PM2.5通過(guò)自噬活化NLRP3炎癥小體誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞炎癥反應(yīng)①

王玉琳 霍婷婷 馮晨旭 張 旭 楊 潔 董發(fā)勤 鄧建軍

(西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院,瀘州 646000)

PM2.5是霧霾的主要成分之一，因其粒徑小，隨呼吸進(jìn)入體內(nèi)后部分可沉積于肺泡，還可透過(guò)肺血液屏障隨血液循環(huán)到達(dá)全身，對(duì)多個(gè)組織器官造成損傷[1,2]。呼吸系統(tǒng)流行病學(xué)調(diào)查表明，PM2.5可刺激巨噬細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞及肺泡上皮細(xì)胞釋放大量的炎癥因子，誘發(fā)或加重哮喘、支氣管炎和肺纖維化等肺部疾病，甚至和肺部腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[3,4]。NLRP3炎癥小體是機(jī)體固有免疫的重要組成部分，病毒、寄生蟲(chóng)和細(xì)菌等病原體以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、氧化應(yīng)激等均可活化NLRP3炎癥小體[5]。NLRP3炎癥小體過(guò)度激活可通過(guò)依賴(lài)caspase-1的分子途徑使IL-1β和IL-18大量釋放，并激活復(fù)雜的下游信號(hào)通路，引發(fā)一連串炎癥放大反應(yīng)，在多種炎癥相關(guān)性疾病中發(fā)揮極其重要的作用[6,7]。除了常見(jiàn)的病原體外，溫石棉、二氧化硅等礦物粉塵也可活化NLRP3炎癥小體，與肺纖維化的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[8]。PM2.5是以礦物顆粒為主要成分的復(fù)雜大氣污染物，是否可活化NLRP3炎癥小體引起并促進(jìn)機(jī)體炎癥反應(yīng)尚不明確。最新研究表明，細(xì)胞自噬對(duì)NLRP3炎癥小體活化有一定的調(diào)控作用。自噬是機(jī)體重要的代謝過(guò)程，主要依靠清除老化的蛋白質(zhì)和受損的細(xì)胞器等維持細(xì)胞自穩(wěn)，參與細(xì)胞的多種應(yīng)激反應(yīng)如炎癥反應(yīng)，但自噬參與調(diào)控炎癥反應(yīng)的分子機(jī)制尚未闡明[9,10]。NLRP3炎癥小體作為系列炎癥反應(yīng)的主要部分，自噬對(duì)NLRP3炎癥小體活化機(jī)制的研究可能成為PM2.5導(dǎo)致的炎癥性疾病防治的新靶點(diǎn)。因此，本研究以人支氣管上皮細(xì)胞為研究對(duì)象，在體外探討細(xì)胞自噬對(duì)PM2.5誘導(dǎo)的支氣管炎癥反應(yīng)的潛在影響機(jī)制，對(duì)PM2.5相關(guān)性炎癥疾病的預(yù)防和治療提供一定的理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(美國(guó)Hyclone公司)；磷酸緩沖鹽溶液(Phosphate buffer saline，PBS)、胰蛋白酶消化液、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素、噻唑藍(lán)(Methylthiazolyldi-phenyl-tetrazolium bromide，MTT)、二甲基亞砜(碧云天生物技術(shù)有限公司)；IL-1β、IL-18炎癥因子檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物科技有限公司)；兔抗LC3、Beclin1、NLRP3、caspase-1和GAPDH抗體(美國(guó)Abcam公司)；全蛋白抽提試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、羊抗兔IgG-HRP(江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司)；Lipofectamine 2000 (美國(guó)Thermo Fisher Scientific )；引物合成(上海杰李生物技術(shù)有限公司)；Real time PCR Master Mix(SYBR Green)(日本 ToYoBo QPR-201)。倒置相差熒光顯微鏡(Axio Observer A1，德國(guó)Zeiss公司)，紫外分光光度計(jì)(BioTek PowerWave XS2，美國(guó)BioTek公司)，熒光定量PCR儀器(7500 Fast，ABI)，Western 電泳儀(美國(guó)Bio-Rad，164-5051)，Trans-Blot Turbo全能型蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó) Bio-Rad 170-4150)。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及PM2.5粉塵染毒母液配置 人支氣管上皮細(xì)胞(16HBE)購(gòu)自上海子實(shí)生物科技有限公司，采用含10%胎牛血清、青霉素(100 U/ml)和鏈霉素(100 μg/ml)的DMEM高糖培養(yǎng)基，在恒定溫度(37℃)和合適濕度的5%CO2孵箱中培養(yǎng)。0.25%胰酶消化細(xì)胞常規(guī)傳代培養(yǎng)，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期且狀態(tài)良好的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

