藏紅花素通過(guò)HIF-1α/VEGF通路對(duì)缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞血管新生的抑制作用

閆義濤 王曉麗 谷圓圓 任艷凡 胡俊喜

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院眼科，新鄉(xiāng)453003)

失明或視力障礙嚴(yán)重影響人類生活質(zhì)量。視網(wǎng)膜血管新生是造成早產(chǎn)兒視網(wǎng)膜病變、糖尿病視網(wǎng)膜病變、老年性黃斑變性等各個(gè)年齡階段眼病致盲及視力障礙的主要原因[1,2]。大量研究揭示了抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)療法對(duì)視網(wǎng)膜疾病的療效[3]。但目前的抗VEGF藥物成本效益并不理想，且會(huì)產(chǎn)生眼部或全身性的副作用，如眼內(nèi)炎、眼內(nèi)出血和視網(wǎng)膜脫離、心肌梗死、中風(fēng)等[4-6]。開(kāi)發(fā)安全有效的眼病治療方法迫在眉睫。長(zhǎng)期以來(lái)藏紅花因具有抗氧化，抗炎及免疫調(diào)節(jié)等生物活性而被作為多種疾病的治療藥物[7,8]。藏紅花素(化學(xué)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1)是藏紅花的主要成分，是一種類胡蘿卜素衍生物，有利于神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病及癌癥的治療[9-12]。據(jù)報(bào)道藏紅花素還具有保護(hù)缺血再灌注誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷功能[13]。但藏紅花素對(duì)視網(wǎng)膜細(xì)胞血管新生的作用還有待進(jìn)一步研究。本文的主要目的是通過(guò)氯化鈷處理視網(wǎng)膜色素上皮(Retinal pigment epithelial,RPE)細(xì)胞建立缺氧模型，探索藏紅花素對(duì)缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞血管新生的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 RPE細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection,ATCC)。培養(yǎng)基 DMEM及胎牛血清購(gòu)自賽默飛世爾科技公司。藏紅花素和氯化鈷購(gòu)自Sigma公司。MTT購(gòu)自上海生工。血管生成載玻片購(gòu)自德國(guó)Ibidi公司。Matrigel膠購(gòu)自BD公司?？笻IF-1α抗體、鼠抗VEGF抗體、鼠抗鼠VEGR2抗體和兔抗P-P38抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與藥物處理 RPE細(xì)胞在添加了10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞增殖到約80%時(shí)進(jìn)行傳代。RPE細(xì)胞分為5組：對(duì)照組(RPE)、缺氧組(CoCl2)、藏紅花素組(CoCl2+5、10、25 μmol/L藏紅花素)。缺氧組用200 mmol/L的CoCl2處理。藏紅花素組用200 mmol/L的CoCl2聯(lián)合5、10、25 μmol/L藏紅花素進(jìn)行處理。對(duì)照組用DMSO處理。

1.2.2 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 按照上述分組對(duì)RPE細(xì)胞進(jìn)行處理后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在各個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)加入MTT溶液孵育4 h，棄上清后加入DMSO振蕩10 min溶解結(jié)晶物。最后570 nm處檢測(cè)吸光值。

1.2.3 流式分選檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物CD31和CD34水平 首先收集各組細(xì)胞并制成1×106個(gè)/ml的細(xì)胞懸液，然后分別加入鼠抗CD31或鼠抗CD34抗體孵育30 min，漂洗后加入異硫氰酸(Fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的鼠二抗孵育30 min。最后將經(jīng)過(guò)染色標(biāo)記的上述細(xì)胞放入流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.2.4 血管生成實(shí)驗(yàn) 首先將Matrigel膠放入4℃冰箱過(guò)夜以便將其緩慢融化。第2天將融化的Matrigel膠加入血管生成載玻片中，放入培養(yǎng)箱中包被30 min。然后將各組細(xì)胞制成6×104個(gè)/ml的細(xì)胞懸液加入到血管生成載玻片中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。最后取出顯微鏡下拍照并統(tǒng)計(jì)微管長(zhǎng)度和分支數(shù)。

圖1 藏紅花素化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig.1 Chemical structure of crocin

