shRNA干擾BAMBI對非小細胞肺癌生長、侵襲和遷移的調控作用①

王學中 劉志廣 劉 平

(新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院胸瘤一科，新鄉(xiāng)453003)

原發(fā)性肺癌是常見的惡性腫瘤之一，是發(fā)病率和死亡率最高的癌癥。據(jù)統(tǒng)計，全球每年新增肺癌病例約為180萬，死亡人數(shù)約為1.5萬。肺癌可以分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中非小細胞肺癌約占肺癌的80%～85%[1]。非小細胞肺癌病情發(fā)展迅速，轉移速度快，大部分患者在確診時已發(fā)展至中晚期，導致患者手術治療機會減少且術后復發(fā)率高[2,3]。由于非小細胞肺癌對放療和化療不敏感，使患者5年生存率低，處于Ⅲ期和Ⅳ期的患者5年生存率低于10%。為提高治療效果，增加患者生存時間，研究有效的治療手段有著重要的臨床意義。小發(fā)夾RNA(small hairpin RNA,shRNA)是序列特異性誘導細胞基因表達沉默的RNA干擾技術，具有抑制效率高、作用時間長的特點，廣泛用于基因功能、腫瘤治療的研究當中[4]。骨形成蛋白和激活素的穿膜抑制劑(Bone morphogenetic protein and activin membrane-bound inhibitor,BAMBI)是與轉化生長因子β家族1型受體相關的跨膜糖蛋白，參與多種與細胞發(fā)育和疾病相關的過程。研究發(fā)現(xiàn)過表達BAMBI能促進乳腺癌、胃癌、神經(jīng)膠質瘤等多種腫瘤的發(fā)展[5-7]，但BAMBI在非小細胞肺癌中的功能和作用機制有待進一步研究。本文研究shRNA干擾BAMBI細胞后對非小細胞肺癌A549細胞生長、侵襲和遷移的影響及其調控機制。

1 材料與方法

1.1 材料 非小細胞肺癌A549細胞株購自美國ATCC公司；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰酶均購自Hyclone公司；BAMBI-shRNA載體和shRNA Scramble購自上海吉瑪制藥技術公司；RNA提取試劑盒購自天根生化科技；TurboFect Transfection Regent脂質體轉染試劑、反轉錄試劑盒購自Thermo Fisher Scientific；CCK-8購自日本同仁化學產(chǎn)品；Ki67、Bax、VEGF、MMP-9、TGF-β、cl-caspase-3、Smad2和p-Smad2抗體購自美國Abcam公司；Transwell小室和人工基底膜購自美國BD公司產(chǎn)品。BALB/c裸鼠，4～6周，(18±2)g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、Annexin V-FITC/PI凋亡檢測試劑盒、TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒、免疫組化試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；引物使用Primer 5.0軟件設計，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 非小細胞肺癌A549的培養(yǎng)與轉染 取A549細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2。當單層細胞覆蓋率達90%左右時傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。當細胞匯合度達50%左右時，shRNA和Lipofectamin2000按照比例充分混勻，滴加到細胞培養(yǎng)液中，混合均勻后繼續(xù)培養(yǎng)，利用相應抗生素篩選穩(wěn)定表達的細胞株用于后續(xù)實驗。

1.2.2 qRT-PCR 根據(jù)RNA提取試劑盒說明書提取各組細胞中的總RNA，使用Nanodrop2000檢測RNA的濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測。取1 μg RNA反轉錄為cDNA，反轉錄完成后取20 ng產(chǎn)物進行qRT-PCR反應。程序設置如下：94℃反應4 min，隨后94℃ 30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s共40個循環(huán)。檢測DNA濃度，使用SDS1.3分析相對表達水平。BAMBI正向引物為：5′-CTAGAGAAGCAGGCGCT-GAG-3′；反向引物為：5′-ATCGCCACTCCAGCTA-CATC-3′。