PM2.5組分因地域的不同而差異巨大，本實(shí)驗(yàn)選取河北石家莊某地區(qū)PM2.5為研究對(duì)象。PM2.5樣本由西南科技大學(xué)研究人員采集、洗脫后使用臥式行星球磨機(jī)(轉(zhuǎn)速400 r/min)于乙醇中研磨8 h，再經(jīng)烘干后所得。因此，本實(shí)驗(yàn)中所使用的PM2.5是自然環(huán)境中PM2.5的主要有形礦物成分，不包含少量負(fù)載的細(xì)菌、病毒和有機(jī)成分等。采用X射線衍射儀對(duì)樣本的主要物相分析結(jié)果為：PM2.5樣本中主要成分為石英，另含少量方解石和鈉長(zhǎng)石。利用高溫高壓蒸汽滅菌法制得無(wú)菌粉塵，使用無(wú)血清培養(yǎng)基配制成 1 000 μg/ml 的母液于-20℃保存?zhèn)溆?，使用前?jīng)超聲振蕩30 min。

1.2 方法

1.2.1 MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)定細(xì)胞存活率 將處于對(duì)數(shù)穩(wěn)定增長(zhǎng)期的16HBE細(xì)胞以每孔200 μl接種于96孔板中。待細(xì)胞密度約為80%時(shí)，把配制好的一系列濃度的PM2.5粉塵懸液(12.5、25、50、100、200、400 μg/ml)加入96孔板中，每孔200 μl。在共同孵育到特定時(shí)間點(diǎn)(12、24和48 h)時(shí)分別向各孔中加入MTT(5 mg/ml)試劑10 μl，繼續(xù)避光孵育4 h。輕輕棄掉上清液，向孔板中加入二甲基亞砜200 μl/孔，避光、室溫振蕩待結(jié)晶全部溶解后用分光光度計(jì)(490 nm)測(cè)定吸光度值(A)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置6個(gè)平行孔。對(duì)照組：細(xì)胞無(wú)任何處理；PM2.5對(duì)照組：不接種細(xì)胞，只加入PM2.5粉塵懸液。根據(jù)吸光度值采用以下計(jì)算方式得出細(xì)胞相對(duì)存活率。細(xì)胞相對(duì)存活率(%)=[(A實(shí)驗(yàn)組-A PM2.5對(duì)照組)/A對(duì)照組]×100%。

1.2.2 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞炎癥因子的表達(dá) 將濃度為1×105個(gè)/ml的細(xì)胞懸液以每孔2 ml接種于6孔板中，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為陰性對(duì)照組(不加任何刺激物，conrtol組)，PM2.5對(duì)照組(加目的濃度PM2.5粉塵懸液，PM2.5組)，空白質(zhì)粒對(duì)照組(只轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒而不加任何刺激物，NC組)，ATG7干擾表達(dá)對(duì)照組(siATG7組)和實(shí)驗(yàn)組(目的濃度PM2.5粉塵懸液染毒siATG7細(xì)胞，PM2.5+siATG7)。待細(xì)胞密度為80%左右時(shí)棄上清，向PM2.5對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組孔板中加入100 μg/ml的PM2.5懸液2 ml培養(yǎng)24 h。染毒結(jié)束后收集細(xì)胞上清液，用ELISA法按照相應(yīng)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定各孔的吸光度值，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出上清液中IL-1β、IL-18的濃度。每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)3個(gè)平行孔。

