2株海鞘共附生真菌的次生代謝產(chǎn)物研究

喬玉寶，樊成奇，唐瑩瑩，田曉清

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)，上海 201306；3.農(nóng)業(yè)部遠(yuǎn)洋與極地漁業(yè)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；4.農(nóng)業(yè)部東海漁業(yè)資源開(kāi)發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090）

海洋環(huán)境一般具有高鹽和寡營(yíng)養(yǎng)等特點(diǎn)，一些局部海區(qū)還具有高壓、低溫和低光照等特征，這些特殊性導(dǎo)致生活在其中的很多生物尤其是微生物在長(zhǎng)期的適應(yīng)性進(jìn)化過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生一些有別于陸地生物的防御體系，從而使得它們成為抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗心血管疾病等藥物先導(dǎo)化合物的重要來(lái)源［1］。在新結(jié)構(gòu)海洋天然產(chǎn)物中，海洋真菌和放線(xiàn)菌來(lái)源分別占8.5%和3.5%，脊索動(dòng)物海鞘的次級(jí)代謝產(chǎn)物也占到4.7%，它們都是結(jié)構(gòu)新穎的海洋天然產(chǎn)物重要來(lái)源［2］。

我國(guó)海鞘資源豐富，已記錄的中國(guó)沿海海鞘分布在渤海5種、黃海21種、東海24種、南海53種，種類(lèi)合計(jì)有 70余種，其中許多屬種如Hartmeyeria等為我國(guó)所特有［3-4］。目前國(guó)內(nèi)海鞘的次級(jí)代謝產(chǎn)物研究與國(guó)際先進(jìn)水平還存在一定差距，主要集中在瘤海鞘屬柄海鞘（Styela clava）［5］和短腹海鞘屬星座美洲海鞘（Aplidium constellatum）［6］。中國(guó)學(xué)者對(duì)海鞘共附生微生物的次級(jí)代謝產(chǎn)物研究也還處于起步階段，早期文獻(xiàn)報(bào)道了香豆素類(lèi)新結(jié)構(gòu)化合物來(lái)源于海鞘的青霉菌［7］；2017年，裴召苓等［8］從中國(guó)黃海的威海海域柄海鞘來(lái)源放線(xiàn)菌Streptomyces coelicoflavus（HQA809）中分離鑒定了2個(gè)吡喃酮類(lèi)化合物，從菊海鞘（Botryllus schlosseri）來(lái)源的Nocardiopsis dassonvillei（HQA404）中分離鑒定了1個(gè)吩嗪類(lèi)化合物和1個(gè)苯酚類(lèi)化合物，其中吩嗪類(lèi)化合物對(duì)鰻弧菌（Vibrio anguillarum）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）的MIC值分別為50 μM和25μM，顯示出很好的活性。本課題組前期也進(jìn)行了不同海鞘化學(xué)成分的研究［9-11］以及中國(guó)各海區(qū)的海鞘共附生微生物資源的持續(xù)收集和活性次級(jí)代謝產(chǎn)物的基礎(chǔ)研究［12］。在此基礎(chǔ)上，本文研究了分離自瘤海鞘屬皺瘤海鞘（S.plicata）和冠瘤海鞘（S.canopus）樣品的共附生真菌Purpureocillium sp.FBZ-1和Penicillium sp.BNG-1的次級(jí)代謝產(chǎn)物，以期為今后海鞘共附生微生物代謝產(chǎn)物的相關(guān)研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生物材料：新鮮海鞘于2015年3月23、24日分別采自廣西北海南汅（冠瘤海鞘）和防城港白龍碼頭（皺瘤海鞘），海水沖洗后立即封裝于無(wú)菌管內(nèi)，冷藏保存運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，海鞘品種由東海水產(chǎn)研究所樊成奇研究員鑒定。

微生物鑒定材料：真菌DNA小劑量快速提取試劑盒（上海生工生物公司）；18S引物（上海美吉生物公司）；PCR擴(kuò)增體系（康為世紀(jì)）。

色譜填料和試劑：HP-20大孔吸附樹(shù)脂（Mitsubishi Chemical，Japan）；凝膠 Sephadex LH-20（Pharmacia Biotech，Sweden）；凝膠 Sephadex G-25（Pharmacia Biotech，Sweden）；預(yù)制 GF254 TLC硅膠板（青島海洋化學(xué)公司）；液相用乙腈、甲醇（色譜級(jí)，Tedia，USA）；其余溶劑均為分析純（AR，上海國(guó)藥集團(tuán)）。

分離培養(yǎng)基：孟加拉紅固體培養(yǎng)基（葡萄糖10.0 g，蛋白胨 5.0 g，磷酸二氫鉀 1.0 g，硫酸鎂0.5 g，瓊脂20.0 g，1/3000孟加拉紅溶液100 mL，陳海水 1 000 mL）［13］；PDA固體培養(yǎng)基（馬鈴薯200.0 g，葡萄糖10.0 g，瓊脂18.0 g，陳海水1 000 mL）；YPD固體培養(yǎng)基（酵母膏10.0 g，蛋白胨 20.0 g，葡萄糖20.0 g，瓊脂18.0 g，陳海水1 000 mL）。用于分離菌株時(shí)每種培養(yǎng)基添加氯霉素和萘啶酮酸各 30 U·mL-1，pH 6.0～6.5［14］。

