海水養(yǎng)殖動(dòng)物源弧菌喹諾酮類藥物耐藥表型與基因型分析

趙 姝，李 健，2，馬立才，劉 旭，2，王 元，房文紅

（1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部東海漁業(yè)資源開發(fā)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200090；2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306）

弧菌是海水養(yǎng)殖環(huán)境中最常見的一類致病菌，廣泛分布于海洋環(huán)境以及海洋生物體表和腸道中［1］。隨著海水養(yǎng)殖規(guī)?；图s化發(fā)展，病害頻繁發(fā)生導(dǎo)致藥物使用增多。喹諾酮類（quinolones）藥物是一類廣譜抗菌藥物，能抑制細(xì)菌的DNA促旋酶和拓?fù)洚悩?gòu)酶IV，導(dǎo)致細(xì)菌DNA的合成受到抑制。喹諾酮類藥物曾是水產(chǎn)養(yǎng)殖主要抗菌藥，目前恩諾沙星仍廣泛用于水產(chǎn)動(dòng)物細(xì)菌性疾病的防治，214株弧菌對其耐藥率為52.3%［2］，抗菌藥的使用導(dǎo)致了細(xì)菌耐藥現(xiàn)象越來越普遍［3］。細(xì)菌對喹諾酮類藥物的耐藥機(jī)制主要為靶酶喹諾酮耐藥決定區(qū)（QRDRs）的突變和主動(dòng)外排系統(tǒng)介導(dǎo)的耐藥，前者目前以質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因（PMQR）為研究熱點(diǎn)，其雖然介導(dǎo)低水平耐藥，但是常與整合子或插入序列相連，并協(xié)同其他耐藥基因［如超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）］一起水平傳播，進(jìn)而對臨床細(xì)菌性疾病的治療帶來了嚴(yán)重的威脅［4］；后者通常引起細(xì)菌的多重耐藥性［5］。主動(dòng)外排系統(tǒng)是細(xì)菌普遍存在的一種耐藥機(jī)制，多見于腸桿菌科的研究報(bào)道［6］。多重耐藥外排泵的底物廣泛，可以外排結(jié)構(gòu)不同的抗菌藥物，目前已報(bào)道的藥物外排泵基因包括 oqxA、oqxB、acrR、marR和 soxR等。外排泵抑制劑可以使細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥性降低，洪捷等［7］研究發(fā)現(xiàn)，添加外排泵抑制劑羰基氰氯苯腙后，43株人源肺炎克雷伯菌對環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的MIC值明顯降低。周維［8］對魚源哈維氏弧菌的研究發(fā)現(xiàn)，加入5μg·mL-1的羰基氰氯苯腙后，10株弧菌的MIC值均下降了2～8倍。本研究擬對在前期開展海水養(yǎng)殖源弧菌耐藥性監(jiān)測過程中獲得的菌株進(jìn)行喹諾酮類藥物耐藥表型和基因型分析，通過比較不同外排泵抑制劑逆轉(zhuǎn)弧菌喹諾酮類藥物耐藥的效果，以期為弧菌耐藥機(jī)制研究提供思路，為海水養(yǎng)殖中弧菌病的防治和喹諾酮藥物耐藥的防控提供一定的理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 菌株來源

121株弧菌為本實(shí)驗(yàn)室于2014—2015年從上海、山東、海南和江蘇等地患病水產(chǎn)動(dòng)物中分離所得，分別為溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）45株，大菱鲆弧菌（V.scophthalmi）42株，哈維氏弧菌（V.harveyi）16株，副 溶 血 弧 菌 （V.parahaemolyticus）14株，鰻弧菌（V.anguillarum）和創(chuàng)傷弧菌（V.vulnificus）各2株。藥敏實(shí)驗(yàn)質(zhì)控菌株大腸埃希菌（Escherichia coli）ATCC25922購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.2 主要試劑

硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（TCBS）、胰蛋白胨大豆肉湯（TSB）和2216E固體培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司。PremixEx TaqTM（Version 2.0 plus dye）、DNA Maker DL2000和瓊脂糖購自上海生工生物科技有限公司；Wizard?基因組DNA純化試劑盒購自普洛麥格（北京）生化科技有限公司。藥敏實(shí)驗(yàn)所用抗菌藥物標(biāo)準(zhǔn)品環(huán)丙沙星、諾氟沙星和恩諾沙星購自中國藥品生物制品檢驗(yàn)所。外排泵抑制劑甲基吡咯烷酮（N-methyl-2-pyrrolidone，NMP）、利血平（Reserpine，RSP）、羰基氰氯苯腙（Carbonyl cyanide m-chlorophenyl hydrazone，CCCP）和苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺（Phe-Arg-βnaphthylamide，PAβN）購自 Sigma公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

