超聲波輔助提取杭白菊總黃酮工藝條件的優(yōu)化

高 紅，王書琪，孔曉妍，郭黎媛

（山西杏花村汾酒廠股份有限公司技術(shù)中心，山西汾陽 032205）

杭白菊為菊科植物菊Chrysanthemum morifoliumRamat.的干燥頭狀花序，亦名小湯黃、小白菊，與毫菊、滁菊、貢菊并稱為中國馳名的四大名菊。杭白菊性微寒，味苦、甘，歸肺、肝經(jīng)，具有散風(fēng)清熱、平肝明目、清熱解毒之功效，用于風(fēng)熱感冒、頭痛眩暈、目赤腫痛、眼目昏花、瘡癰腫毒[1]。杭白菊的化學(xué)成分主要包括黃酮類、揮發(fā)油、三萜類、甾體類、酚類、多糖及微量元素等，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)主要為黃酮類、揮發(fā)油類成分[2]。黃酮類物質(zhì)是杭白菊的主要生物活性成分之一，包括黃酮、黃酮醇和黃烷酮3 類[3]，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降血脂、抗腫瘤等功能[4-5]。杭白菊總黃酮提取方法有直流回流法[6]、浸提法[7]等，本研究采用超聲波輔助提取法，具有時(shí)間短、提取效率高的特點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

樣品：杭白菊；65%vol汾酒優(yōu)質(zhì)大曲。

試劑：乙醇；蘆丁對(duì)照品（Dr.Ehrenstorfer GmbH；Rutin hydrate C 168000；Lot：80212 0.5 g 98.0 % Rcode 36137138S-code22-25）；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純；蒸餾水。

儀器設(shè)備：超聲波清洗器，LQ-300DE 昆山超聲波儀器有限公司；紫外可見分光光度計(jì)，UV-2450 日本島津公司；電子天平，AB204-S 梅特勒公司；容量瓶；移液管；三角瓶；燒杯；玻璃棒；量筒；濾紙；漏斗；微量進(jìn)樣器；膠頭滴管。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

表1 超聲波提取杭白菊總黃酮正交試驗(yàn)因素水平

1.2.1.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品7.5 mg，加入50%vol 乙醇溶解，并定容至50 mL 容量瓶中，搖勻，制成0.15 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，加入5 %亞硝酸鈉溶液0.3 mL,搖勻并靜置6 min，再加入10 %氫氧化鋁溶液0.3 mL，搖勻并放置6 min，最后加入4 %氫氧化鈉溶液4 mL，加50%vol乙醇稀釋至刻度，搖勻并放置15 min。

用另一10 mL 容量瓶在不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的基礎(chǔ)上重復(fù)上述加樣步驟作為空白對(duì)照，在200～600 nm 波長范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，選擇最大吸收峰所在波長為后續(xù)測定波長。

1.2.1.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確量取1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL、3.5 mL、4.0 mL、4.5 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液于10 mL容量瓶中，按1.2.1.1 方法在510 nm 波長處測定吸光度。以吸光度A 為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)，線性回歸得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 杭白菊單因素試驗(yàn)

1.2.2.1 乙醇濃度的單因素試驗(yàn)

將杭白菊以1∶20 的比例分別浸泡在40%vol、50%vol、60%vol、70%vol、80%vol 的乙醇溶液中，24 h 后在60℃、50 Hz 下超聲提取50 min，將三角瓶取出，過濾后取0.1 mL上清液測定。

1.2.2.2 料液比的單因素試驗(yàn)

將杭白菊分別以1∶9、1∶12、1∶15、1∶18、1∶21的比例浸泡在70 %vol 的乙醇中，24 h 后在60 ℃、50 Hz 下超聲提取50 min，取出三角瓶，過濾收取0.1 mL上清液測定。

1.2.2.3 提取時(shí)間的單因素試驗(yàn)

將杭白菊以1∶10 的比例浸泡在70 %vol 的乙醇中，在60 ℃、50 Hz下分別超聲提取30 min、50 min、70 min、90 min、110 min，在不同時(shí)間將三角瓶取出，過濾取0.05 mL上清液測定。

1.2.2.4 提取溫度的單因素試驗(yàn)

將杭白菊以1∶10 的比例浸泡于70 %vol 的乙醇中，分別在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃下提取70 min 后將三角瓶取出，過濾取0.05 mL 上清液測定。

1.2.3 杭白菊正交試驗(yàn)

通過以上單因素試驗(yàn)針對(duì)各因素分別篩選出以下范圍進(jìn)行4 因素3 水平的正交試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn) 曲 線：y=14.786x-0.0079，R2=0.9991。結(jié)果 見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 杭白菊單因素試驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度相關(guān)試驗(yàn)（圖2）