1.2.3 RT-PCR檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染后ATG7表達(dá) 接種16HBE細(xì)胞于6孔板中，在恒溫、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)到細(xì)胞融合度為30%～60%。實(shí)驗(yàn)分組如下：陰性對(duì)照組，NC組和siATG7組。稀釋ATG7 siRNA和Lipo2000：將250 μl不含血清的DMEM培養(yǎng)基分別加入到5 μl濃度為20 μmol/L siRNA貯存液和5 μl lipo2000中，分別混勻后室溫放置5 min；將稀釋的ATG7 siRNA和Lipo2000混勻后室溫孵育20 min；把ATG7 siRNA-lipo2000 混合液加入到細(xì)胞密度約為30%～60%培養(yǎng)孔中，培養(yǎng)4～6 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h。棄上清，PBS漂洗3次后分別向每孔中加入100 μg/ml的PM2.5懸液2 ml，共同孵育24 h后收集細(xì)胞。按照試劑盒使用說(shuō)明書(shū)，收集提取細(xì)胞總RNA，用ABI 7500 Fast熒光定量PCR儀檢測(cè)ATG7的mRNA的表達(dá)。ATG7引物序列為：(上游引物5′-AGCGGCGGCAAGAA-ATAATG-3′；下游引物5′-AACCCAACATCCAAGG-CACT-3′)。PCR擴(kuò)增結(jié)果用Ct值來(lái)表示，目的基因的相對(duì)表達(dá)率采用2-ΔΔCt方法計(jì)算。

1.2.4 Western blot檢測(cè)蛋白水平 16HBE細(xì)胞于6孔板中貼壁長(zhǎng)至70%時(shí)，向各個(gè)實(shí)驗(yàn)組加入2 ml濃度為50、100、200 μg/ml的PM2.5懸液，用于檢測(cè)Beclin1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的蛋白表達(dá)水平；向siATG7組和PM2.5+siATG7組加入2 ml濃度100 μg/ml 的PM2.5懸液，共同孵育24 h。消化、收集細(xì)胞，提取各實(shí)驗(yàn)組總蛋白，根據(jù)BCA法測(cè)定各組蛋白濃度。采用SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜后用脫脂奶粉封閉1.5 h，再分別在4℃的環(huán)境中孵育兔抗Beclin-1抗體(1∶500)、兔抗LC3抗體(1∶1 000)、兔抗NLRP3抗體(1∶500)、兔抗caspase-1(1∶1 000)抗體和兔抗GAPDH抗體(1∶1 000)，孵育12 h，洗膜后和由辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶1 000)共同孵育2 h。采用化學(xué)發(fā)光法顯色，并進(jìn)行圖像分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)EXCEL整理后使用SPSS27.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。根據(jù)數(shù)據(jù)分布特點(diǎn)采用t檢驗(yàn)、單因素方差分析或LSD檢驗(yàn)進(jìn)行組間、組內(nèi)比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PM2.5對(duì)16HBE細(xì)胞存活率的影響 不同濃度PM2.5染毒16HBE細(xì)胞12、24和48 h后，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1所示。與對(duì)照組(0 μg/ml)相比，細(xì)胞存活率隨著PM2.5染毒濃度的增高和染毒時(shí)間的延長(zhǎng)而降低；除12.5 μg/ml染毒16HBE細(xì)胞12 h時(shí)細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P> 0.05)，其他濃度組細(xì)胞存活率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。當(dāng)PM2.5濃度為 400 μg/ml時(shí)，染毒12、24、48 h后存活率分別為(63.14±3.8)%，(52.83±2.1)%，(40.92±5.5)%。染毒24 h 時(shí)，PM2.5粉塵對(duì)16HBE細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為227.3 μg/ml。