發(fā)酵培養(yǎng)基：YPD液體培養(yǎng)基。

1.2 儀器

超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器有限公司DL-CJ-INDII型；高壓滅菌器：上海申安醫(yī)療器械廠(chǎng)LDZX-75KBS型；大型恒溫培養(yǎng)箱：Shanghai Chemstar Instruments Co.，Ltd ATB-032型；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司DHG-9123A型；微生物恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司DHP 9162A型；高速微量離心機(jī)：上海生工生物有限公司HICO 21型；PCR儀：杭州朗基科學(xué)儀器有限公司AG-22331型；凝膠成像系統(tǒng)：上海天能科技有限公司GIS-1600型；超聲儀：上海漢克科學(xué)儀器有限公司SK250LH型；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠(chǎng)RE-2000；顯微鏡：上海光學(xué)儀器一廠(chǎng)XSP-44X.9型；半制備 HPLC系統(tǒng)：Shimadazu LC-20AT pump，SIL-20A auto sampler，SPD-M20A PDA detector以及 YMC-Pack ODS-AQ column（250×10 mm，S-5μm，12 nm，常用進(jìn)樣量 100μL，流速 2.5 mL·min-1）；UV：Shimadzu SPD-M20A PDA detector； ESI-MS：Finnigan LCQ DECA instrument；NMR：Bruker AM-400 spectrometer（TMS內(nèi)標(biāo)）；LC-MS：Agilent 1290 HPLC-6224 TOF MS；波譜學(xué)技術(shù)1H-NMR（400 MHz）、13C-NMR（126 MHz）等。

1.3 共附生微生物的分離和培養(yǎng)

1.3.1 菌株的分離純化

將冠瘤海鞘和皺瘤海鞘樣品在超凈工作臺(tái)內(nèi)剪碎，分別稱(chēng)取1 g左右海鞘樣品加入到裝有10 mL無(wú)菌水的50 mL無(wú)菌管中，震蕩混勻后靜置于4℃冰箱過(guò)夜。將樣品懸液進(jìn)行1×10-1、1×10-2、1×10-3的梯度稀釋?zhuān)總€(gè)梯度分別取100μL涂布于孟加拉紅、PDA和YPD固體培養(yǎng)基上，由于菌種的適宜生長(zhǎng)環(huán)境是27℃左右，故將培養(yǎng)皿放于27℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)［15］。培養(yǎng)約1～2周后長(zhǎng)出菌落，根據(jù)顏色、形態(tài)等特征挑取差異較大的菌落，接種至相應(yīng)新鮮培養(yǎng)基上繼續(xù)分離培養(yǎng)。最終得到的菌株保存于相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上，置于4℃冰箱保種。

1.3.2 菌落形態(tài)觀(guān)察

由于課題研究真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物，根據(jù)菌株形態(tài)挑選出疑似真菌純化菌株接種在YPD平板培養(yǎng)基，27℃下倒置培養(yǎng)7～10 d，觀(guān)察并記錄菌落大小、顏色、質(zhì)地、有無(wú)分泌物等特征［16］。載玻片上滴一滴清水，刮取少量菌絲體和孢子在清水中分散均勻，蓋上蓋玻片，在光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察菌絲形態(tài)、直徑等特性和孢子的顏色、外形并記錄［17］。

1.3.3 菌株18S rDNA-ITS序列分析

將真菌發(fā)酵液減壓抽濾得菌絲體。取適量菌體，加入液氮充分研磨至粉末狀［18］。使用真菌DNA小劑量快速提取試劑盒提取真菌基因組DNA，并于 -20℃保存?zhèn)溆?。采?18S-EF3：TCCTCTAAATGACCRAGTTTG和 18S-EF4：GGAAGGGRTGTATTTATTAG，擴(kuò)增真菌 18S rDNA-ITS序列。

PCR擴(kuò)增體系為50μL∶2×Taq PCR Master Mix 25μL，引物各2μL，模板 DNA 5μL，重蒸水16μL。擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10 min［19］。取5μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠，100 V電泳30 min，檢測(cè) DNA大小，然后用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照。提取的DNA-20℃保存之后送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。所測(cè)結(jié)果在NCBI網(wǎng)站比對(duì)，種屬歸類(lèi)。

1.4 FBZ-1菌株代謝產(chǎn)物分離純化

1.4.1 FBZ-1菌株發(fā)酵

配制兩瓶300 mL YPD液體培養(yǎng)基，置于500 mL三角瓶中，121℃高溫滅菌30 min，再接入經(jīng)過(guò)活化培養(yǎng)的FBZ-1菌株，20℃、160 r·min-1進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，5 d后得到種子發(fā)酵液。將種子液按一定比例接種于含有0.75 L YPD液體培養(yǎng)基的2 L三角瓶中，在20°C、160 r·min-1分兩批進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，每批發(fā)酵培養(yǎng)一周，共得到約20 L發(fā)酵液。

1.4.2 FBZ-1化合物的提取分離

菌株FBZ-1的20 L發(fā)酵液經(jīng)抽濾分為胞外濾液和菌體兩部分。因菌體和發(fā)酵液極性不一樣，故菌體用甲醇和丙酮超聲提取，發(fā)酵液用乙酸乙酯萃取。菌體置于-80℃冰箱中冷凍，然后取出自然解凍破壁，依次加入2 L的丙酮和甲醇（MeOH）超聲破碎，分別提取2次，提取液減壓低溫濃縮除去有機(jī)溶劑。將胞內(nèi)水溶液上Middle Chromatogram Isolated gel（MCI gel），用水洗脫 4個(gè)柱體積1 200 mL，再用 MeOH/H2O（10∶90）洗脫900 mL，洗脫液舍棄；繼續(xù)依次用MeOH/H2O（40∶60→60∶40→80∶20→100∶0）梯度洗脫，每梯度洗脫液用量均為1 200 mL。胞外濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至1 L，用乙酸乙酯按照1∶1萃取4次，將上層的乙酸乙酯相濃縮后，用40%MeOH超聲震蕩溶解后過(guò)MCIgel，也依次用MeOH/H2O（40∶60→60∶40→80∶20→100∶0）對(duì) MCIgel中的濃縮液進(jìn)行梯度洗脫，每梯度洗脫液用量均為2 500 mL。將胞外、胞內(nèi)同梯度的洗脫液分別合并，濃縮蒸干，得到 40%Me（3.54 g）、60%Me（1.63 g）、80%Me（0.35 g）和100%Me（1.70 g）4個(gè)部位。