如圖2 所示，在乙醇濃度達(dá)到70%vol 時(shí)，杭白菊黃酮的提取量最大，這說明乙醇濃度的提高有助于杭白菊黃酮的提取，但當(dāng)濃度進(jìn)一步增大時(shí)，醇溶性雜質(zhì)會(huì)進(jìn)一步增多，反而不利于細(xì)胞內(nèi)黃酮的溶出，最佳乙醇濃度選擇70%vol。

圖2 乙醇濃度對(duì)總黃酮提取量的影響

2.2.2 料液比相關(guān)試驗(yàn)（圖3）

圖3 料液比對(duì)總黃酮提取量的影響

如圖3 所示，隨著料液比提取出的總黃酮量持續(xù)下降，當(dāng)料液比為1∶9 時(shí)提取量達(dá)到最高值；但繼續(xù)增大溶劑用量至料液比為1∶21 時(shí)，提取量反而下降。表明適度增加溶劑可能有利于黃酮溶出，但過多的溶劑使黃酮的溶解量趨于飽和，從而增加杭白菊內(nèi)其他醇溶性雜質(zhì)的溶出。因此，根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)情況確定最佳料液比為1∶10。

2.2.3 提取時(shí)間相關(guān)試驗(yàn)（圖4）

圖4 提取時(shí)間對(duì)總黃酮提取量的影響

如圖4 所示，當(dāng)提取時(shí)間為70 min 時(shí)，杭白菊黃酮提取量最高；當(dāng)進(jìn)一步延長超聲作用時(shí)間，黃酮得量反而有輕微下降，原因可能是長時(shí)間的超聲作用改變了超聲環(huán)境，會(huì)破壞黃酮化合物的結(jié)構(gòu)，因此超聲時(shí)間選擇70 min為宜。

2.2.4 提取溫度相關(guān)試驗(yàn)（圖5）

圖5 提取溫度對(duì)總黃酮提取量的影響

如圖5 所示，當(dāng)提取溫度在30～50 ℃時(shí)，提取的總黃酮量隨提取溫度的升高而升高，當(dāng)提取溫度為50 ℃時(shí)，總黃酮提取量最大；當(dāng)提取溫度為60 ℃時(shí)，總黃酮提取量反而有一定幅度下降；其中在提取溫度范圍為30～50 ℃時(shí)，總黃酮提取量隨溫度上升而顯著升高，說明此范圍內(nèi)提取溫度的升高能促進(jìn)超聲波對(duì)杭白菊細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損壞，從而有利于總黃酮的溶出；但是當(dāng)溫度繼續(xù)升高時(shí)，過高的溫度會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的變性凝固，阻礙細(xì)胞中總黃酮的溶出，從而使總黃酮提取量下降。因此，確定最佳提取溫度為50 ℃。

2.3 杭白菊正交試驗(yàn)（表2、表3）

表2 超聲波提取杭白菊總黃酮正交試驗(yàn)表

由表3 可知，料液比對(duì)總黃酮提取的影響呈顯著差異。從極差分析可以看出，影響最大的因素為料液比，影響最小的為乙醇濃度；4 個(gè)影響因素的主次順序依次為B＞C＞D＞A，即料液比＞提取時(shí)間＞提取溫度＞乙醇濃度。綜合以上分析結(jié)果，確定超聲波提取杭白菊總黃酮的最佳工藝條件為A3B1C3D2，即乙醇濃度70 %vol，料液比1∶10，提取時(shí)間90 min，提取溫度50 ℃。

表3 杭白菊總黃酮提取正交試驗(yàn)方差分析表

2.4 最佳工藝驗(yàn)證結(jié)果

為了確認(rèn)正交試驗(yàn)得到的優(yōu)化組合條件A3B1C3D2的可靠性，進(jìn)行了優(yōu)化組合的驗(yàn)證試驗(yàn)以乙醇濃度70 %vol、料液比1∶10、提取時(shí)間90 min、提取溫度60 ℃為提取條件進(jìn)行杭白菊總黃酮提取。3 次重復(fù)后，總黃酮提取量分別為4.402 g/L、4.477 g/L、4.422 g/L，平 均 值4.434 g/L，RSD 為0.876 %，均高于正交試驗(yàn)中的任意組合的總黃酮超聲波提取量，說明本工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

本研究結(jié)果表明，杭白菊總黃酮超聲波提取工藝的最佳條件為：乙醇濃度70%vol、料液比1∶10、提取時(shí)間90 min、提取溫度60 ℃。在此提取工藝條件下，總黃酮的提取量為4.434 g/L。這一研究結(jié)果與傳統(tǒng)浸提法相比，在縮短提取時(shí)間的同時(shí)提高了總黃酮的提取效率。