大曲糖化力測定方法的優(yōu)化

馬 群，汪彩莉，李曉環(huán)，程險峰，汪棉坤

（湖北白云邊酒業(yè)股份有限公司，湖北松滋 434200）

大曲是釀酒生產的主要糖化發(fā)酵劑，素有“曲乃酒之骨”之稱。糖化力指的是大曲中具有糖化作用的微生物及酶將淀粉分解為葡萄糖的能力，是衡量大曲糖化作用強弱的一個重要指標，是大曲最為重要的理化考核指標之一。準確分析大曲糖化力對指導釀造生產的意義重大。斐林試劑法測定糖化力滴定終點顏色變化明顯，易于分辨。白云邊酒是兼香型的典型代表，具有獨特的生產工藝。白云邊采取高溫曲、中溫曲分開制曲，結合使用的方式進行。而高溫曲和中溫曲糖化力差別巨大，依靠傳統(tǒng)的檢測方法很容易出現(xiàn)檢測誤差。所以本文針對這一特殊現(xiàn)象，在原有檢測方法的基礎上進行了適當?shù)恼{整，探索更適合白云邊大曲糖化力的檢測方法，保證檢測結果的準確性。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 試驗材料

白云邊成品曲倉庫隨機抽取儲存期達到3 個月以上的高溫大曲。

1.1.2 試劑葡萄糖標準溶液（1.0 g/L）：準確稱取已烘干的無水葡萄糖1.0 g，用水溶解，加約5 mL 濃鹽酸（防腐），并用水溶至1000 mL。

醋酸-醋酸鈉緩沖溶液（pH4.6）

2 mol/L醋酸溶液：量取118 mL冰醋酸，加水稀釋至1000 mL。

2 mol/L 醋酸鈉溶液：稱取272 g 醋酸鈉(CH3COONa·3H2O)，加水溶解，并用水稀釋至1000 mL。將以上兩種溶液等體積混合均勻。

淀粉溶液（20 g/L）：稱取20.00 g 預先以100～105 ℃烘干2 h 的可溶性淀粉，用水調成糊狀，不斷攪拌下注入800 mL 沸水，繼續(xù)煮沸至透明，冷卻后，在1000 mL 容量瓶中定容至刻度，搖勻，當天配制使用，若使用量減小，可按比例減少配制量。

氫氧化鈉溶液C(NaOH)＝0.1 mol/L：稱取4 g 分析純氫氧化鈉，加少量蒸餾水溶解并稀釋至1000 mL，搖勻，貯存于聚乙烯瓶中（不必標定其準確濃度）。

斐林試劑甲液：稱取15 g硫酸銅（CuSO4·5H2O）、0.05 g次甲基藍，用水溶解并稀釋至1000 mL。

斐林試劑乙液：稱取50 g 酒石酸鉀鈉、54 g 氫氧化鈉、4 g亞鐵氰化鉀，用水溶解并稀釋至1000 mL。

1.1.3 儀器設備

恒溫水浴鍋、250 mL 燒杯、50 mL 容量瓶、滴定管、三角瓶、電爐。

1.2 試驗方法

1.2.1 原糖化力檢測方法

固體曲浸出液的制備：按計算量，稱取相當于5.00 g 絕干曲的試樣量，置于250 mL 燒杯中，加入90 mL 水及pH4.6 的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液10 mL，攪勻。置燒杯于35 ℃恒溫水浴中保溫1 h，間隔15 min攪拌1 次。浸出液用脫脂棉或多層紗布過濾，濾液盡快測定。

糖化液的制備：吸取25.0 mL 的20 g/L 淀粉溶液于50 mL容量瓶中，加pH4.6的緩沖溶液5 mL，將容量瓶置于35 ℃水浴中保溫10 min。加入5.00 mL固體曲浸出液，立即混勻計時。準確于35 ℃下保溫1 h，迅速加入15 mL 的0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液，終止酶解反應。冷卻至室溫后，用水定容至50 mL，搖勻，得到糖化液。

空白對照：吸取25.0 mL 20 g/L淀粉溶液于50 mL容量瓶中，加入pH4.6 的緩沖溶液5 mL。先加入15 mL 的0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液，然后再準確加入5.00 mL固體曲浸出液，用水定容至50 mL，搖勻。