最主要的40%Me部分用水溶解后過(guò)MCI gel，依次用 MeOH/H2O（10∶90→20∶80→35∶65→50∶50→100∶0）進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫 1 L濃縮蒸干得到40%MeI（2.36 g）、40%MeⅡ（3.82 g）、40%MeⅢ（2.70 g）和 40%MeⅣ（1.81 g）。

40%MeI部分過(guò)正相硅膠柱，依次用CHCl3/MeOH/H2O（6∶1∶0.1→5∶1∶0.1→4∶1∶0.1→3∶1∶0.1）進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫1 L得到40%MeIa和40%MeIb，其中40%MeIa經(jīng) HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備，分離得到化合物1（4 mg，17.83 min）。流動(dòng)相為乙腈-水（均含0.1%三氟乙酸）：0 min，15%乙腈；7 min 30 s，20%乙腈；8 min，30%乙腈；14 min 30 s，40%乙腈；14 min 42 s，70%乙腈；18 min 30 s，70%乙腈；19 min，15%乙腈。40%MeIb部分經(jīng)檢測(cè)后不做處理。

40%MeⅡ部分用反相RP-18柱色譜，依次用CH3CN/H2O（15∶85→25∶75→60∶40→80∶20→100∶0）進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫1L，將洗脫液濃縮蒸干得到40%MeⅡa和40%MeⅡb兩個(gè)部分。其中40%MeⅡa部分經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備得到40%MeⅡa1、40%MeⅡa2和其余部分，40%MeⅡa1部分過(guò)正相硅膠柱，依次用CHCl3/MeOH（20∶1→16∶1→12∶1）進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫 500 mL，得到化合物 2（4 mg）；40%MeⅡa2部分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，用70%乙醇洗脫300 mL得到化合物3（6 mg）和化合物 4（5 mg）。

40%MeⅢ部分經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱層析分離，70%無(wú)水乙醇洗脫，得到40%MeⅢa、40%MeⅢb、40%MeⅢc 3個(gè)部分，其中 40%MeⅢb部分經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備，得到化合物5（12 mg，14.42 min）、化合物 6（12 mg，14.42 min）、化合物 7（3 mg，16.05min）和化合物 8（2 mg，19.26 min）。液相流動(dòng)相為乙腈-水（均含0.1%三氟乙酸）：0 min，15%乙腈；2 min，20%乙腈；14 min，25%乙腈；21 min，45%乙腈；21 min 30 s，70%乙腈；24 min 30 s，70%乙腈；25 min，15%乙腈。40%MeⅢc部分經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備，濃縮得到化合物9（5 mg，26.42 min）。流動(dòng)相為乙腈-水（均含0.1%三氟乙酸）：0 min，15%乙腈；2 min，20%乙腈；14 min，25%乙腈；24 min，45%乙腈；24 min 30 s，70%乙腈；26 min 30 s，70%乙腈；27 min，15%乙腈。

60%Me部分經(jīng)薄層層析和HPLC-TOF MS分析未發(fā)現(xiàn)有價(jià)值的成分，故不做處理。

80%Me經(jīng) MeOH溶解后用粗硅膠（200～300目）拌樣上硅膠柱，依次用 CHCl3/MeOH（40∶1→30∶1→20∶1）進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫500 mL，得化合物 10（37 mg）。

1.5 BNG-1菌株代謝產(chǎn)物分離純化

1.5.1 BNG-1菌株發(fā)酵

配制300 mL YPD液體培養(yǎng)基，置于500 mL三角瓶中，高溫滅菌（121℃，30 min），再接入經(jīng)過(guò)活化培養(yǎng)的BNG-1菌株，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。選取發(fā)酵培養(yǎng)的條件為20℃、160 r·min-1，5 d后得到種子發(fā)酵液。將種子液按一定比例接種于含有約0.75 L YPD液體培養(yǎng)基的2 L三角瓶中，在20℃、160 r·min-1條件下進(jìn)行搖床發(fā)酵培養(yǎng)，每批發(fā)酵24瓶培養(yǎng)一周，兩批共得到36 L發(fā)酵液。第3批和第4批采用無(wú)菌的20 L發(fā)酵罐培養(yǎng)，在20℃、100 r·min-1條件下培養(yǎng)兩周，又得到40 L發(fā)酵液。

1.5.2 BNG-1化合物的提取分離

菌株BNG-1的76 L發(fā)酵液經(jīng)抽濾分為胞外濾液和菌體兩部分，菌體放在自封袋做好標(biāo)記置于-80℃冰箱中冷凍待用。胞外濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至5 L左右，由于浸膏較多，采用萃取將化學(xué)極性部位分段后再采用柱色譜層析進(jìn)行分離純化。用乙酸乙酯按1∶1萃取后分成水相和乙酸乙酯相，其中乙酸乙酯相用水（含20%的MeOH）溶解后用石油醚按1∶1萃取4次，下層水相另作處理。將萃取后的石油醚相濃縮蒸干，用石油醚、水以及甲醇等溶劑均難溶，用丙酮溶解后分層，取上清液粗硅膠拌樣過(guò)正相硅膠柱，依次用 CHCl3/MeOH/H2O（5∶1∶0.1→4∶1∶0.1→3∶1∶0.1→2∶1∶0.1）進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫500 mL，分成4個(gè)部分，分別為 PEI、PEⅡ、PEⅢ和 PEⅣ。其中 PEI過(guò)正相硅膠柱，依次用CHCl3/MeOH（10∶1→8∶1→6∶1→5∶1）進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫 300 mL，得到 PEIa、PEIb、PEIc 3個(gè)部分。PEIa部分過(guò)凝膠柱，用乙醇等梯度洗脫，得到PEIa1、PEIa2和PEIa3 3個(gè)部分。其中PEIa1經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備得到化合物11（76 mg，16.96 min）和化合物 12（15 mg，26.62 min）。進(jìn)樣量 60μL，流動(dòng)相為乙腈-水（均含0.1%三氟乙酸）：0 min，25%乙腈；2 min，25%乙腈；14 min，35%乙腈；25 min，60%乙腈；25 min 30 s，70%乙腈；28 min 30 s，70%乙腈；29 min，25%乙腈。PEIb部分通過(guò)正相硅膠柱，依次用CHCl3/MeOH（10∶1→8∶1→6∶1→5∶1）進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫300 mL，得化合物13（278 mg）。PEIc部分用氯仿溶解后經(jīng)正相硅膠柱，依次用 CHCl3/MeOH（10∶1→8∶1→6∶1→5∶1）進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫300 mL，分別得化合物14（15 mg）和化合物15（10 mg）。