1.2.3 蛋白質印跡 收集細胞，PBS洗3次后，使用含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液冰上充分裂解，4℃離心機中以15 000 r/min離心15 min，上清即為總蛋白。BCA法測蛋白濃度后，加蛋白上樣緩沖液制作蛋白樣品。每孔加30 μg蛋白樣品使用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，隨后轉至PVDF膜。用5%脫脂牛奶的TBST室溫下封閉2 h。4℃孵育一抗過夜，TBST洗膜3次，每次10 min；加辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min；使用Bio-Rad成像系統(tǒng)檢測成像并分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.2.4 CCK-8 用胰酶將細胞消化為單細胞懸液，離心收集，將細胞的濃度調整為5×104個/ml，取100 μl細胞懸液至培養(yǎng)孔中，設置空白對照組，每組細胞設置3個復孔，預培養(yǎng)24、48、72、96 h后，向每孔中加10 μl的CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標儀下檢測490 nm處的吸光度。

1.2.5 流式細胞術 收集細胞，以1 000 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)基后用PBS洗3次，用1×Binding 緩沖液制成1×107個/ml細胞懸液。取100 μl細胞懸液，加2 μl Annexin-V-FITC，輕輕搖勻，冰上避光放置15 min；轉移至流式檢測管，加入400 μl PBS，每個樣品上機前加1 μl PI(50 μg/ml)。以不加Annexin-V-FITC及PI的樣本作為陰性對照。

1.2.6 劃痕實驗 取轉染后24 h的A549細胞，調整細胞密度為1×106個/ml，每孔中加2 ml細胞懸液，培養(yǎng)箱中過夜待細胞貼壁。當單層細胞覆蓋率達90%左右時，用10 μl槍尖垂直于培養(yǎng)板平行劃5道直線，PBS洗3次以清除細胞碎片。加無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。倒置顯微鏡下觀察0 h和24 h時劃痕閉合情況并拍照，使用Image J分析計算劃痕閉合率。劃痕閉合率%=[(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/(0 h 劃痕面積)]×100%。

1.2.7 體外侵襲實驗 將shRNA BAMBI和shRNA scramble轉染A549細胞，24 h后收集細胞做體外侵襲實驗。無血清培養(yǎng)基與Matrigel按照6∶1混勻，取100 μl至上室，37℃孵育至基質膠變?yōu)楣虘B(tài)。胰酶消化細胞，用PBS洗2次，無血清培養(yǎng)基稀釋至細胞濃度為1×105個/ml，取200 μl細胞懸液至上室，下室中加500 μl含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。正常條件下培養(yǎng)24 h后，用棉簽擦取上層細胞，染色后隨機選擇5個視野觀察并計數(shù)。

1.2.8 荷瘤裸鼠的分組和處理 將30只雄性裸鼠分為A549組、Scramble組和BAMBI shRNA組，每組10只。取各組細胞懸液，調整細胞密度至2×107個/ml，接種于各組裸鼠背部。每隔5 d測腫瘤體積，接種后20 d處死裸鼠。在實驗過程中A549 組有4只裸鼠死亡，Scramble組出現(xiàn)3只死亡，BAMBI shRNA組有1只出現(xiàn)死亡。

1.2.9 TUNEL染色 取腫瘤組織，制作石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水；切片浸入0.1 mol/L pH6.0檸檬酸緩沖液中，微波爐中處理5 min，PBS洗2次；加反應液至濕盒中37℃暗反應1 h，PBS洗3次；玻片干后加POD至切片上，濕盒中37℃反應30 min，PBS洗3次；加DAB室溫下反應10 min后，復染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。光學顯微鏡下觀察并隨機選擇5個視野拍照，使用Image J分析。