恒溫培養(yǎng)箱，MIR-254，日本 Sanyo；恒溫?fù)u床，SHKE5000-8CE，美 國 Thermo；PCR 儀，Mastercycler pro，德國 Eppendorf；電泳儀，DYY-7C，北京六一儀器廠；凝膠成像儀，G05-7500，美國BIO-RAD；超微量分光光度計(jì)，ND5000，北京百泰克生物技術(shù)有限公司；微量移液器，德國Eppendorf。

1.4 菌株DNA的提取

在無菌環(huán)境下，將保存于-80℃的弧菌分區(qū)劃線于TCBS瓊脂平板，28℃培養(yǎng)16—24 h，然后挑取弧菌單菌落接種于2 mL的TSB肉湯（鹽度25）中，28℃搖床中200 r·min-1振蕩培養(yǎng)16—18 h，取1 mL菌液置于離心管中12 000 r·min-1離心2 min收集菌體，參照Wizard?基因組DNA純化試劑盒的操作說明提取PCR模板DNA。利用超微量分光光度計(jì)測定基因組DNA濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

本研究采用美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）描述的瓊脂稀釋法［9］測定試驗(yàn)菌株對喹諾酮類抗菌藥物（恩諾沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星）的敏感性，同時(shí)以大腸桿菌ATCC25922作為質(zhì)控菌株。藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)參考CLSI，每個(gè)菌株做3個(gè)平行。恩諾沙星與諾氟沙星敏感、中介和耐藥判定折點(diǎn)分別為≤4μg·mL-1、8μg·mL-1和≥16μg·mL-1，環(huán)丙沙星敏感、中介和耐藥判定折點(diǎn)分別為≤1μg·mL-1、2μg·mL-1和≥4μg·mL-1。

1.6 外排泵抑制劑作用下各菌株恩諾沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星M IC的測定

實(shí)驗(yàn)前用MH培養(yǎng)基稀釋外排泵抑制劑儲(chǔ)存液，使甲基吡咯烷酮、利血平、羰基氰氯苯腙和苯丙氨酸-精氨酸-β萘酰胺終濃度分別為100μg·mL-1、40μg·mL-1、5μg·mL-1和 100μg·mL-1。4種外排泵抑制劑濃度為本實(shí)驗(yàn)室經(jīng)過預(yù)實(shí)驗(yàn)后確定，其他步驟參考1.5藥物敏感性實(shí)驗(yàn)。

1.7 喹諾酮類藥物耐藥基因和整合子檢測

利用PCR擴(kuò)增的方法檢測試驗(yàn)菌株的外排泵 基 因 （oqxA［5］、oqxB［10］、acrR［11］、marR［11］、soxR［12］）、質(zhì) 粒 介 導(dǎo) 的 喹 諾 酮 耐 藥 基 因（qnrVC［13］、qnrS［14］、qnrA［15］、qnrB［16］）以及 1類整合子 Int1［17］、4類超級(jí)整合子 SXT［18］和 I型插入序列共同區(qū)ISCR1［19］。PCR引物和擴(kuò)增時(shí)退火溫度參考上述文獻(xiàn)；擴(kuò)增產(chǎn)物送往上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥敏實(shí)驗(yàn)

121株弧菌對恩諾沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星敏感性測定結(jié)果見表1。121株弧菌中，對恩諾沙星敏感菌株90株，耐藥菌株有31株；對諾氟沙星敏感菌株90株，中介菌株10株，耐藥菌株21株；對環(huán)丙沙星敏感菌株82株，中介菌株17株，耐藥菌株22株。對恩諾沙星和諾氟沙星雙重耐藥的菌株有10株，諾氟沙星和環(huán)丙沙星雙重耐藥菌株14株，環(huán)丙沙星和恩諾沙星雙重耐藥菌株11株，3種藥物同時(shí)耐藥的菌株10株。

2.2 喹諾酮類藥物相關(guān)耐藥基因檢測

對121株弧菌質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因qnrVC、qnrS、qnrA、qnrB和外排泵基因 oqxA、oqxB、acrR、marR、soxR進(jìn)行檢測，喹諾酮耐藥基因僅檢測到qnrA和qnrVC基因，外排泵耐藥基因僅檢測到oqxB（表 2）。其中，qnrA檢出 2株，檢出率1.65%；qnrVC檢出30株，檢出率24.8%；oqxB僅在1株溶藻弧菌（352菌株）中檢出，檢出率0.83%。對30株qnrVC基因陽性的弧菌菌株進(jìn)行深一步分析發(fā)現(xiàn)，其分為6個(gè)亞型，分別為qnrVC1（6株）、qnrVC3（14株）、qnrVC4（2株）、qnrVC5（4株）、qnrVC6（3株）和 qnrVC7（1株）。