菌體置于-80℃冰箱中冷凍，然后取出自然解凍破壁，依次加入2 L的丙酮和甲醇（MeOH）超聲破碎30min，分別提取3次，提取液減壓濃縮得到總浸膏。將浸膏用水/石油醚按1∶1萃取4次，將萃取后的水相與之前胞外的水相合并，減壓濃縮除去殘余的石油醚，過(guò)大孔吸附樹(shù)脂柱，用水洗脫3個(gè)柱體積，再用 MeOH/H2O（10∶90）洗脫6 L，洗脫液舍棄。繼續(xù)依次用MeOH/H2O（30∶70→60∶40→85∶15→100∶0）梯度洗脫，每個(gè)梯度用量分別為6 L，濃縮得到30%Me（53.86 g）、60%Me（48.74 g）和 85%Me（17.88 g）3個(gè)部分。

30%Me過(guò)反相RP-18柱，先用10%MeOH洗脫900 mL除雜，再依次用20%MeOH、30%MeOH和50%MeOH洗脫，每個(gè)梯度洗脫900 mL，減壓濃縮得到 30%MeI（8.28 g）、30%MeⅡ（5.55 g）和 30%MeⅢ（4.69 g）。30%MeI部分用水溶解后過(guò) G-25凝膠柱，用蒸餾水洗脫經(jīng)HPLC分析檢測(cè)后合并濃縮得到30%MeIa和30%MeIb兩個(gè)部分。30%MeIa部分用H2O溶解后經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備，依次得到化合物16（3 mg，7.98 min）、化合物 17（20 mg，18.37 min）、化合物18（8 mg，22.09 min）和幾個(gè)不純的化合物Ia1、Ia2和Ia3。進(jìn)樣量40μL，流動(dòng)相為乙腈-水（均含0.1%三氟乙酸）：0 min，17%乙腈；2 min，17%乙腈；21 min，32%乙腈；22 min，70%乙腈；24 min 30 s，70%乙腈；25 min，17%乙腈。Ia2部分過(guò)凝膠柱得化合物19（20 mg）。30%MeIb也經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備，得到化合物化合物20（13 mg，12.43 min）、21（2 mg，14.90 min）和 1個(gè)混合物Ib1。進(jìn)樣量30μL，流動(dòng)相為乙腈-水（均含 0.1%三氟乙酸）：0 min，15%乙腈；2 min，15%乙腈；17 min，25%乙腈；18 min，70%乙腈；20.5 min，70%乙腈；21 min，15%乙腈。Ib1過(guò)正相硅膠柱，依次用 CHCl3/MeOH（6∶1→5∶1→4∶1）進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫300 mL得到化合物22（10 mg）。

60%Me（48.74 g）部分上正相硅膠柱，依次用 CHCl3/MeOH（16∶1→12∶1→10∶1→8∶1）進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫1.5 L，得到60%MeI、60%MeⅡ和60%MeⅢ3部分。其中60%MeI經(jīng)凝膠柱分離得到MeIa、MeIb、MeIc和MeId 4個(gè)部分。其中MeIa部分經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備，得化合物 23（5 mg）、化合物 24（35 mg）。進(jìn)樣量 40 μL，流動(dòng)相為乙腈-水（均含0.1%三氟乙酸）：0 min，15%乙腈；2 min，15%乙腈；26 min，40%乙腈；27 min，80%乙腈；29 min 30 s，80%乙腈；30 min，15%乙腈。

85%Me部分用粗硅膠拌樣上柱，依次用CHCl3/MeOH（20∶1→16∶1→12∶1→10∶1）進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫1 L得到9個(gè)部分，其中85%MeⅢ部分過(guò)凝膠柱，得到Ⅲa、Ⅲb、Ⅲc和Ⅲd。Ⅲd經(jīng)過(guò)正相硅膠柱，依次用 CHCl3/MeOH（20∶1→16∶1→12∶1）進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫300 mL得到Ⅲd1，Ⅲd1經(jīng)凝膠柱分離純化，依次得化合物25（3 mg）、化合物 26（45 mg）。85%MeⅦ部分過(guò)正相硅膠柱，依次用 CHCl3/MeOH（20∶1→16∶1→12∶1→10∶1）進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫500 mL，得到Ⅶa、Ⅶb和Ⅶc。Ⅶa部分過(guò)凝膠柱得到Ⅶa1、Ⅶa2和Ⅶa3。Ⅶa3部分經(jīng)HPLC反復(fù)進(jìn)樣制備，得到化合物27（15 mg，7.59 min）和化合物 28（8 mg，9.25 min）。進(jìn)樣量 50 μL，流動(dòng)相為乙腈-水（均含0.1%三氟乙酸）：0 min，40%乙腈；2 min，40%乙腈；3 min，50%乙腈；15 min，60%乙腈；15 min 30 s，40%乙腈。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種鑒定

