wěn)定性和可靠性，為條件恐懼記憶模型的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化及后續(xù)研究提供了可借鑒的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。