2.2 PM2.5誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) PM2.5分別以50、100和200 μg/ml的濃度染毒16HBE細(xì)胞24 h后，自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ的表達(dá)水平如圖2所示。與對(duì)照組(0 μg/ml)相比，隨著PM2.5染毒濃度的增加，Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平逐漸升高，LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平逐漸降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。當(dāng)PM2.5濃度為200 μg/ml時(shí)， 三種蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組相比差異最大，Beclin1和LC3-Ⅱ 蛋白表達(dá)水平分別增高3.4倍和5.375倍，LC3-Ⅰ 蛋白表達(dá)水平降低52.83%；當(dāng)PM2.5濃度為50 μg/ml、100 μg/ml的實(shí)驗(yàn)組相比較，Beclin1、LC3-Ⅰ 和LC3-Ⅱ 的蛋白表達(dá)水平無(wú)顯著變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 不同濃度PM2.5染毒16HBE細(xì)胞不同時(shí)間后的細(xì)胞存活率Fig.1 Cell viability of 16HBE cells exposed to different concentrations of PM2.5 for different timesNote: *.P<0.05,**.P<0.01，compared with control group (0 μg/ml).

2.3 轉(zhuǎn)染ATG7 siRNA后對(duì)染毒組16HBE細(xì)胞自噬水平的影響 ATG7 siRNA轉(zhuǎn)染16HBE細(xì)胞24 h后，采用RT-PCR檢測(cè)ATG mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示，siATG7組ATG7的 mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著低于NC組和陰性對(duì)照組(P<0.01)，而NC組和陰性對(duì)照組相比無(wú)明顯變化，表明siATG7能有效降低細(xì)胞ATG7的表達(dá)水平。siATG7細(xì)胞和正常無(wú)處理細(xì)胞分別與100 μg/ml PM2.5粉塵懸液共同孵育24 h后，PM2.5+siATG7實(shí)驗(yàn)組自噬相關(guān)蛋白Beclin1表達(dá)水平與PM2.5組相比降低44.64%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖3。以上結(jié)果說(shuō)明siATG7能夠明顯降低PM2.5誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平。

圖2 不同濃度PM2.5染毒16HBE細(xì)胞24 h后自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of autophagy-related proteins after exposure to different concentrations of PM2.5 for 24 h in 16HBE cellsNote: *.P<0.05,**.P<0.01,compared with control group (0 μg/ml).

圖3 siATG7降低PM2.5誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞的自噬水平Fig.3 siATG7 reduced PM2.5-induced autophagy levels in 16HBE cellsNote: a.P<0.01,compared with control group；b.P<0.01,compared with NC group；c.P<0.01,compared with siATG7 group；**.P<0.01,PM2.5 group compared with PM2.5+siATG7 group.

2.4 抑制細(xì)胞自噬對(duì)PM2.5誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)的影響 100 μg/ml PM2.5粉塵懸液染毒16HBE細(xì)胞24 h后，NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)如圖4所示。PM2.5組中NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)水平分別為0.27±0.01和0.39±0.05，與陰性對(duì)照組相比顯著升高(P<0.01)；而NC組和siATG7組的蛋白表達(dá)水平較陰性對(duì)照組無(wú)顯著差異。表明PM2.5可活化NLRP3炎癥小體，并激活了下游caspase-1蛋白。與PM2.5實(shí)驗(yàn)組相比，PM2.5+siATG7組NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)水平分別降低44.44%和51.28%，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。以上實(shí)驗(yàn)顯示，抑制PM2.5誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬可降低NLRP3炎癥小體活化的水平。

圖4 抑制細(xì)胞自噬后對(duì)PM2.5誘導(dǎo)NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effect of inhibition of autophagy on expression of NLRP3 and caspase-1 induced by PM2.5Note: a.P<0.01,compared with control group；b.P<0.01,compared with NC group；c.P<0.01,compared with siATG7 group；**.P<0.01,PM2.5 group compared with PM2.5+siATG7 group.