2.1.1 顯微鏡菌絲形態(tài)觀(guān)察

參照文獻(xiàn)［20］中的方法將1.3.2中菌株形態(tài)觀(guān)察結(jié)果記錄如下（放大40倍觀(guān)察），鏡檢結(jié)果顯示菌株 FBZ-1（圖1-a）、BNG-1（圖1-b）符合真菌的形態(tài)特征。

表1 菌株FBZ-1、BNG-1菌絲體特征［20］Tab.1 M ycelium characters of strains FBZ-1 and BNG-1

2.1.2 測(cè)序結(jié)果

從這2株海鞘中也分離鑒定了其他共附生微生物，由于課題原因未做測(cè)序鑒定。菌株FBZ-1和BNG-1送樣均測(cè)序拼接成功。將上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司所測(cè)結(jié)果在NCBI網(wǎng)站比對(duì)，種屬歸類(lèi)如表2。

圖1 菌株 FBZ-1（a）、BNG-1（b）的顯微鏡照片F(xiàn)ig.1 M icrophotographs of strains FBZ-1（a）and BNG-1（b）colony

從比對(duì)結(jié)果可以得出，F(xiàn)BZ-1屬于淡紫擬青霉屬，BNG-1屬于青霉屬。

2.2 真菌FBZ-1、BNG-1化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

從防城港白龍皺瘤海鞘共附生的淡紫擬青霉FBZ-1和北海南汅的冠瘤海鞘共附生的青霉BNG-1這2株真菌發(fā)酵液中，主要采用萃取和柱層析技術(shù)（MCI柱層析、正反相硅膠柱層析、凝膠柱層析及半制備高效液相色譜等）進(jìn)行次級(jí)代謝產(chǎn)物的分離純化，并運(yùn)用波譜學(xué)技術(shù)（HPLC TOFMS、1H-NMR、13C-NMR等）和物理化學(xué)方法，鑒定了其中28個(gè)成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

化合物1：綠色固體。正離子模式的ESI-MS數(shù)據(jù)：m/z243.0879［M+H］+，265.069 8［M+Na］+，推斷化合物 1對(duì)應(yīng)分子式為C12H10N4O2。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH2.52（s，3H），2.54（s，3H），7.73（s，1H），7.93（s，1H）。13C-NMR（126 MHz，Pyr）δ 161.30，151.15，146.96，144.03，142.33，139.09，138.27，130.16，128.97（CH），126.43（CH），19.71（CH3），19.18（CH3）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［21］報(bào)道一致，因此化合物1鑒定為已知生物堿類(lèi)化合物lumichrome。

化合物2：熒光黃色無(wú)定型粉末。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH0.95（t，J=14.8 Hz，3H），1.02（d，J=6.8 Hz，3H），1.43（d，J=6.8 Hz，3H），1.50（m，1H），1.96（m，1H），2.52（m，1H），3.89（m，1H），4.02（m，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［22］報(bào)道一致，因此化合物2鑒定為已知化合物環(huán)（異亮氨酸-丙氨酸）。

化合物3：白色固體。正離子模式的ESI-MS數(shù)據(jù)：m/z 217.0966［M+H］+，433.186 4［2M+H］+，推斷化合物 3對(duì)應(yīng)分子式為C12H12N2O2。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH3.07（m，1H），3.43（m，1H），3.97（m，1H），4.42（s，1H），4.61（s，1H），7.04（m，1H），7.13（m，1H），7.32（m，1H），7.48（m，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［23］報(bào)道一致，因此化合物3鑒定為已知生物堿類(lèi) 1，2，3，4-四氫-β-咔啉-3-羧酸。

化合物4：黃色固體。1H-NMR（CD3OD，400MHz）數(shù)據(jù)如下：δH7.47（m，1H），7.79（m，2H），8.45（m，2H），8.68（d，J=12.0 Hz，1H），9.12（s，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［24］報(bào)道一致，因此化合物4鑒定為已知生物堿類(lèi)化合物β-咔啉。

表2 18S rDNA序列與NCBI中已知序列的比對(duì)結(jié)果Tab.2 18S rDNA sequences com pared w ith known sequences in NCBI

圖2 菌株FBZ-1中化合物1～10的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of com pounds 1～10 from FBZ-1

化合物5：黃色固體。準(zhǔn)分子離子峰為m/z 211.143 8 ［M+H］+，推 斷 分 子 式 為C11H18N2O2。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH0.93（t，J=6.7 Hz，3H），1.08（d，J=4.0 Hz，3H），1.34（m，1H），1.59（m，1H），1.79（m，1H），1.95（m，4H），2.18（m，1H），3.52（m，2H），3.87（d，J=3.2 Hz，1H），4.22（m，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［24］報(bào)道一致，因此化合物5鑒定為已知化合物環(huán)（異亮氨酸-脯氨酸）。

化合物6：黃色固體。正離子模式的ESI-MS數(shù)據(jù)：m/z227.138 4［M+H］+，249.120 4［M+Na］+，453.270 0［2M+H］+，475.252 0［2M+Na］+，推斷化合物 6對(duì)應(yīng)分子式為C11H18N2O3。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH0.98（d，J=4.0 Hz，3H），1.01（d，J=4.4 Hz，3H），1.46（m，1H），1.69（m，1H），2.04（m，3H），2.35（m，1H），3.57（m，2H），4.09（s，1H），4.28（t，J=10.8 Hz，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［24］報(bào)道一致，因此化合物6鑒定為已知化合物環(huán)（亮氨酸-羥基脯氨酸）。