2.3 整合子檢測

121株弧菌中，檢測到含1類整合子Int1菌株39株，含4類超級(jí)整合子SXT菌株42株，含I型插入序列共同區(qū)ISCR1菌株44株。其中，同時(shí)含有3種整合子相關(guān)的弧菌17株，Int1和SXT陽性的弧菌23株，Int1和ISCR1陽性的弧菌30株，SXT和ISCR1陽性的弧菌20株。

表1 121株弧菌對3種喹諾酮類藥物的M IC值分布Tab.1 M IC distribution of 121 Vibrio isolates to Enrofloxacin，Norfloxacin and Ciprofloxacin

表2 121株弧菌耐藥基因檢測結(jié)果Tab.2 Results of resistant genes of 121 Vibrio isolates

表3 121株弧菌整合子檢測結(jié)果Tab.3 Integrons detected in 121 Vibrio isolates

2.4 外排泵抑制劑對弧菌的恩諾沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星M IC的影響

2.4.1 弧菌恩諾沙星MIC的變化

在 NMP、RSP、CCCP和 PAβN作用下，121株弧菌中分別有72株、64株、114株和39株弧菌對恩諾沙星的MIC降低了2倍及2倍以上（表4）。4種抑制劑多以降低2倍MIC為主，CCCP抑制劑的作用最為顯著。PAβN對弧菌恩諾沙星的作用最小，只有32.2%菌株MIC降低了，且最大降低倍數(shù)為4倍。

2.4.2 弧菌諾氟沙星MIC的變化

在 NMP、RSP、CCCP和 PAβN作用下，121株弧菌中分別有52株、43株、106株和33株弧菌對諾氟沙星的MIC降低了2倍及2倍以上（表5）。4種抑制劑多以降低2倍MIC為主，CCCP抑制劑的作用最為顯著。PAβN使27.3%的菌株MIC值有所下降，且大多數(shù)菌株降低倍數(shù)為4倍。NMP使1株弧菌的MIC值降低了32倍。

2.4.3 弧菌環(huán)丙沙星MIC的變化

在 NMP、RSP、CCCP和 PAβN作用下，121株弧菌中分別有60株、40株、80株和47株弧菌對環(huán)丙沙星的MIC降低了2倍及2倍以上（表6）。NMP分別使14株、3株弧菌的MIC值降低了4倍和8倍。PAβN分別使10株和1株弧菌的MIC值降低了4倍和8倍。RSP使14株和4株菌的MIC值降低了4倍和8倍。CCCP是4種藥物中使MIC值降低最多的抑制劑，分別使18株、15株、5株、2株弧菌的MIC值下降了4倍、8倍、16倍和32倍。

表4 外排泵抑制劑對121株弧菌的恩諾沙星M IC的影響Tab.4 Effects of four efflus pump inhibitors on Enrofloxacin's M IC s for 121 Vibrio isolates

表5 外排泵抑制劑對121株弧菌的諾氟沙星M IC的影響Tab.5 Effects of four efflus pump inhibitors on Norfloxacin's M IC s for 121 Vibrio isolates

2.4.4 外排泵抑制劑對弧菌的恩諾沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星耐藥性的影響

4種外排泵抑制劑的效果都很顯著，降低了弧菌對恩諾沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星的耐藥性（表7）。CCCP分別使14株的恩諾沙星耐藥菌株、4株諾氟沙星耐藥菌株、7株環(huán)丙沙星耐藥菌株變成敏感菌株；使17株恩諾沙星耐藥菌株、2株諾氟沙星耐藥菌株、6株環(huán)丙沙星耐藥菌株變成中介菌株。RSP使4株恩諾沙星耐藥菌株、1株諾氟沙星耐藥菌株變成敏感菌株。NMP使15株恩諾沙星耐藥菌株、1株諾氟沙星耐藥菌株、2株環(huán)丙沙星耐藥菌株變成敏感菌株。PAβN使3株恩諾沙星耐藥菌株、1株環(huán)丙沙星耐藥菌株變成敏感菌株。