圖5 抑制細(xì)胞自噬后對(duì)炎癥因子IL-1β和IL-18表達(dá)的影響Fig.5 Effects of inhibition of autophagy on expression of inflammatory factors IL-1β and IL-18Note: a.P<0.01,compared with control group；b.P<0.01,compared with NC group；c.P<0.01,compared with siATG7 group；**.P<0.01,PM2.5 group compared with PM2.5+siATG7 group.

2.5 抑制細(xì)胞自噬對(duì)PM2.5誘導(dǎo)16HBE細(xì)胞炎癥因子表達(dá)的影響 100 μg/ml PM2.5染毒16HBE細(xì)胞24 h后細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-1β和IL-18的含量如圖5所示。與陰性對(duì)照組相比，PM2.5實(shí)驗(yàn)組中IL-1β和IL-18的含量分別增高166 pg/ml和453 pg/ml，siATG7組和NC組中的含量無(wú)明顯變化。與PM2.5實(shí)驗(yàn)組相比，PM2.5+siATG7組的IL-1β和IL-18的分泌分別降低70 pg/ml和242 pg/ml，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。因此降低PM2.5誘導(dǎo)的自噬可顯著減少細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-18的含量。

3 討論

NLRP3炎癥復(fù)合體是NLRP炎癥小體家族的核心，不僅可識(shí)別病毒、寄生蟲(chóng)和細(xì)菌等外源性病原體，還可被內(nèi)源性刺激物(如脂多糖、膽固醇結(jié)晶、尿酸結(jié)晶、 β-淀粉樣蛋白和氧化低密度脂蛋白等)激活，招募并激活下游蛋白caspase-1，促進(jìn)IL-1β和IL-18的成熟和釋放[11-13]。研究報(bào)道，PM2.5暴露導(dǎo)致機(jī)體的炎癥反應(yīng)和免疫毒性是PM2.5重要的致病機(jī)制之一，炎癥反應(yīng)在疾病的進(jìn)展中有著重要影響[8,14]。自噬對(duì)炎癥具有調(diào)控功能，PM2.5誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬對(duì)炎癥反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

細(xì)胞自噬是一種依賴(lài)溶酶體的選擇性降解方式，在真核細(xì)胞中普遍存在，可選擇性降解受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)以及外來(lái)入侵物來(lái)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。Beclin1和LC3等自噬相關(guān)蛋白在自噬發(fā)生的不同階段扮演著重要角色。LC3是存在于自噬體膜上的特征性蛋白，具有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ兩種存在狀態(tài)。當(dāng)自噬體形成后，均勻分布在胞質(zhì)中的LC3-Ⅰ經(jīng)過(guò)一系列復(fù)雜過(guò)程轉(zhuǎn)化成 LC3-Ⅱ；LC3-Ⅱ蛋白性質(zhì)穩(wěn)定并和自噬體膜結(jié)合緊密，因此LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平的高低可用來(lái)反映自噬體的數(shù)量和自噬程度[15]。本實(shí)驗(yàn)中，不同濃度PM2.5染毒16HBE細(xì)胞后，隨著PM2.5染毒濃度的增加，自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)水平逐漸升高，LC3-Ⅰ蛋白表達(dá)水平逐漸降低；Deng等研究發(fā)現(xiàn)，PM2.5暴露可導(dǎo)致LC3-Ⅱ、Atg5和Beclin1表達(dá)增加，且LC3-Ⅱ的表達(dá)量存在時(shí)間和濃度依賴(lài)性效應(yīng)，從而誘導(dǎo)自噬發(fā)生[16]。此外，納米石英粉塵、溫石棉及大氣顆粒物被證明均能誘導(dǎo)自噬的發(fā)生，這些研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果相一致。另有實(shí)驗(yàn)表明，PM2.5暴露可引起并加重氣道炎癥，并伴隨細(xì)胞自噬水平的升高和中性粒細(xì)胞百分比的增加，而自噬水平與氣道炎癥嚴(yán)重程度密切相關(guān)，提示細(xì)胞自噬也可能參與調(diào)控PM2.5引起的炎癥反應(yīng)[17]。