1.2.5 蛋白印跡 首先用PBS將細(xì)胞清洗3次后，加入添加了蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液進(jìn)行裂解提取總蛋白，100℃變性5 min。然后等量的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，接著5%的BSA封閉1 h后加入相應(yīng)的一抗，4℃過(guò)夜孵育，最后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。接著加入發(fā)光液置于凝膠成像儀進(jìn)行曝光拍照并統(tǒng)計(jì)灰度值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)。P<0.05表示存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 藏紅花素對(duì)RPE細(xì)胞活力的影響 不同濃度(0.1、0.25、0.5、1、2.5、5、10、25、50、100 μmol/L)的藏紅花素處理RPE細(xì)胞后，利用MTT檢測(cè)細(xì)胞毒性。圖2 顯示，藏紅花素小于25 μmol/L時(shí)對(duì)RPE細(xì)胞無(wú)明顯毒性，細(xì)胞存活率大于80%。藏紅花素大于25 μmol/L后，細(xì)胞存活率顯著降低(P<0.05)，細(xì)胞存活率低于80%。選擇無(wú)毒性的3個(gè)濃度(5、10、25 μmol/L)的藏紅花素進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 藏紅花素可抑制缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞增殖 通過(guò)MTT檢測(cè)藏紅花素對(duì)缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞增殖能力的影響。如圖3所示，缺氧組RPE細(xì)胞增殖明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。藏紅花素(10、25 μmol/L) 處理可明顯降低缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞增殖的升高(P<0.05)。結(jié)果表明，藏紅花素(10、25 μmol/L)處理會(huì)抑制缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞增殖。

圖2 藏紅花素對(duì)RPE細(xì)胞活力的影響Fig.2 Effect of crocin on cell viability of RPENote: *.P<0.05 vs 1 μmol/L.

2.3 藏紅花素會(huì)降低缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞中血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá) 為分析藏紅花素對(duì)缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞中血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物的影響，利用流式分選技術(shù)檢測(cè)RPE細(xì)胞中CD31和CD34水平。由圖4可知，缺氧組CD31和CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目明顯多于對(duì)照組(P<0.05)。5 μmol/L的藏紅花素處理可降低缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞中CD31陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的增多(P<0.05)。10、25 μmol/L藏紅花素會(huì)減少缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞中CD31和CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目(P<0.05)。由此可見(jiàn)，藏紅花素可降低缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞中CD31和CD34分泌。

圖3 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖Fig.3 Cell proliferation was detected by MTTNote: *.P<0.01 vs control group;#.P<0.05 vs hypoxia group.

2.4 藏紅花素可減弱缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞血管新生 采用血管生成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)微管長(zhǎng)度和分支數(shù)，探究藏紅花素對(duì)缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞血管新生能力的影響。圖5顯示，缺氧會(huì)造成RPE細(xì)胞血管新生過(guò)程中微管長(zhǎng)度變長(zhǎng)和分支數(shù)變多(P<0.05)。10、25 μmol/L藏紅花素處理會(huì)抑制缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞血管新生過(guò)程中微管長(zhǎng)度和分支數(shù)(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，10、25 μmol/L藏紅花素可減弱缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞血管新生能力。

2.5 藏紅花素對(duì)血管新生相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 為分析藏紅花素影響缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞血管新生的分子機(jī)制，蛋白印跡檢測(cè)血管新生相關(guān)蛋白HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38表達(dá)。由圖6可知，缺氧組HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38蛋白水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。與缺氧組相比，5 μmol/L的藏紅花素組VEGR2蛋白水平明顯降低；10、25 μmol/L藏紅花素組HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38蛋白水平則明顯下降(P<0.05)。由此可見(jiàn)，藏紅花素處理會(huì)抑制缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞血管新生相關(guān)蛋白HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38蛋白表達(dá)水平。

圖4 流式分選檢測(cè)CD31和CD34水平Fig.4 Levels of CD31 and CD34 were tested by flow cytometerNote: *.P<0.01vs control group；#.P<0.05 vs hypoxia group.

圖5 Matrigel實(shí)驗(yàn)檢測(cè)血管生成Fig.5 Angiogenesis was measured by Matrigel assayNote: *.P<0.01 vs control group；#.P<0.05 vs hypoxia group.

圖6 蛋白印跡檢測(cè)血管新生相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.6 Expression of angiogenesis related proteins was tested by Western blotNote: *.P<0.01 vs control group；#.P<0.05 vs hypoxia group.