化合物7：無(wú)色無(wú)定型粉末。正離子模式的ESI-MS數(shù)據(jù)：m/z 211.144 0［M+H］+，233.125 5［M+Na］+，推斷化合物7對(duì)應(yīng)分子式為 C11H18N2O2。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH0.97（m，6H），1.54（m，1H），1.93（m，3H），2.02（m，2H），2.31（m，1H），3.52（m，2H），4.15（m，1H），4.27（m，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［24］報(bào)道一致，因此化合物7鑒定為已知化合物環(huán)（亮氨酸-脯氨酸）。

化合物8：淺黃色無(wú)定型粉末。正離子模式的ESI-MS數(shù)據(jù)：m/z 245.128 3［M+H］+，推斷化合物8對(duì)應(yīng)分子式為 C14H16N2O2。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH1.24（m，1H），1.82（m，2H），2.10（m，1H），3.18（m，2H），3.39（m，1H），3.56（dd，J=18.8，8.0 Hz，1H），4.09（dd，J=11.2，2.8 Hz，1H），4.46（s，1H），7.27（m，5H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［24］報(bào)道一致，因此化合物8鑒定為已知化合物環(huán)（苯丙氨酸-脯氨酸）。

化合物9：淡黃色無(wú)定型粉末。正離子模式的 ESI-MS數(shù)據(jù)：m/z 300.169 9［M+H］+，推斷化合物 9對(duì)應(yīng)分子式為 C17H21N3O2。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH0.44（d，J=6.8 Hz，3H），0.57（d，J=6.4 Hz，3H），0.96（m，2H），1.06（m，1H），3.08（m，1H），3.45（m，1H），3.55（m，1H），4.24（m，1H），6.96（m，1H），7.06（m，2H），7.30（m，1H），7.58（m，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［25］報(bào)道一致，因此化合物9鑒定為已知化合物環(huán)（色氨酸-亮氨酸）。

化合物 10：黃褐色無(wú)定型粉末。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH0.77（d，J=6.4 Hz，3H），0.82（t，J=6.4 Hz，3H），1.26（m，2H），1.50（m，1H），3.26（m，1H），3.44（m，1H），3.86（m，1H），4.33（s，1H），6.33（s，1H），7.13（m，1H），7.21（m，1H），7.36（m，1H），7.62（m，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［26］報(bào)道一致，因此化合物10鑒定為已知化合物環(huán)（色氨酸-纈氨酸）。

化合物11：白色油狀。正離子模式的ESIMS數(shù)據(jù)：m/z 164.110 4［M+H］+，推斷化合物11對(duì)應(yīng)分子式為 C10H13NO。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH1.89（s，1H），2.76（t，J=14.8 Hz，1H），3.37（t，J=14.8 Hz，1H），7.22（m，2H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［27］報(bào)道一致，因此化合物11鑒定為已知芳香胺類(lèi)化合物N-乙酰苯乙胺。

化合物12：黃色固體。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH1.76（t，J=12.8 Hz，2H），2.61（t，J=15.2 Hz，2H），2.90（t，J=15.2 Hz，2H），3.55（t，J=12.8 Hz，2H），4.13（t，J=12.8 Hz，2H），7.22（m，5H）。13C-NMR（126MHz，MeOD）δ172.75，139.96，127.59（CH×2），127.43（CH×2），125.37（CH），60.57（CH2），57.38（CH2），35.03（CH2），30.75（CH2），30.08（CH2）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［28］報(bào)道一致，因此化合物12鑒定為芳香胺類(lèi)化合物N-（4-羥基）丁酰苯乙胺。

化合物13：黃褐色油狀。正離子模式的ESIMS數(shù)據(jù)：m/z 105.071 4［M+H］+，122.096 9［M+NH4］+，推斷化合物 13對(duì)應(yīng)分子式為C8H11N。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH2.80（t，J=16.0 Hz，2H），3.10（t，J=15.6 Hz，1H），7.40（m，5H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［29］報(bào)道一致，因此化合物13鑒定為已知芳香胺類(lèi)化合物苯乙胺。

圖3 菌株BNG-1中化合物11～28的結(jié)構(gòu)Fig.3 Structures of compounds 11～28 from BNG-1

化合物14：淺黃色結(jié)晶。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH2.66（t，J=15.2 Hz，2H），3.03（t，J=14.8 Hz，2H），7.03（m，3H），7.31（d，J=8.4 Hz，1H），7.52（d，J=8.0 Hz，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［30］報(bào)道一致，因此化合物14鑒定為已知芳香胺類(lèi)化合物色胺，即吲哚乙胺。

化合物 15：黃色固體。1H-NMR（CDCL3，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH2.78（t，J=15.2 Hz，2H），3.12（t，J=14.8 Hz，2H），3.48（s，3H），7.04（s，1H），7.13（t，J=14.4 Hz，1H），7.20（t，J=14.4 Hz，1H），7.36（d，J=8.0 Hz，1H），7.61（d，J=8.0 Hz，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［31］報(bào)道一致，因此化合物15鑒定為已知芳香胺類(lèi)化合物N-甲基色胺。

化合物 16：淡黃色無(wú)定型粉末。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH0.96（m，3H），2.47（m，1H），2.94（m，1H），3.21（dd，J=17.6，10.0 Hz，1H），4.01（s，1H），4.36（s，1H），6.94（s，1H），7.29（m，5H），8.72（s，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［32］報(bào)道一致，因此化合物16鑒定為已知化合物環(huán)（苯丙氨酸-5-甲基-3，4-脫氫脯氨酸）。

化合物 17：褐色無(wú)定型粉末。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH1.73（d，J=6.5 Hz，3H），3.21（m，1H），3.44（m，1H），4.54（m，1H），7.05（m，1H），7.14（m，1H），7.33（m，1H），7.48（m，1H）。13C-NMR（126MHz，MeOD）δ169.45，136.02，128.67，124.82，121.19（CH），118.22（CH），116.70（CH），109.90（CH），103.16，50.96（CH），21.02（CH2），16.11（CH3）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［33］報(bào)道一致，因此化合物17鑒定為已知生物堿類(lèi)化合物 3，4-二氫-3-甲基-β-咔啉-1-酮。