測定：吸取斐林試劑甲液、乙液各5.0 mL 于150 mL 三角瓶中，加入5.0 mL 制備好的糖化液，自滴定管中加入一定量1.0 g/L 的葡萄糖標準溶液(使隨后滴定時其用量不超過1 mL)，于電爐上加熱至沸騰，保持沸騰2 min，在沸騰狀態(tài)下繼續(xù)用1.0 g/L葡萄糖標準溶液滴定至藍色剛好消失而呈淺黃色，記錄葡萄糖標準溶液的總用量。此滴定操作需在1 min內完成。其消耗的1.0 g/L葡萄糖標準溶液應控制在1 mL內。同時作一空白試驗。

空白試驗：吸取斐林試劑甲液、乙液各5.0 mL于三角瓶中，加入5.0 mL 制備好的空白液，以下操作同試樣的測定。

計算：固體曲糖化力的定義：在35 ℃，pH4.6時，1 g 絕干曲1 h 內酶解可溶性淀粉為葡萄糖的量。

式中：X——糖化力，葡萄糖mg/g·h；

V0——空白試驗葡萄糖標準溶液的用量，mL；

V——試樣測定葡萄糖標準溶液用量，mL；

ρ——葡萄糖標準溶液的濃度，g/mL；

m——以絕干曲計的試樣稱取量（5.00 g）；

t——酶解時間，h。

1.2.2 傳統(tǒng)檢測方法的弊端分析

斐林試劑法測大曲糖化力，滴定終點顏色變化明顯，易于分辨。由于生產工藝的不同，高溫大曲和中溫大曲的糖化力差別較大，白云邊公司高溫曲糖化力的標準是100～300 mg/g·h，中溫曲糖化力的標準是≥500 mg/g·h。然而對于計算公式：

如果斐林試劑甲液、乙液按5 mL 來計算，V0值一般小于10.0 mL。將公式中ρ 為0.1 % g/ mL，m為5.00 g，t 為1 h。分別代入公式計算得出X=（V0-V）×40，也就是說糖化力的最大測定值為400 mg/g·h，即在V 值為0 時測得，V 值為0 的試驗現(xiàn)象就是在測定時加入測試的糖化液后，不需要再加入標準葡萄糖液滴定，溶液直接變?yōu)闇\黃色，到達滴定終點。這種試驗現(xiàn)象表明，樣品中加入的糖化液足夠將5 mL斐林試劑甲液、乙液氧化，不需要再滴定葡萄糖標準溶液。也就是說在糖化力大于400 mg/g·h 時無法測得準確結果，即測定高溫曲的糖化力采用此方法是適用的，但是中溫曲的糖化力一般大于500 mg/g·h，用此方法則測定不出準確結果。

1.2.3 檢測方法的優(yōu)化

1.2.3.1 加大斐林試劑甲液、乙液的用量

在其他測試液用量不變的條件下，加大斐林試劑甲液、乙液的用量，將原檢測方法中的5 mL 增加為10 mL，代入計算公式后V0則增大為以前的2倍，此時的V0≤20.0 mL，代入計算公式X=（V0-V）×40，在V 值為0 時，X 的最大測定值為800 mg/g·h。當中溫曲的糖化力小于800 mg/g·h時，用這種方法可以測定出準確結果。

1.2.3.2 減少試液用量

斐林試劑甲液、乙液用量不變，在1.2.1 中的糖化過程中，固體曲浸出液的吸取量由原先的5.0 mL減少為2.0 mL；在1.2.1 的測定過程中，糖化液的加入量也由原先的5.0 mL 減少為2.0 mL。此時原來的公式中的系數(shù)也有相應改變：

將公式中ρ 為0.1%g/mL，m 為5.00 g，t 為1 h。分別代入公式計算得出X=（V0-V）×250，計算公式中的系數(shù)由原來的40 增大至250，在V0≤10.0 時，X的最大測定值為2500 mg/g·h。最大測定值遠遠高于白云邊公司中溫曲的糖化力。所以減少試液用量的方法測定中溫曲糖化力是可行的。

