人胃癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)新藤黃酸含量測定HPLC法的建立及應(yīng)用

劉世娟 侯甲福 王春妍 李雪梅

[摘要] 目的 建立高效液相色譜法測定人胃癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)新藤黃酸含量的方法。 方法 采用高效液相色譜法，選取人胃癌SGC-7901細(xì)胞（貼壁細(xì)胞），色譜條件：色譜柱采用COSMOSIL C18，檢測波長為360 nm，流動相為乙腈-0.1%乙酸水溶液（9：1），流速1 mL/min，柱溫30℃。并對線性、穩(wěn)定性、精密度、加樣回收率和SGC-7901細(xì)胞內(nèi)樣品進(jìn)行考察。 結(jié)果 新藤黃酸在（0.5～16）μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回歸方程Y=3256X+517（r2=0.9995，n=6），穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)5 d、10 d后RSD分別為1.73%、1.42%，精密度實(shí)驗(yàn)0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL濃度的RSD分別為1.33%、1.75%、0.76%、1.28%，平均加樣回收率為100.11%（RSD=0.57%，n=4）。每毫克蛋白含藥量為1.22、1.17、1.24、1.19、1.21 μg/mg，RSD=2.24%。 結(jié)論 本實(shí)驗(yàn)方法簡便可靠、精密度高、重復(fù)性好，適用于人胃癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)新藤黃酸含量的測定。

[關(guān)鍵詞] 新藤黃酸;高效液相色譜法;SGC-7901;含量

[中圖分類號] R285.5? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] B? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）19-0048-03

[Abstract] Objective To establish a high performance liquid chromatography（HPLC） method for the content determination of neogambogic acid in human gastric cancer SGC-7901 cells. Methods Human gastric cancer SGC-7901 cells（adherent cells） were selected by high performance liquid chromatography（HPLC）. Chromatographic conditions： COSMOSIL C18 was for chromatographic column and the detection wavelength was 360 nm. The mobile phase was acetonitrile-0.1% aqueous acetic acid（9：1）， the flow rate was 1 mL/min， and the column temperature was 30℃. Linearity， stability， precision， sample recovery rate and intracellular sample of SGC-7901 were investigated. Results The neogambogic acid had a good linear relationship within the concentration range of（0.5-16）μg/mL. The regression equation was Y=3256X+517（r2=0.9995， n=6）. The RSD of the stability experiment was 1.73% and 1.42% after 5 d and 10 d， respectively. The RSD of the precision experiments at 0.5， 1.0， 2.0， and 4.0 μg/mL were 1.33%， 1.75%， 0.76%， and 1.28%， respectively. The average sample recovery rate was 100.11%（RSD=0.57%， n=4）. The amount of protein per mg was 1.22， 1.17， 1.24， 1.19， 1.21 μg/mg， RSD=2.24%.? Conclusion This experimental method is simple， reliable， and with high precision and good repeatability. It is suitable for the content determination of neogambogic acid in human gastric cancer SGC-7901 cells.

[Key words] Neogambogic acid; High performance liquid chromatography; SGC-7901; Content

新藤黃酸是藤黃科植物藤黃（Garcinia hanburyi Hook.f.）分泌的干燥樹脂中的抗腫瘤活性成分[1]，具有毒性低、抗瘤譜廣的特點(diǎn)，對人胃癌SGC-7901細(xì)胞、肺腺癌A-549細(xì)胞、人胃癌MGC-803細(xì)胞增殖均有一定的抑制作用[2]。新藤黃酸本身理化性質(zhì)較差，在新劑型方面的研究也較多，所以精確測定細(xì)胞內(nèi)藥物含量就變得尤為重要，而目前多采用熒光標(biāo)記的方法常常會有熒光丟失等因素的影響，導(dǎo)致含量的測定不夠準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法直接測定腫瘤細(xì)胞內(nèi)新藤黃酸的含量，能準(zhǔn)確定量藥物含量，為定量研究腫瘤細(xì)胞內(nèi)藥物含量的方法提供思路[3-5]。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（美國安捷倫公司Agilent 1260），二氧化碳培養(yǎng)箱（日本三洋公司MCO-18AC），倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司CKX41），調(diào)速多用振蕩器（常州國華有限公司HY-4）。