1.2.10 免疫組化 取部分腫瘤組織，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。3%過氧化氫于室溫下孵育10 min；切片置于枸櫞酸鹽緩沖液中，95℃左右持續(xù)10 min后室溫冷卻；PBS洗3次，5%BSA封閉液37℃孵育30 min；滴加一抗，37℃孵育1 h；PBS洗3次；加生物素標記的抗體，37℃孵育30 min；PBS洗3 次，加SABC，37℃孵育30 min；PBS洗3次，顯微鏡下顯色并控制反應時間，蘇木素復染后脫水透明，中性樹膠封片。使用軟件Image J分析陽性細胞占比。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用統(tǒng)計學軟件SPSS18.0進行數(shù)據(jù)處理，組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.01為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 shRNA對BAMBI mRNA和蛋白表達水平的影響 將shRNA載體轉染至A549細胞后，qRT-PCR檢測細胞中BAMBI mRNA的表達水平，實驗結果顯示Scramble組BAMBI的mRNA水平與A549組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義；shRNA BAMBI組BAMBI的mRNA表達水平明顯低于Scramble組(圖1A，P<0.01)。Western blot結果也顯示，Scramble組BAMBI蛋白表達水平與A549組相比，差異沒有統(tǒng)計學意義；shRNA BAMBI組的BAMBI蛋白表達明顯低于Scramble組(圖1B，P<0.01)。說明shRNA空載不影響B(tài)AMBI的mRNA和蛋白表達；shRNA BAMBI成功干擾A549細胞中BAMBI的mRNA和蛋白的表達。

2.2 干擾BAMBI抑制A549細胞的增殖 CCK-8檢測結果顯示，在轉染4 d后shRNA BAMIBI組細胞增殖倍數(shù)明顯低于Scramble組(圖2，P<0.01)，實驗結果表明shRNA干擾BAMBI能降低非小細胞肺癌A549的增殖能力。

2.3 干擾BAMBI誘導A549細胞的凋亡 在轉染BAMBI-shRNA后，流式細胞儀檢測各組細胞的凋亡情況。實驗結果顯示，shRNA BAMBI組細胞凋亡的比率明顯高于Scramble組(圖3，P<0.01)，結果表明shRNA干擾BAMBI可誘導非小細胞肺癌A549細胞凋亡。

2.4 干擾BAMBI抑制A549細胞遷移 劃痕實驗結果顯示，shRNA BAMBI組劃痕愈合率明顯低于Scramble組(圖4，P<0.01)，表明shRNA干擾BAMBI抑制非小細胞肺癌A549細胞的遷移。

圖1 shRNA干擾后A549細胞中BAMBI mRNA和蛋白的表達水平Fig.1 mRNA and protein expression level of BAMBI in A549 cells after shRNA interferenceNote: A.qRT-PCR detection result；B.Western blot detection result；**.P<0.01 versus scramble group；n=3.

圖2 CCK-8檢測shRNA干擾BAMBI對A549細胞增殖的影響Fig.2 Effect of shRNA interfering BAMBI on proliferat-ion of A549 cells was detected by CCK-8Note: **.P<0.01 versus scramble group；n=3.

2.5 干擾BAMBI抑制A549細胞侵襲 體外侵襲實驗檢測各組細胞的侵襲能力，實驗結果顯示，shRNA BAMBI組平均每個視野下發(fā)生侵襲的細胞數(shù)目明顯少于Scramble組(圖5，P<0.01)，實驗結果表明shRNA干擾BAMBI可抑制非小細胞肺癌A549的侵襲能力。

2.6 干擾BAMBI對增殖、凋亡、遷移相關蛋白表達的影響 Western blot檢測各組細胞中增殖、凋亡和遷移相關蛋白的表達。實驗結果顯示，shRNA BAMBI組與Scramble組相比，細胞中Ki67、VEGF和MMP-9的表達水平顯著降低，而Bax和cl-caspase-3的表達水平顯著升高(圖6，P<0.01)。

圖3 流式細胞術檢測shRNA干擾BAMBI對A549細胞凋亡的影響

Fig.3 Effect of shRNA interfering BAMBI on apoptosis of A549 cells was detected by flow cytometry

Note: **.P<0.01 versus scramble group；n=3.