3 討論

據(jù)調(diào)查，2010年全世界有3 240萬(wàn)人失明，19 100萬(wàn)人患有中度或重度視力障礙[14]。由于人口老齡化的加劇，預(yù)計(jì)未來(lái)全球各種眼病負(fù)擔(dān)會(huì)不斷加大，且治療費(fèi)用也將上升[15-17]。眼病治療是公共衛(wèi)生健康系統(tǒng)的重大課題。研究表明許多植物提取物在各種疾病方面發(fā)揮著重要作用[18,19]。

研究表明RPE細(xì)胞不受控的增殖會(huì)激發(fā)視網(wǎng)膜血管新生[20]。大量文獻(xiàn)報(bào)道多種植物提取物具有抑制細(xì)胞異常增殖的功能。有數(shù)據(jù)顯示草藥三果寶的主要活性物質(zhì)訶子鞣質(zhì)和柯黎勒酸可抑制TGFβ1誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19增殖[21]。據(jù)報(bào)道白藜蘆醇可抑制缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞RF/6A增殖的升高[22]。有研究發(fā)現(xiàn)藏紅花素具有降低肺癌細(xì)胞A549 和SPC-A1增殖的功效[23]。有數(shù)據(jù)顯示藏紅花素可抑制白血病Jurkat細(xì)胞增殖[24]。Lu等[25]發(fā)現(xiàn)藏紅花素會(huì)減弱乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖能力。本文結(jié)果表明，藏紅花素處理可降低缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞增殖。

據(jù)報(bào)道內(nèi)皮組細(xì)胞向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的過(guò)程中CD31和CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目會(huì)增加，CD31和CD34常被用作血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，衡量血管新生[26]。許多植物提取物在抑制各類疾病的血管內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物分泌方面發(fā)揮著積極作用。Zhou等[27]研究顯示金銀花提取物可降低糖尿病視網(wǎng)膜病變小鼠視網(wǎng)膜CD31的分泌。據(jù)報(bào)道富含番茄紅素的番茄提取物可抑制亞硝基二乙基胺誘導(dǎo)的肝癌小鼠CD31釋放[28]。有數(shù)據(jù)顯示圓柏提取物可降低肝癌腫瘤組織中CD31的水平[29]。有研究表明鼓槌石斛的乙醇提取物可減弱糖尿病大鼠視網(wǎng)膜CD31的分泌[30]。本文結(jié)果顯示，藏紅花素會(huì)抑制缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞中CD31和CD34的分泌。

血管新生在各類疾病的進(jìn)程中起著重要作用。大量研究表明多種植物提取物可抑制血管新生。Vavilala等[31]發(fā)現(xiàn)木蘭屬植物提取物秦皮乙素氧可降低缺氧誘導(dǎo)視網(wǎng)膜病變小鼠視網(wǎng)膜血管新生。有數(shù)據(jù)顯示野艾蒿提取物可減弱人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管腔形成[32]。據(jù)報(bào)道川芎提取物的主要活性物質(zhì)丁烯基酞內(nèi)酯可抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管新生[33]。有研究表明蓮花葉提取物可降低乳腺癌細(xì)胞的血管新生能力[34]。Umigai等[35]發(fā)現(xiàn)藏紅花素可抑制VEGF誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞血管新生。本研究結(jié)果顯示，藏紅花素具有減少缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞血管新生過(guò)程中微管長(zhǎng)度和分支數(shù)量的作用，可降低缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞血管新生能力。

HIF-1α/VEGF通路的異常活化是視網(wǎng)膜新血管化的根本原因[31]。許多植物提取物可抑制HIF-1α/VEGF通路的激活。有研究發(fā)現(xiàn)紅球姜根莖提取物可降低糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)，抑制視網(wǎng)膜血管新生[36]。據(jù)報(bào)道和厚樸酚可降低缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞HIF-1α和VEGF表達(dá)[37]。有數(shù)據(jù)顯示桑葉提取物可抑制糖尿病大鼠視網(wǎng)膜VEGF表達(dá)[38]。據(jù)報(bào)道藏紅花素可抑制致癌物二乙基亞硝胺誘導(dǎo)的肝組織VEGF表達(dá)[39]。有研究顯示藏紅花素會(huì)降低二嗪農(nóng)誘導(dǎo)的大鼠心臟組織HIF-1α蛋白表達(dá)水平[40]。另外用藏紅花素預(yù)處理缺血再灌注大鼠可抑制HIF-1α表達(dá)的上升[41]。本文結(jié)果顯示，藏紅花素處理可抑制缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞血管新生相關(guān)蛋白HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38蛋白表達(dá)水平。

簡(jiǎn)而言之，在缺氧誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞中，藏紅花素處理可降低細(xì)胞增殖，減少CD31和CD34分泌，減弱血管新生能力，降低HIF-1α、VEGF、VEGR2和P-P38蛋白水平。綜上所述，藏紅花素可通過(guò)HIF-1α/VEGF通路抑制缺氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞血管新生。后續(xù)計(jì)劃將在體內(nèi)探究藏紅花素對(duì)視網(wǎng)膜血管新生的影響，為挖掘新的眼病治療方法奠定基礎(chǔ)。