1.2 藥品與試劑

新藤黃酸（牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)研究所提供，純度>98%），藤黃酸（牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)研究所提供，純度>98%），RPMI-1640培養(yǎng)基（美國GIBCO公司，批號：1790007），無支原體新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司，批號：180503），RIPA裂解液（碧云天生物技術(shù)），人胃癌SGC-7901細(xì)胞（牡丹江醫(yī)學(xué)院藥學(xué)研究所提供）。

1.3 溶液的制備[6，7]

1.3.1 儲備液的配制? 電子分析天平稱取新藤黃酸（NGA）、藤黃酸（GA）各10.0 mg，用甲醇10 mL容量瓶內(nèi)定容，混勻溶解得1 mg/mL溶液，4℃儲存。

1.3.2 細(xì)胞裂解液的制備? 將SGC-7901于六孔板培養(yǎng)，保持貼壁狀態(tài)下用磷酸鹽緩沖液（PBS）小心沖洗3次，每孔加入200 μL的RIPA裂解液，裂解1 min后收集裂解液。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)液的制備? 空白細(xì)胞液的制備：未給藥的SGC-7901細(xì)胞用RIPA裂解液裂解，得空白細(xì)胞液。樣品的制備：取90 μL空白細(xì)胞液，分別加入一定濃度的樣品溶液與GA內(nèi)標(biāo)液各10 μL，混勻后加入1 mL乙酸乙酯，旋渦萃取3 min后，3500 r/min離心8 min，取上清液0.9 mL，N2濃縮吹干，滴入100 μL甲醇溶解，1000 r/min離心15 min，取20 μL測定NGA含量。

1.4 含量測定

1.4.1 色譜條件? 色譜柱：COSMOSIL C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）;流動相：乙腈-0.1%乙酸水溶液（9：1）;流速1 mL/min;檢測波長：360 nm;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：20 μL。

1.4.2 專屬性實(shí)驗(yàn)? “按1.3.2”項(xiàng)下方法，分別制備細(xì)胞空白基質(zhì)、NGA+GA+細(xì)胞空白基質(zhì)、NGA+細(xì)胞空白基質(zhì)、GA+細(xì)胞空白基質(zhì)、NGA+GA甲醇溶液，按“1.4.1”項(xiàng)下條件進(jìn)行專屬性實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制? 用甲醇稀釋NGA儲備液濃度依次為5、10、20、40、80、160 μg/mL;精密量取“1.3.1”項(xiàng)下方法的GA樣品溶液并稀釋至濃度40 μg/mL，按照“1.3.2”項(xiàng)下方法制備不同濃度樣品，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 精密度? 精密量取NGA，按照“1.3.2”項(xiàng)下方法配制成樣品濃度至0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL，測量批內(nèi)精密度（n=6），再連續(xù)進(jìn)樣3 d測量批間精密度（n=6）。

1.4.5 穩(wěn)定性? 精密量取NGA，按照“1.3.2”項(xiàng)下方法配制成2批樣品，濃度為0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL，兩批樣品不復(fù)溶（n=6），分別放置5 d、10 d后，加入100 μL甲醇復(fù)溶后測定。

1.4.6 加樣回收率? 按照“1.3.2”項(xiàng)下方法制備濃度為0.5、1.0、2.0、4.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別置于5 mL容量瓶內(nèi)，分別加入NGA 2.0 μg于容量瓶，用相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)液定容。按照“1.3.3”項(xiàng)下方法處理，進(jìn)入HPLC進(jìn)行測定，記錄峰面積，計(jì)算回收率。

1.4.7 人胃癌SGC-7901細(xì)胞內(nèi)樣品測定? 培養(yǎng)SGC-7901細(xì)胞于六孔板，鋪滿單層細(xì)胞后加入20 μg/mL的NGA，2 h后終止（n=5），PBS小心沖洗3次，加入裂解液，1 min后取100 μL含藥裂解液，加入內(nèi)標(biāo)按照“1.3.2”項(xiàng)下處理，測定含量。另取20 μL測定蛋白濃度，以每毫克蛋白所含藥物量為計(jì)量單位，測定每毫克蛋白含藥量。

2 結(jié)果

2.1 專屬性結(jié)果

通過實(shí)驗(yàn)排除是否有內(nèi)源性物質(zhì)在360 nm波長處有所吸收，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果未發(fā)現(xiàn)在該波長處有其他吸收峰，專屬性結(jié)果顯示，細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)源性物質(zhì)對NGA與GA的測定不存在干擾，并且峰形良好，可以進(jìn)行實(shí)驗(yàn)（圖1）。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X，μg/mL）、峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行線性回歸，回歸方程Y=3256X+517（r2=0.9995，n=6）。結(jié)果表明NGA在（0.5～16）μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（圖2）。