圖4 劃痕實驗檢測shRNA干擾BAMBI對A549細胞遷移的影響

Fig.4 Effect of shRNA interfering BAMBI on migration of A549 cells was examined by wound healing

Note: **.P<0.01 versus scramble group；n=3.

2.7 干擾BAMBI激活TGF-β通路 實驗進一步探究shRNA干擾BAMBI后非小細胞肺癌A549生物學特性發(fā)生改變的潛在分子機制，Western blot檢測TGF-β通路相關蛋白的表達。實驗結果顯示，shRNA BAMBI組細胞中TGF-β和p-Smad2的表達水平顯著高于Scramble組，且細胞中p-Smad2/Smad2的比值明顯升高(圖7，P<0.01)。可見shRNA干擾BAMBI后增強TGF-β的表達，提高Smad2的磷酸化水平，進而激活TGF-β信號通路。

2.8 shRNA干擾BAMBI對A549移植瘤生長和轉移的影響 結果顯示，與Scramble組相比，shRNA BAMBI組移植瘤體積明顯降低，腫瘤組織中BAMBI mRNA表達水平降低，凋亡細胞明顯增加，VEGF的表達水平顯著降低(圖8，P<0.01)。

圖5 體外侵襲實驗檢測shRNA干擾BAMBI對A549細胞侵襲的影響

Fig.5 Effect of shRNA interfering BAMBI on invasion of A549 cells was measured by transwell

Note: **.P<0.01 versus scramble group；n=3.

圖6 蛋白質印跡檢測增殖、凋亡和遷移相關蛋白的表達水平Fig.6 Expression of proliferation,apoptosis and migrat-ion related proteins were detected by Western blotNote: **.P<0.01 versus scramble group；n=3.

圖7 shRNA干擾BAMBI對TGF-β通路相關蛋白表達的影響Fig.7 Effect of shRNA interfering BAMBI on expression of TGF-β pathway related proteinsNote: **.P<0.01 versus scramble group；n=3.

圖8 shRNA干擾BAMBI后對A549移植瘤生長和轉移的影響Fig.8 Effect of shRNA interference with BAMBI on growth and metastasis of A549 transplanted tumorNote: A.Tumor volume；B.Relative mRNA level of BAMBI；C.TUNEL staining(×400)；D.Immunological histological chemistry(×400)；**.P<0.01 versus scramble group；n=6.

3 討論

BAMBI與轉化生長因子受體胞外結合區(qū)的結構相似，能同TGF-β受體(TβR)-Ⅰ競爭性地結合TβR-Ⅱ，由于BAMBI缺乏胞內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸激酶結構域，無法磷酸化胞內(nèi)的Smad蛋白，使TGF-β通路受阻。在卵巢癌細胞中高表達BAMBI可顯著增加細胞的增殖和遷移能力，抑制細胞的凋亡[8]。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、胰腺癌等腫瘤組織中BAMBI呈現(xiàn)高表達[9,10]。苗參等[11]檢測臨床非小細胞肺癌腫瘤組織樣本，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中BAMBI的mRNA水平和蛋白水平均顯著高于周圍正常組織，提示BAMBI的過表達與非小細胞肺癌的發(fā)生相關。

shRNA抑制非小細胞肺癌生長和轉移已有大量報道，如shRNA干擾Cyclin D1和Bcl-2抑制非小細胞肺癌增殖，誘導細胞凋亡[12]；組蛋白去乙?；?(Histone deacetylase 1，HDAC1)經(jīng)shRNA干擾后，抑制非小細胞肺癌的侵襲[13]。A549細胞在轉染shRNA BAMBI后，細胞中BAMBI的mRNA和蛋白表達水平顯著降低，提示shRNA BAMBI轉染成功，并且具有較高的干擾效果。接下來探討B(tài)AMBI經(jīng)shRNA干擾后對非小細胞肺癌A549生物學特性的影響。

