上調(diào)BRMS1基因抑制IL-6受體表達(dá)調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究

邢 兵 劉國紅 張國順

(河南護(hù)理職業(yè)學(xué)院,安陽 455000)

鼻咽癌是一種來源于鼻咽部黏膜上皮的惡性腫瘤，是我國頭頸部常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病隱匿，易侵襲和轉(zhuǎn)移，惡性程度較高[1]。鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展是多種因素、多種途徑、多種機(jī)制、多種基因等相互積累、綜合作用的結(jié)果[2]。尋找鼻咽癌特異的分子靶標(biāo)，對于其早期診斷及治療具有重要意義。乳腺癌轉(zhuǎn)移抑制基因1(Breast cancer metastasis suppr-essor 1，BRMS1)是研究者在乳腺癌研究中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)癌轉(zhuǎn)移抑制基因，近年來越來越多研究表明，BRMS1有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。有研究顯示，胃癌、非小細(xì)胞肺癌、肝癌等多種腫瘤中BRMS1均有抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的功能[4-6]。鼻咽癌組織及細(xì)胞BRMS1呈現(xiàn)低表達(dá)，其低表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，且低表達(dá)患者預(yù)后不良[7]；miR-346 可靶向BRMS1促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞侵襲和遷移能力[8]。但BRMS1對鼻咽癌增殖和轉(zhuǎn)移的機(jī)制研究尚未明確。IL-6是一個(gè)分子量為21～26 kD的糖蛋白，近年大量研究表明，IL-6在多種腫瘤中呈現(xiàn)異常表達(dá)，可通過與自身靶細(xì)胞的IL-6受體結(jié)合調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生發(fā)展[9]。BRMS1是否可調(diào)節(jié)IL-6受體影響鼻咽癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移尚未明確。因此，本研究旨在探討上調(diào)BRMS1基因是否可通過抑制IL-6受體影響鼻咽癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移能力。以期為BRMS1在鼻咽癌診療及研究中提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 人鼻咽癌SUNE-1細(xì)胞購自美國ATCC。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)均購自美國Gibco；MTT、DMSO均購自美國Sigma；BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA均購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；Transwell小室購自美國BD；BRMS1、IL-6、IL-6R、增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、鈣黏附素-E(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、STAT3和p-STAT3抗體均購自美國CST；酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國Biotek；質(zhì)粒購自上海索寶生物科技有限公司；LipofectamineTM2000試劑盒購自北京宜科思源科技有限公司；BALB/c裸鼠購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)研究中心。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) SUNE-1細(xì)胞常規(guī)復(fù)蘇后，用含10% FBS的新生牛血清及青鏈霉素雙抗的RPMI-1640培養(yǎng)基，在37℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)80%生長融合時(shí)進(jìn)行傳代。