2.5 弧菌對喹諾酮類藥物耐藥表型和基因型比較分析

對121株弧菌的喹諾酮類藥物耐藥表型和基因型進(jìn)行比較分析（表8），qnrA僅在2株弧菌中檢出，其中1株對環(huán)丙沙星表現(xiàn)為耐藥，對恩諾沙星和諾氟沙星均表現(xiàn)為敏感或中介；在3種喹諾酮類藥物中，qnrVC在耐藥菌株中的檢出率明顯高于敏感或中介菌株，尤其在諾氟沙星和環(huán)丙沙星的耐藥菌株中檢出率明顯高于敏感和中介菌種的檢出率。其中，1類整合子 Int1（51.6%）和I型插入序列共同區(qū)ISCR1（41.9%）在恩諾沙星耐藥菌株中的檢出率均高于敏感和中介菌株的檢出率。外排泵耐藥基因oqxB僅檢出1株，該菌對3種藥物均表現(xiàn)為高耐藥，且不與qnrVC和qnrA共存。

3 討論

3.1 弧菌喹諾酮類藥物耐藥基因攜帶情況

介導(dǎo)喹諾酮類藥物耐藥的機(jī)制可分為垂直傳播的染色體突變耐藥及水平傳播的質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥兩種［20］。qnr基因是已知的一類重要的質(zhì)粒介導(dǎo)的喹諾酮耐藥基因，qnrA是在1998年第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的此類基因，而后，qnrS和qnrB基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)。qnrA、qnrB基因通常與一類整合子相連。在霍亂弧菌中發(fā)現(xiàn)的qnrVC基因位于可移動(dòng)原件上［21］，且在弧菌中分布較多，部分變體以基因盒形式存在于染色體上，另一部分變體則通過轉(zhuǎn)座子或接合性元件等與其他類耐藥基因共同傳播［22］。本實(shí)驗(yàn)中，共檢測到2株弧菌攜帶qnrA基因，且與一類整合子Int1共存，提示qnrA可能與整合子協(xié)同作用介導(dǎo)弧菌的耐藥性。本實(shí)驗(yàn)共檢測到30株弧菌攜帶qnrVC基因，其中，對恩諾沙星耐藥菌株10株，對諾氟沙星耐藥菌株14株，對環(huán)丙沙星耐藥菌株16株，可見，qnrVC陽性菌株并不都表現(xiàn)高水平的喹諾酮類藥物耐藥性。劉旭［3］發(fā)現(xiàn)，雖然qnrVC基因不能介導(dǎo)高水平的耐藥，但其轉(zhuǎn)移性強(qiáng)，并可在不同種細(xì)菌間傳播。KIM等［23］發(fā)現(xiàn)，霍亂弧菌中分離的由SXT攜帶的qnrVC3基因可與多種耐藥基因結(jié)合，導(dǎo)致弧菌的多重耐藥性，并驗(yàn)證了qnrVC基因可相對提高菌株對喹諾酮類藥物的耐藥水平，同時(shí)具有可傳播性。qnrVC已報(bào)道有 7個(gè)亞型［13，24-26］，本研究中檢出的30株qnrVC陽性菌株存在6個(gè)亞型。qnr基因在弧菌中的廣泛分布和較大的基因間變異，以及弧菌對喹諾酮類藥物耐藥表型與基因型存在較大的不一致性，因此推測有更多的qnr基因尚未發(fā)現(xiàn)。

表6 4種外排泵抑制劑對121株弧菌的環(huán)丙沙星M IC的影響Tab.6 Effects of four efflus pump inhibitors on Ciprofloxacin's M IC s for 121 Vibrio isolates

表7 外排泵抑制劑對3種藥物耐藥菌株和中介菌株數(shù)量的改變Tab.7 Susceptibility results and changes in resistance and intermediate isolates

表8 弧菌對喹諾酮藥物耐藥表型和基因型比較分析Tab.8 Comparative analysis of Vibrio quinolone resistance phenotypes and genotypes

3.2 弧菌整合子攜帶情況

整合子是一類能夠捕獲、吸收和表達(dá)外源基因的遺傳元件，在細(xì)菌的耐藥性轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中起到重要的作用，尤其會(huì)加重革蘭氏陰性菌的耐藥現(xiàn)象［27］。其中，SXT元件宿主范圍廣泛，結(jié)合轉(zhuǎn)移頻率高，并且以弧菌中發(fā)現(xiàn)最多；SXT元件可長達(dá)100 kb以上，常攜帶耐藥基因簇floR、strB、sul、dfrA、blaCMY-2等［28］。SXT元件介導(dǎo)的霍亂弧菌或燦爛弧菌基因向大腸桿菌的轉(zhuǎn)移頻率均可高達(dá)10-5～10-6/受體菌［29］。JIANG等［30］從我國養(yǎng)殖源海參中分離得到的87株副溶血弧菌，其中Int1的檢出率達(dá)到了100%。本研究通過對121株弧菌中整合子相關(guān)元件的研究發(fā)現(xiàn)，Int1、SXT和ISCR1的檢出率分別達(dá)到了32.23%（39/121）、34.71%（42/121）和 36.36%（44/121），提示整合子相關(guān)元件的存在可能是弧菌耐藥性傳播的重要分子機(jī)制之一。