腫瘤的發(fā)生是多階段、多基因協(xié)同作用的復雜過程，細胞增殖和凋亡異常使腫瘤細胞具有無限增殖的能力。miRNA使BAMBI下調后,黑色素瘤小鼠腫瘤組織中細胞增殖能力降低，而細胞凋亡數(shù)目明顯增加[14]。本文研究結果顯示，shRNA干擾BAMBI后，A549細胞增殖倍數(shù)顯著降低，而凋亡細胞的比率顯著升高。腫瘤細胞的生長受細胞增殖和凋亡的共同影響。Ki67是存在于增殖細胞的核抗原，常用于檢測腫瘤細胞增殖能力。Bax是Bcl-2家族中重要的促凋亡蛋白，在多數(shù)腫瘤細胞中Bax低表達，而且Bax的表達與非小細胞肺癌的預后密切相關[15]。Western blot結果顯示shRNA干擾BAMBI后，細胞中Ki67的表達水平顯著降低，而Bax的表達水平顯著升高，該結果與前面研究結果一致，表明shRNA干擾BAMBI后抑制非小細胞肺癌A549的生長。

非小細胞肺癌難以治愈的重要原因是其具有較強的侵襲和轉移能力，易發(fā)生轉移的部位有骨組織、淋巴、腦等。出現(xiàn)轉移的患者，由于身體虛弱，不宜進行損傷大的手術治療和放化療治療。shRNA干擾BAMBI后，A549細胞的侵襲能力和遷移能力均明顯減弱。Zhou等[16]使用siRNA技術抑制BAMBI的水平后，人骨肉瘤細胞的增殖和侵襲能力明顯降低。Zhang等[17]研究也發(fā)現(xiàn)，BAMBI在胃癌細胞中高表達，與Smad相互作用后促進胃癌細胞的侵襲。血管內(nèi)皮生長因子與腫瘤的血管生成密切相關，在腫瘤的細胞外基質變性和遷移等過程中發(fā)揮著重要作用[18]。MMP-9是基質金屬蛋白酶家族中的重要一員，能降解細胞外基質的主要成分Ⅳ型膠原蛋白，破壞腫瘤細胞侵襲的組織學屏障，促進腫瘤細胞侵襲[19]。Western blot結果顯示shRNA干擾BAMBI后，細胞中VEGF和MMP-9的表達水平顯著降低。實驗結果表明，shRNA BAMBI抑制非小細胞肺癌的侵襲和遷移。

TGF-β參與調控多種細胞生物學行為，如細胞生長、分化、凋亡和免疫防御。在腫瘤發(fā)展的早期TGF-β作為腫瘤抑制基因，抑制腫瘤細胞的增殖[20,21]。shRNA干擾BAMBI后，TGF-β的表達水平顯著升高，磷酸化Smad2的表達水平也顯著增加，提示TGF-β/Smad2通路被激活。BAMBI是TGF-β的假受體，抑制TGF-β通路的激活和信號傳遞。shRNA干擾BAMBI后，BAMBI蛋白表達水平顯著降低，進而解除對TGF-β通路的抑制，提示shRNA干擾BAMBI對非小細胞肺癌A549生物學特性產(chǎn)生影響的作用機制可能與TGF-β/Smad2通路激活相關。最新研究發(fā)現(xiàn)，BAMBI參與Wnt/β-catenin通路調節(jié)腫瘤細胞的增殖和轉移。細胞的調節(jié)往往涉及多種信號通路的參與，shRNA干擾BAMBI后是否僅通過影響TGF-β通路而發(fā)揮作用仍需要進一步的實驗去驗證。

綜上所述，本實驗從細胞和動物水平上闡述了shRNA干擾BAMBI后，對非小細胞肺癌生長、侵襲和遷移能力的抑制作用，以及其潛在的作用機制；為非小細胞肺癌的臨床治療提供一定的理論基礎。