化合物18：淺褐色固體。正離子模式的ESIMS數(shù)據(jù)：m/z206.0772［M+H］+，推斷化合物18對(duì)應(yīng)分子式為C11H11NO3。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH3.06（m，1H），3.24（m，1H），4.40（m，1H），7.09（t，J=14.0 Hz，1H），7.18（t，J=14.0 Hz，1H），7.23（s，1H），7.42（d，J=8.0 Hz，1H），7.68（d，J=7.2 Hz，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［34］報(bào)道一致，因此化合物18鑒定為已知生物堿類(lèi)化合物2-羥基-3-吲哚丙酸。

化合物 19：黃褐色無(wú)定型粉末。1H-NMR（C5D5N，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH2.86（m，2H），3.12（m，2H），7.15（d，J=7.8 Hz，1H），7.31（d，J=7.8 Hz，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［35］報(bào)道一致，因此化合物19鑒定為已知化合物對(duì)羥基苯乙胺。

化合物20：白色無(wú)定型粉末。正離子模式的ESI-MS數(shù)據(jù)：m/z［M+H］+，推斷化合物 20對(duì)應(yīng)分子式為 C16H16N4O2。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH0.79（m，1H），2.01（m，1H），3.20（m，1H），3.51（m，1H），4.07（m，1H），4.33（m，1H），7.06（t，J=14.8 Hz，1H），7.06（m，2H），7.43（m，1H），7.66（d，J=8.0 Hz，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［35］報(bào)道一致，因此化合物20鑒定為已知化合物環(huán)（色氨酸-天冬酰胺）。

化合物21：無(wú)色固體。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH3.25（m，1H），3.55（m，1H），4.14（s，1H），7.09（t，J=14.8 Hz，1H），7.18（t，J=15.2 Hz，1H），7.23（s，1H），7.42（d，J=8.0 Hz，1H），7.68（d，J=7.6 Hz，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［36］報(bào)道一致，因此化合物21鑒定為已知化合物色氨酸。

化合物22：黃色固體。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH0.98（m，12H），1.2-1.4（m，16H），1.70（m，2H），4.25（m，4H），7.63（m，2H），7.73（m，2H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［37］報(bào)道一致，因此化合物22鑒定為已知化合物鄰苯二甲酸異辛酯。

化合物23：白色結(jié)晶。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH0.92（d，J=6.5 Hz，3H），1.08（d，J=6.5 Hz，3H），1.96（m，3H），2.31（m，1H），2.47（m，1H），3.52（m，2H），4.03（s，1H），4.20（t，J=14.0 Hz，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［24］報(bào)道一致，因此化合物23鑒定為已知化合物環(huán)（纈氨酸-脯氨酸）。

化合物 24：白色無(wú)定型粉末。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH0.94（m，6H），1.43（d，J=6.4 Hz，3H），1.60-1.85（m，3H），3.90（m，1H），4.02（m，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［38］報(bào)道一致，因此化合物24鑒定為已知化合物環(huán)（亮氨酸-丙氨酸）。

化合物 25：淺黃色固體。1H-NMR（CDCl3，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH6.21（d，J=2.0 Hz，1H），6.34（d，J=2.0 Hz，1H），6.84（d，J=8.8 Hz，2H），7.36（d，J=6.8 Hz，2H），8.06（s，1H）。13C-NMR （126 MHz，MeOD）δ181.13，164.86，162.73，158.60，157.69，153.66（CH），130.25（CH×2），123.62，122.18，115.13（CH×2），105.15，98.99（CH），93.65（CH）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［39］報(bào)道一致，因此化合物25鑒定為異黃酮類(lèi)化合物5，7，4-三羥基異黃酮。

化合物 26：墨綠色無(wú)定型粉末。1H-NMR（C5D5N，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH2.23（s，3H），2.30（s，3H），3.60（s，6H），7.87（s，1H），8.04（s，1H）。13C-NMR （126MHz，Pyr） δ 162.10，151.84，147.73，144.87，143.09，139.86，139.15，131.05，129.74（CH），127.19（CH），49.69（CH3×2），20.44（CH3），19.86（CH3）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［40］報(bào)道一致，因此化合物26鑒定為已知化合物 2，4-N，N-dimethyllumichrome。

化合物27：白色固體。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH6.83（m，4H），6.93（dd，J=11.2，6.4 Hz，1H），7.01（dd，J=8.0，2.0 Hz，1H），7.35（dd，J=12.0，8.8 Hz，1H），8.05（dd，J=12.0，8.8 Hz，1H），8.11（s，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［41］報(bào)道一致，因此化合物27鑒定為異黃酮類(lèi)化合物5，7，3，4-三羥基異黃酮。

化合物28：無(wú)色固體。正離子模式的ESIMS數(shù)據(jù)：m/z 255.0652［M+H］+，推斷化合物28對(duì)應(yīng)分子式為 C15H10O4。1H-NMR（CD3OD，400 MHz）數(shù)據(jù)如下：δH6.83（d，J=8.4 Hz，3H），6.93（dd，J=11.2，6.4 Hz，1H），7.35（dd，J=14.0，8.8 Hz，2H），8.05（dd，J=14.0，8.8 Hz，1H），8.11（s，1H）。數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［42］報(bào)道一致，因此化合物28鑒定為異黃酮類(lèi)化合物7，4-二羥基異黃酮。