支氣管上皮細(xì)胞是覆蓋于氣管表面的主要細(xì)胞，不僅可作為生理屏障保護(hù)支氣管，還可參與氣道高反應(yīng)性、氣道炎癥反應(yīng)和氣道重塑。本實(shí)驗(yàn)采用16HBE體外建立PM2.5暴露細(xì)胞模型，與對(duì)照組相比，細(xì)胞培養(yǎng)液中的IL-1β和IL-18的含量明顯升高，且NLRP3和caspase-1蛋白表達(dá)水平增加。表明PM2.5激活了支氣管上皮細(xì)胞中的NLRP3炎癥小體，通過(guò)caspase-1途徑促進(jìn)了炎癥因子IL-1β和IL-18的釋放。仝國(guó)輝等[18]通過(guò)體內(nèi)PM2.5單次染毒和3次染毒小鼠后發(fā)現(xiàn)，小鼠肺組織IL-1β的含量和NLRP3 mRNA的表達(dá)量明顯升高。還有研究表明，PM2.5暴露的小鼠鼻灌洗液中Eotaxin、IL-5和嗜酸性粒細(xì)胞都升高，導(dǎo)致氣道炎癥反應(yīng)[19]。

自噬是把雙刃劍，在不同的感染及免疫性疾病中自噬所起的作用有所不同。研究證實(shí)，適度自噬可減輕炎癥反應(yīng)來(lái)促進(jìn)細(xì)胞穩(wěn)態(tài)恢復(fù)；過(guò)度自噬就會(huì)激活如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、NLRP3炎癥小體和核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)的等信號(hào)通路引發(fā)炎癥損傷[20,21]。Nakahira等[22]研究表明，自噬缺陷小鼠血清IL-1β和IL-18水平顯著增高，同時(shí)活性氧的水平和NLRP3蛋白表達(dá)水平增高。本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)siATG7降低自噬相關(guān)蛋白ATG7的表達(dá)，使自噬囊泡形成障礙，抑制PM2.5誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬。降低細(xì)胞自噬水平能夠顯著抑制PM2.5誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞中NLRP3和caspase-1蛋白的表達(dá)，顯著減少細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-18的分泌量。提示細(xì)胞自噬可參與PM2.5介導(dǎo)的NLRP3炎癥小體的活化而加重機(jī)體炎癥反應(yīng)。這可能是因?yàn)镻M2.5使細(xì)胞發(fā)生過(guò)度的自噬反應(yīng)，消耗過(guò)多的線粒體自噬轉(zhuǎn)換蛋白P62。P62是細(xì)胞內(nèi)維持線粒體自噬的必要蛋白，不足的P62會(huì)導(dǎo)致功能受損的線粒體無(wú)法通過(guò)自噬而及時(shí)清除，使活性氧過(guò)度積累誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的活化，促進(jìn)炎癥因子的成熟和釋放[23,24]。但具體活化機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，抑制細(xì)胞自噬可明顯減輕PM2.5誘導(dǎo)的支氣管上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。其機(jī)制可能是PM2.5使細(xì)胞發(fā)生自噬紊亂，過(guò)度的細(xì)胞自噬可參與活化NLRP3炎癥小體，促進(jìn)IL-1β和IL-18的分泌，導(dǎo)致機(jī)體炎癥反應(yīng)。