2.3 精密度結(jié)果

樣品的定量下限、低、中、高濃度RSD分別為1.33%、1.75%、0.76%、1.28%，RSD值均<10%，表明本方法精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性結(jié)果

為保證實(shí)驗(yàn)可靠，采用2個時間點(diǎn)來檢查樣品穩(wěn)定性，兩批樣品分別放置5 d、10 d后RSD分別為1.73%和1.42%，RSD值均<10%，說明本法處理樣品在10 d內(nèi)穩(wěn)定，測定NGA細(xì)胞內(nèi)含量穩(wěn)定性良好。 2.5 加樣回收率結(jié)加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示平均加樣回收率為100.11%，RSD=0.57%（n=4），表明加樣回收率良好，實(shí)驗(yàn)方法可行。見表1。

2.6 SGC-7901細(xì)胞內(nèi)樣品測定

每毫克蛋白含藥量為1.22、1.17、1.24、1.19、1.21 μg/mg，RSD=2.24%，結(jié)果表明可以通過本方法測定細(xì)胞內(nèi)NGA的含量。

3 討論

藤黃其主要活性成分為GA、NGA，國內(nèi)外對GA與NGA的抗腫瘤活性報(bào)道也較多，王云龍等[8]研究NGA干預(yù)肺腺癌血管生成，蘇婧婧等[9]發(fā)現(xiàn)NGA可對人胃癌SGC-7901細(xì)胞增殖進(jìn)行抑制并產(chǎn)生誘導(dǎo)凋亡作用，談永進(jìn)等[10]研究發(fā)現(xiàn)NGA可誘導(dǎo)黑色素瘤B16細(xì)胞凋亡，戴婷婷等[11]發(fā)現(xiàn)NGA可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞凋亡。

NGA在新劑型的方面研究也有許多報(bào)道，如mPEG修飾的NGA介孔硅納米粒的制備與研究[12]、NGA的羥丙基-β-環(huán)糊精包合物凍干粉[13]、磁性納米Fe3O4載NGA復(fù)合物的制備與研究[14]等，同時也有學(xué)者通過對NGA結(jié)構(gòu)進(jìn)行改造提高其理化性質(zhì)，如胡鐘[15]研究NGA衍生物的設(shè)計(jì)、合成與抗腫瘤作用，但是NGA在癌細(xì)胞內(nèi)的含量測定方法與實(shí)踐鮮有報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)旨在通過簡單易行的方法測定NGA在癌細(xì)胞中的含量。

實(shí)驗(yàn)中對NGA與GA分別進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果顯示GA在217 nm、290 nm、362 nm有最大吸收，NGA在214 nm、358 nm最大吸收，因此綜合考慮選用360 nm波長進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)研究表明該波長處無干擾。流動相曾試用甲醇-0.1%乙酸水進(jìn)行洗脫，但保留時間過長且目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰不能達(dá)到基線分離，選用乙腈-0.1%乙酸水，保留時間適中，峰形對稱，目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰能達(dá)到基線分離。柱溫選擇時，在相同條件下對比20℃、25℃、30℃及35℃共4個溫度，結(jié)果顯示，30℃時比20℃、25℃時保留時間短，同時又比35℃時分離度高，因此柱溫選擇30℃。樣品進(jìn)行處理時嘗試過超聲裂解物理裂解法提取待測樣品，發(fā)現(xiàn)用時較長且裂解不完全，采用RIPA裂解簡單方便，裂解完全，所以采用RIPA裂解液進(jìn)行處理。

本實(shí)驗(yàn)僅采用一種癌細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對象，因此不排除因?yàn)榧?xì)胞株的不同而引起的誤差，因此還需要進(jìn)一步測定細(xì)胞蛋白濃度，以精確測定細(xì)胞內(nèi)的藥物含量，因此本實(shí)驗(yàn)通過測定每毫克蛋白含量來判定SGC-7901細(xì)胞中含有NGA的量，保證了實(shí)驗(yàn)方法和數(shù)據(jù)的可靠性。本實(shí)驗(yàn)方法的建立為定量研究細(xì)胞內(nèi)的藥物含量提供了一定的思路，為今后NGA的藥物動力學(xué)研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)與理論基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2019-03-15）