3 討論與展望

通過(guò)對(duì)FBZ-1、BNG-1兩株真菌的次級(jí)代謝產(chǎn)物多樣性研究，發(fā)現(xiàn)其次代產(chǎn)物種類(lèi)少且結(jié)構(gòu)單一，主要是芳香胺、生物堿和二酮哌嗪，可能與實(shí)驗(yàn)采用的浸提、發(fā)酵的方案有關(guān)，具體原因有待后期進(jìn)一步驗(yàn)證。皺瘤海鞘化學(xué)成分研究開(kāi)始較早且比較系統(tǒng)，1989年就報(bào)道了在該海鞘中首次發(fā)現(xiàn)的西松烷型二萜類(lèi)成分 styelolide［43］。從中分離得到的化合物類(lèi)型包括核苷［35］、甾醇、萜類(lèi)、神經(jīng)酰胺［44-46］以及肽類(lèi)成分 plicatamide［47-48］和 tunichrome sp-1［49］；而從其共附生真菌菌株FBZ-1中分離鑒定的次級(jí)代謝產(chǎn)物以環(huán)二肽類(lèi)居多。冠瘤海鞘化學(xué)成分研究目前較少，分離到的主要有混合甾醇、酰胺和酯類(lèi)物質(zhì)［50-52］；從其共附生真菌菌株BNG-1中分離到的化合物有辛酯和酰胺類(lèi)，樣品雖不是采自同一批次同一地點(diǎn)，但通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)共附生微生物與其宿主代謝產(chǎn)物的化合物類(lèi)型存在相似性。另外，從菌株BNG-1中還分離到一種人體必需的色氨酸（不能自身合成，只能靠從外界攝取而來(lái)）。目前該氨基酸在醫(yī)藥和食品行業(yè)用途廣泛，既可以穩(wěn)定抑郁癥患者情緒，還可用作食品添加劑或防腐劑使用［53-54］?；衔?6為對(duì)羥基苯乙胺，通常作為興奮劑使用，還可以用來(lái)緩解偏頭痛以及診斷嗜鉻細(xì)胞瘤，其鹽酸鹽是制備降血脂藥苯扎貝特的中間體（intermediate of bezafibrate）［35，55］?；衔?2可能為溶劑引入的增塑劑成分，化合物25、27和28可能為實(shí)驗(yàn)引入的YPD培養(yǎng)基成分，具體原因有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

研究表明環(huán)二肽類(lèi)物質(zhì)具有廣泛的生物活性如抑菌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病等方面的重要生理活性和應(yīng)用價(jià)值［56-57］。何培青等［58］從北極海洋細(xì)菌Pseudoalteromonas sp.2018中分離鑒定的環(huán)（脯氨酸-酪氨酸）和環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）對(duì)辣椒疫霉（Phytophthora capsici）等多種農(nóng)作物病原真菌具有抑制作用，且最小抑制濃度為125～500μg·mL-1。從菌株FBZ-1中分離出7種環(huán)二肽類(lèi)物質(zhì)，包括環(huán)（脯氨酸-亮氨酸），而淡紫擬青霉（Purpureocillium sp.）對(duì)多種植物病原線(xiàn)蟲(chóng)都具有生物防治作用［59-60］，幾種環(huán)二肽共同作用可能會(huì)增強(qiáng)菌株對(duì)病原真菌的抑制活性，這可能是該菌株防治農(nóng)作物病害的主要機(jī)理。

由于本研究未產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的新化合物，可能是由于本實(shí)驗(yàn)只使用了YPD一種發(fā)酵培養(yǎng)基且培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單的緣故。具體原因有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。周雅琳等［61］曾采用仿生培養(yǎng)和高鹽脅迫兩種不同的發(fā)酵條件誘導(dǎo)珊瑚共附生真菌產(chǎn)生新的氯代產(chǎn)物，研究表明微生物次級(jí)代謝能力是可以通過(guò)多種途徑加以調(diào)節(jié)的，例如環(huán)境脅迫等。在實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)的條件下，調(diào)控特殊結(jié)構(gòu)與功能的次代產(chǎn)物的基因可能不能表達(dá)，而只有在特殊環(huán)境中才能應(yīng)激產(chǎn)生，從而導(dǎo)致代謝通路可能關(guān)閉［62］。因此，仿生培養(yǎng)和高鹽脅迫將是一個(gè)有效的誘導(dǎo)途徑，使微生物體內(nèi)“沉默的基因”表達(dá)出來(lái)，從而獲得良好活性的化學(xué)產(chǎn)物。

后期將進(jìn)一步優(yōu)化真菌的發(fā)酵條件，嘗試使用不同的海洋培養(yǎng)基，擴(kuò)大發(fā)酵規(guī)模并富集微量成分，以期獲得較為復(fù)雜或構(gòu)型特殊的未知化合物。同時(shí)盡量模擬海洋生物原來(lái)的生活環(huán)境，讓共附生微生物在寡營(yíng)養(yǎng)低鹽的仿生培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使用低溫低光照的培養(yǎng)條件，從而有更多的機(jī)會(huì)利用氯來(lái)合成結(jié)構(gòu)新穎、生理活性好的新次級(jí)代謝產(chǎn)物。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)東海主要水產(chǎn)養(yǎng)殖區(qū)海鞘優(yōu)勢(shì)種皺瘤海鞘資源單位產(chǎn)量大于200 g·m-2，分布遍及閩北羅源灣至東海最南端的南澳島北部水域，局部的資源單位產(chǎn)量甚至可以達(dá)到濕重10 kg·m-2以上，資源較為豐富；同時(shí)研究還發(fā)現(xiàn)其化學(xué)成分結(jié)構(gòu)類(lèi)型多變，具有抗腫瘤、抗乙肝病毒等顯著生物活性，提示這些物種具有潛在的重要藥用價(jià)值［5］。因此，充分利用這些海鞘類(lèi)污損生物的資源，深入探究其生物活性成分并規(guī)?；_(kāi)發(fā)具有藥用價(jià)值的海洋新藥具有重要的意義。