1.2.2 轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分組：空白組(未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)、pcDNA3.1組和pcDNA3.1-BRMS1。轉(zhuǎn)染前1 d，將生長狀態(tài)良好的SUNE-1細(xì)胞以5×105個(gè)/孔密度接種至6孔板中，每孔2 ml，在37℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞長至80%～90%。轉(zhuǎn)染使用LipofectamineTM2000試劑盒進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，方法參照試劑盒說明。制備脂質(zhì)體與pcDNA3.1復(fù)合物，將復(fù)合物加入6孔板相應(yīng)的孔內(nèi)，輕搖混勻，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)孵育5～6 h，換為含血清的完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h后，通過Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 Western blot 收集轉(zhuǎn)染48 h的SUNE-1細(xì)胞，加適量含蛋白酶抑制劑的RIPA細(xì)胞裂解液，于冰上裂解30 min，離心，吸取上清液，上清液即為提取的總蛋白。BCA法檢測蛋白濃度。蛋白與上樣緩沖液按照1∶3比例混勻，沸水煮沸變性5 min。取變性蛋白上樣，每孔道40 μg，經(jīng)SDS-PAGE、轉(zhuǎn)PVDF膜及5%脫脂奶粉封閉，TBST液稀釋一抗，將膜與一抗溶液一同封閉于塑料袋中，37℃水浴1 h后4℃冰箱過夜，次日，棄去一抗，TBST洗膜，加TBST液稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，室溫?fù)u床孵育1～2 h，TBST洗膜，加ECL發(fā)光液，暗盒中用X光膠片曝光，拍照。Quantity one軟件分析掃描蛋白條帶的光密度數(shù)據(jù)。目的蛋白與內(nèi)參GAPDH光密度比值即為蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 MTT法檢測細(xì)胞活力 胰酶消化生長至對數(shù)期的SUNE-1細(xì)胞，完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制備成細(xì)胞懸液，以5×103個(gè)/孔密度接種細(xì)胞于96孔板，細(xì)胞達(dá)70%～80%生長融合度時(shí)，按照1.2.2方法轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置5個(gè)重復(fù)孔，轉(zhuǎn)染24、48和72 h時(shí)，每孔加10 μl 5 mg/ml的MTT溶液，常規(guī)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，在每孔中加入150 μl的DMSO溶液終止反應(yīng)，搖床低速振蕩10 min，使結(jié)晶能夠溶解充分。酶聯(lián)免疫檢測儀測定各孔在490 nm波長的吸光度值(A)。取均值，繪制細(xì)胞生長曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell法檢測細(xì)胞遷移能力 預(yù)先將實(shí)驗(yàn)組及對照組的SUNE-1細(xì)胞在37℃、5%體積分?jǐn)?shù)CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以備次日實(shí)驗(yàn)使用。Transwell小室套入24孔板，上室中加不含血清的培養(yǎng)液200 μl，37℃放置1 h。無血清培養(yǎng)基洗滌、胰酶消化及重懸細(xì)胞后，將細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×105ml-1。Transwell小室上室加入200 μl的細(xì)胞懸液，Transwell小室下室中加入500 μl含10% FBS的培養(yǎng)基。培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)18～24 h，取出小室，PBS溶液洗滌，4%多聚甲醛固定20 min，1%結(jié)晶紫染色30 min。光學(xué)顯微鏡(×200)隨機(jī)選擇5個(gè)視野(上、中、下、左和右)，進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，取每個(gè)視野均值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 將18只6周、體重20～24 g 的雄性無胸腺BALB/c裸鼠隨機(jī)分為3組進(jìn)行成瘤實(shí)驗(yàn)。將空白組、NC組和pcDNA3.1-BRMS1組細(xì)胞分別培養(yǎng)于6孔板中，PBS清洗，最終1 ml PBS含有懸浮細(xì)胞1×108個(gè)。每只鼠皮下注射懸浮細(xì)胞 100 μl，接種后定期觀察腫瘤生長情況，每周測定1次，并記錄腫瘤體積。4周后將鼠處死取材，測量腫瘤體積及腫瘤組織PCNA、E-cadenin、Vimentin、STAT3和p-STAT3的蛋白表達(dá)。實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照動物保護(hù)機(jī)構(gòu)的使用準(zhǔn)則執(zhí)行，每項(xiàng)結(jié)果均使動物傷害降至最低。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BRMS1的鼻咽癌細(xì)胞BRMS1、IL-6和IL-6R表達(dá) 如圖1和表1所示，pcDNA3.1-BRMS1轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞48 h，BRMS1蛋白表達(dá)明顯升高，IL-6和IL-6R蛋白表達(dá)均明顯降低，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而pcDNA3.1組BRMS1、IL-6和IL-6R表達(dá)與空白組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 Western blot檢測轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BRMS1的鼻咽癌細(xì)胞BRMS1、IL-6和IL-6R蛋白表達(dá)Fig.1 Expression of BRMS1,IL-6 and IL-6R were detec-ted in nasopharyngeal carcinoma cells transfected with pcDNA3.1-BRMS1 by Western blot

表1 BRMS1、IL-6和IL-6R的蛋白相對表達(dá)量

Tab.1 Relative protein expression of BRMS1,IL-6 and IL-6R

GroupsBRMS1IL-6IL-6RBlank0.032±0.0050.091±0.0100.172±0.018NC0.026±0.0040.085±0.0080.203±0.020pcDNA3.1-BRMS10.322±0.0281)0.042±0.0051)0.066±0.0071)F312.27634.01660.089P0.0000.0010.000

Note：1)P<0.05 vs blank group.

圖2 上調(diào)BRMS1表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of up-regulation of BRMS1 expression on nasopharyngeal carcinoma cell viabilityNote: *.P<0.05 vs blank group.