3.3 弧菌外排泵與喹諾酮類藥物耐藥性

細(xì)菌抗菌藥物耐藥相關(guān)外排系統(tǒng)的作用機(jī)制主要包括：阻斷外排泵的能量來源、阻礙底物通過外排泵通道、干擾外排泵組裝等。CCCP是抑制質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)的強(qiáng)解偶聯(lián)劑，可自由擴(kuò)散于磷脂膜兩側(cè)，破壞質(zhì)子跨膜梯度，阻斷外排轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)的能量供應(yīng)［31］。利血平是ATP水解能驅(qū)動(dòng)型的外排泵抑制劑，其本身就可作為某些外排泵的底物，可與抗菌藥物競爭結(jié)合外排泵蛋白，進(jìn)而對外排抗菌藥物產(chǎn)生抑制作用［32］。PAβN和NMP均屬于RND特異性外排泵抑制劑，是一類阻礙藥物通過外排泵通道的外排泵抑制劑，其作用機(jī)制為結(jié)合外排泵相應(yīng)位點(diǎn)以阻止其他物質(zhì)與之結(jié)合［33］，從而抑制外排泵底物發(fā)生外排。4種外排泵抑制劑均能有效逆轉(zhuǎn)部分弧菌喹諾酮類藥物的耐藥表型，其中CCCP、RSP和NMP能顯著地降低弧菌對恩諾沙星的耐藥性。

外排泵的外排作用同樣是細(xì)菌喹諾酮類藥物耐藥性的重要形成機(jī)制，oqxB是第一個(gè)質(zhì)粒介導(dǎo)的RND家族多重耐藥外排泵，可水平傳播。本研究對121株弧菌的喹諾酮相關(guān)外排泵基因攜帶情況檢測發(fā)現(xiàn)，這些弧菌中只有一株菌攜帶外排泵基因oqxB，攜帶該基因的菌株具有很高的耐藥表型，對恩諾沙星、諾氟沙星和環(huán)丙沙星的MIC值分別為 16μg·mL-1、32μg·mL-1和 64 μg·mL-1，加入4種外排泵抑制劑以后，3種抗菌藥的MIC值均顯著降低，且以降低4倍及以上為主。陳孝杰［5］實(shí)驗(yàn)研究顯示，食品動(dòng)物源和食品源大腸桿菌中oqxAB基因的檢出率均達(dá)到22.9%，醫(yī)院臨床分離株和寵物源大腸桿菌的檢出率也達(dá)12.3%和12.0%；且oqxAB基因在水產(chǎn)養(yǎng)殖源弧菌中未曾報(bào)道，推測此外排泵抑制劑對弧菌的作用原理與大腸桿菌有所不同，水產(chǎn)上弧菌耐藥的機(jī)制可能由于其攜帶的可移動(dòng)耐藥元件對其他種類細(xì)菌（如大腸桿菌）上攜帶的耐藥基因的傳播而導(dǎo)致的高水平耐藥。在本研究中，外排泵基因oqxB不與qnrVC和qnrA共存，提示外排泵基因可能是單獨(dú)介導(dǎo)弧菌高耐藥現(xiàn)象的重要機(jī)制。此外，本實(shí)驗(yàn)中的外排泵陽性菌株中并未檢出其他種類的外排泵基因，外排泵基因并不能完全解釋弧菌喹諾酮類藥物的耐藥表型，是否還存在其他相關(guān)的喹諾酮類耐藥基因及外排泵基因，還需要進(jìn)一步的研究和探索。

綜上所述，分離自我國海水動(dòng)物的弧菌部分?jǐn)y帶oqxB、qnrVC基因和qnrA基因，多數(shù)弧菌同時(shí)攜帶整合子相關(guān)元件，如Int1、SXT和ISCR1。外排泵抑制劑實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，外排泵抑制劑能夠有效地抑制弧菌對喹諾酮類藥物的外排作用，從而提高弧菌對喹諾酮類藥物的敏感性。本研究結(jié)果為海水養(yǎng)殖源弧菌喹諾酮類耐藥性研究提供了一種新的思路方向。