2 結果與分析

2.1 比較兩種優(yōu)化后的試驗方法

為了比較兩種方法測定結果的準確度和精密度，我們取了同一個中溫曲樣品，分別用兩種試驗方法測定，每種方法都測定了7 組數(shù)據(jù)。為了便于統(tǒng)計，我們把增大斐林試劑甲液、乙液用量的方法稱為方法一，減少試液用量的方法稱為方法二。兩種測定方法測得的糖化力結果見表1。

表1 中溫曲糖化力測定結果對照表 (mg/g·h)

2.2 準確度的比較

準確度是指測量值與真實值之間相符合的程度。準確度的高低常以誤差的大小來衡量。即誤差越小，準確度越高；誤差越大，準確度越低。由于樣本的真實值是不可知的，在日常分析工作中，總是對某試樣平行測定，取其算術平均值作為真實值。從表1 可知，用方法一測得樣品糖化力的平均值為680 mg/g·h，可以作為方法一測得的真實值用于計算該組數(shù)據(jù)的相對誤差；用方法二測得樣品糖化力的平均值為675 mg/g·h，可以作為方法二測得的真實值用于計算該組數(shù)據(jù)的相對誤差。相對誤差是指誤差在真實值中所占的百分率。相對誤差的表示方法是：

圖1 糖化力測定值相對誤差對比圖

由圖1 可以看出，用方法二測定的一組數(shù)據(jù)的相對誤差值明顯要比用方法一測定的大，即方法一測定糖化力大小的準確度要顯著高于方法二。

2.3 精密度的比較

精密度是指在相同條件下n 次重復測定結果彼此相符合的程度。精密度的大小用偏差表示，偏差愈小說明精密度愈高。絕對偏差表示單個樣本的精密度，用測定值減平均值來表示。

在數(shù)理統(tǒng)計中，一般測定次數(shù)有限，常用樣本標準偏差來表示精密度，其數(shù)學表達式（貝塞爾公式）為：

上式中xi為單個樣本值，為樣本平均值。（n-1）在統(tǒng)計學中稱為自由度，即在n 次測量中，只有（n-1）個獨立可變的偏差，因為n 個絕對偏差之和等于0，所以只要知道（n-1）個絕對偏差，就可以確定第n個的偏差值。

表2 糖化力測定值絕對偏差對照表

方法一和方法二兩種測量結果，每次測量值的絕對偏差見表2。

通過表2 的絕對偏差值（xi）代入貝賽爾公式計算樣本標準偏差（S）分別為：

比較樣本標準偏差S1和S2可以說明第1 組數(shù)據(jù)的精密度高。因為第2 組數(shù)據(jù)較集中且接近標準數(shù)據(jù)。由此可見，欲使準確度高，首先必須要求精密度也要高，但精密度高并不說明準確度也高，因為可能在測定中存在系統(tǒng)誤差，但精密度是保證準確度的先決條件。

3 結論

應用數(shù)理統(tǒng)計的方法我們比較了兩種方法測定結果的準確度和精密度，結論是方法一測定結果的準確度和精密度都高于方法二。因為在測定過程中定糖時濾液吸取量和斐林試劑甲液、乙液的用量改變了，這種改變使糖化力含量計算公式后面的系數(shù)發(fā)生變化。

滴定管的最小刻度是0.1 mL，即在滴定終點時，葡萄糖用量相差0.1 mL，用方法一就會帶入4 mg/g·h的絕對誤差，而方法二則代入25 mg/g·h 的絕對誤差。而滴定管在到達滴定終點時，由于滴定操作的差異，容易造成±0.1 mL～±0.3 mL 的滴定誤差。這就給測得的結果帶來相應誤差，方法一會帶入±4 mg/g·h～±12 mg/g·h 的相對誤差，方法二則是±25 mg/g·h～±75 mg/g·h 的相對誤差。也就是說，定糖操作時用方法一可以盡最大可能地減少由于人為操作引起的滴定誤差。

在日常的化驗工作中我們應該針對具體問題具體分析，白云邊高溫曲直接用原實驗方法就能很準確的測定出糖化力?；跍蚀_度和精密度考慮，測定白云邊中溫曲糖化力時我們宜選用優(yōu)化方案一，若糖化力高于800 mg/g·h，用方案一無法測定準確結果時，則改為方案二。