2.2 上調(diào)BRMS1表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞活力 如圖2所示，pcDNA3.1-BRMS1轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞24、48和72 h，細(xì)胞活力均明顯降低，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 )。

2.3 上調(diào)BRMS1表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞遷移能力 如表2所示，pcDNA3.1-BRMS1轉(zhuǎn)染鼻咽癌細(xì)胞48 h，細(xì)胞侵襲能力明顯降低，與空白組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 )。

2.4 上調(diào)BRMS1表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞增殖及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖3和表3所示，與空白組比較，pcDNA3.1-BRMS1組PCNA和Vimentin表達(dá)明顯降低，E-cadenin表達(dá)明顯升高(P<0.05)。

2.5 上調(diào)BRMS1表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞STAT3信號通路 如圖4和表4所示，與空白組比較，pcDNA3.1-BRMS1組中p-STAT3蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，3組間STAT3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.6 上調(diào)BRMS1表達(dá)可抑制鼻咽癌小鼠模型腫瘤生長 如圖5A所示，從第3周起，pcDNA3.1-BRMS1組小鼠腫瘤體積與空白組腫瘤體積有較大差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。Western blot檢測第4周小鼠腫瘤組織PCNA、E-cadenin、Vimen-tin、STAT3和p-STAT3的蛋白表達(dá)，結(jié)果圖5B和表5所示，與空白組比較，pcDNA3.1-BRMS1組PCNA、Vimentin和p-STAT3表達(dá)均明顯降低，E-cadenin表達(dá)明顯升高(P<0.05)，3組間STAT3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 上調(diào)BRMS1表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞遷移能力的影響

Tab.2 Effect of up-regulation of BRMS1 expression on migration of nasopharyngeal carcinoma cells

GroupsCell invasionBlank222.3±11.4NC219.7±10.6pcDNA3.1-BRMS1152.8±8.11)F45.364P0.000

Note：1)P<0.05 vs blank group.

圖3 Western blot檢測pcDNA3.1-BRMS1轉(zhuǎn)染后鼻咽癌細(xì)胞增殖及EMT相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.3 Proliferation- and EMT-related protein expression of nasopharyngeal carcinoma cells transfected with pcDNA3.1-BRMS1 were detected by Western blot

表3 PCNA、E-cadenin和Vimentin的蛋白相對表達(dá)量

Tab.3 Relative expression of PCNA,E-cadenin and Vim-entin protein

GroupsPCNAE-cadeninVimentinBlank0.613±0.0560.078±0.0090.333±0.036NC0.522±0.0580.084±0.0100.352±0.031pcDNA3.1-BRMS10.341±0.0391)0.257±0.0241)0.106±0.0121)F21.511122.86570.225P0.0020.0000.000

Note：1)P<0.05 vs blank group.

圖4 pcDNA3.1-BRMS1對鼻咽癌細(xì)胞STAT3信號通路的影響Fig.4 Effects of pcDNA3.1-BRMS1 on STAT3 signaling pathway in nasopharyngeal carcinoma cells

表4 STAT3和p-STAT3的蛋白相對表達(dá)量

Tab.4 Relative protein expression of STAT3 and p-STAT3

GroupsSTAT3p-STAT3Blank0.472±0.0510.089±0.012NC0.452±0.0460.063±0.010pcDNA3.1-BRMS10.485±0.0530.021±0.0041)F0.33140.754P0.7310.000

Note：1)P<0.05 vs blank group.

圖5 pcDNA3.1-BRMS1對鼻咽癌小鼠腫瘤生長及腫瘤組織STAT3信號通路蛋白表達(dá)影響Fig.5 Effects of pcDNA3.1-BRMS1 on tumor growth and expression of STAT3 signaling pathway protein in nasopharyngeal carcinoma mice

表5 PCNA、E-cadenin、Vimentin、STAT3和p-STAT3的蛋白相對表達(dá)量

Tab.5 Relative protein expression levels of PCNA,E-cadenin,Vimentin,STAT3 and p-STAT3

GroupsSTAT3p-STAT3PCNAE-cadeninVimentinBlank0.543±0.0470.066±0.0080.412±0.0380.073±0.0100.302±0.026NC0.531±0.0420.071±0.0080.405±0.0340.068±0.0080.294±0.023pcDNA3.1-BRMS10.556±0.0480.023±0.0051)0.162±0.0201)0.339±0.0381)0.183±0.0211)F0.22440.96160.799134.53524.191P0.8060.0000.0000.0000.001

Note：1)P<0.05 vs blank group.

3 討論

惡性腫瘤的發(fā)病率越來越高，給人類的生命健康造成嚴(yán)重威脅。轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤獨(dú)有生物學(xué)特性，也是腫瘤致死的一個(gè)主要原因[10]。轉(zhuǎn)移發(fā)生是一個(gè)多基因、多階段、多因素參與調(diào)控的復(fù)雜過程，目前發(fā)現(xiàn)的單獨(dú)負(fù)責(zé)腫瘤轉(zhuǎn)移的基因較少。鼻咽癌是常見的惡性腫瘤之一，局部復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是其治療失敗的主要原因[11]。因此，從因子方向?qū)ふ抑委熌[瘤轉(zhuǎn)移的途徑具有重要意義。BRMS1是一個(gè)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因，定位于人11q13.1～13.2染色體，與多種腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)[12]。臨床研究分析表明，BRMS1基因低表達(dá)患者預(yù)后及生存率明顯低于高表達(dá)患者[13]。黑色素瘤、乳腺癌等腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)染BRMS1可明顯抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[14,15]；干擾BRMS1表達(dá)可促進(jìn)卵巢癌等腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力[16]。以上研究提示BRMS1在腫瘤轉(zhuǎn)移中具有重要作用。

IL-6是一種多功能的調(diào)控分子，參與多種腫瘤細(xì)胞生長和分化過程[17]。已有研究顯示，IL-6及其受體在鼻咽癌、肝癌、肺癌等多種腫瘤中均存在上調(diào)表達(dá)，血清IL-6表達(dá)與腫瘤預(yù)后相關(guān)[18-20]。因此，有很多研究推測，惡性腫瘤可通過影響生物體微環(huán)境變化，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，進(jìn)而激活相關(guān)信號通路，從而影響腫瘤進(jìn)展。有研究顯示，IL-6上調(diào)可激活結(jié)腸癌細(xì)胞STAT3磷酸化過程，增加內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化[21]；人鼻咽癌基因可通過抑制NF-κB和STAT3信號通路抵抗IL-6對鼻咽癌發(fā)生發(fā)展的促進(jìn)作用[22]；IL-6R的靶向抗體和JAK1/STAT3信號通路可抑制多種腫瘤的進(jìn)展[23]。以上研究提示，抑制IL-6、IL-6R及STAT3信號通路可減緩腫瘤進(jìn)展。BRMS1是否可影響IL-6、IL-6R及STAT3信號通路尚未清楚。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)BRMS1表達(dá)可抑制鼻咽癌細(xì)胞IL-6、IL-6R及p-STAT3表達(dá)，抑制細(xì)胞的活力和遷移能力。提示上調(diào)BRMS1表達(dá)可通過抑制IL-6、IL-6R及STAT3信號通路降低鼻咽癌細(xì)胞生長。

STAT3是JAK/STAT家族重要成員，在人類正常組織活性中受嚴(yán)格控制，在多種腫瘤中被激活，其激活可進(jìn)一步促進(jìn)增殖、侵襲、遷移等下游相關(guān)功能基因表達(dá)，從而引起腫瘤的發(fā)生發(fā)展[24]。PCNA是反映細(xì)胞增殖的一個(gè)重要指標(biāo)，在多種惡性腫瘤中均呈現(xiàn)陽性表達(dá)，其表達(dá)可促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[25]。EMT參與腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，EMT產(chǎn)生時(shí)，E-cadherin等上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白減少，Vimentin、N-cadherin等間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白呈現(xiàn)過表達(dá)[26]。已有研究表明，抑制EMT可降低鼻咽癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力[27]；滯蛋白(CulLIN)可通過靶向BRMS1促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和EMT[28]。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)BRMS1表達(dá)可下調(diào)PCNA和Vimentin表達(dá)，上調(diào)E-cadherin表達(dá)。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)也表明上調(diào)BRMS1表達(dá)可下調(diào)PCNA和Vimentin表達(dá)，上調(diào)E-cadherin表達(dá)，這一結(jié)果提示BRMS1對鼻咽癌增殖轉(zhuǎn)移的影響機(jī)制可能與抑制IL-6、IL-6R及STAT3信號通路、進(jìn)而抑制PCNA表達(dá)及EMT有關(guān)。

綜上所述，上調(diào)BRMS1表達(dá)可抑制IL-6受體，下調(diào)STAT3信號，進(jìn)而抑制鼻咽癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力。本研究為BRMS1在鼻咽癌機(jī)制研究中提供了一定的理論基礎(chǔ)。