HPLC法測定喘嗽寧片中甘草酸的含量

李憲剛 劉堯 于遠洋 張靜嬌 周凌

摘 要：目的：研究摸索HPLC測定喘嗽寧片中甘草酸（按甘草酸銨折算）含量的方法，并測定3批次喘嗽寧片中甘草酸的含量。方法：采用高效液相色譜法，Thermo SCIENTIFIC C18（4.6×250mm，5μm）色譜柱，流動相系統(tǒng)以乙腈為流動相A，0.1%磷酸溶液為流動相B，梯度洗脫（0～8 min，19%A；8～30 min，19%A→50%A；30min，50%A），流速1.0 mL/min；檢測波長250nm。結(jié)果：甘草酸銨與相鄰組分分離度良好，甘草酸銨線性范圍為0.1209～2.4173 μg（r=0.9999），線性關(guān)系良好，平均加樣回收率（n=6）為96.7%，RSD小于2.0%。結(jié)論：本文研究確定的方法符合檢驗方法驗證要求，可用于喘嗽寧片中甘草酸含量的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞：喘嗽寧片；HPLC；甘草酸銨

中圖分類號：R927.2 文獻標識碼：A 文章編號：1671-2064（2019）15-0198-02

0 引言

喘嗽寧片具有清熱平喘，止咳化痰功效。用于治療支氣管哮喘，喘息型支氣管炎，肺氣腫，早期肺心病等疾病。該中藥復方制劑由白果、苦杏仁、地龍、桑白皮、陳皮、黃芩、白前、苦參、甘草、茯苓10味藥材組成，加水煎煮，收集稠膏，壓片而制成?，F(xiàn)有質(zhì)量標準收載于衛(wèi)生部部頒標準：中藥成方制劑第十九冊[1]（編號：WS3-B-3696-98），目前，標準中尚無處方組分有效成分含量測定的控制項目。鑒于該品種處分組分比較復雜，標準制定年代久遠，因此建立準確、簡便的質(zhì)量分析方法至關(guān)重要。處方中甘草有解毒、祛痰、止痛、解痙以至抗癌等藥理作用，本文查閱相關(guān)文獻，建立HPLC梯度洗脫法對制劑中甘草酸[2-5]（以甘草酸銨為測定物質(zhì)，經(jīng)折算得出甘草酸含量）活性成分進行檢測，完善了本品的質(zhì)量控制體系[6-7]。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀。Waters e2695并配備有waters2998二極管陣列檢測器（DAD）、電子分析天平Sartorius BP211D②型。檢測用乙腈、甲醇、磷酸為色譜純，提取用乙醇為分析純，實驗用水為超純水。

對照品甘草酸銨（批號：110731-201619）購入自中檢院。收集已有產(chǎn)品上市的三個廠家各1批成品，包含薄膜衣0.6g/片，糖衣片、薄膜衣片0.35g/片三種規(guī)格。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

（1）對照品溶液。取甘草酸銨對照品適量，精密稱定，加70%乙醇制成每1ml含50μg的溶液，作為對照品溶液。（2）供試品溶液。取供試品20片，除去包衣，精密稱定，研細，取約1.0g，精密稱定，加70%乙醇100，加熱回流30min，放冷，再次稱定重量，用70%乙醇補足減失重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。（3）陰性樣品溶液。按喘嗽寧片的制備工藝，制成不含甘草藥材的陰性樣品。按上述供試品制備方法制備陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

甘草酸銨HPLC色譜圖1所示，選用Thermo SCIENTIFIC（4.6×250mm，5μm）色譜柱；流動相系統(tǒng)為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～8分鐘，19%A；8～30 min分鐘，19%A→50%A；30分鐘之后，50%A）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30攝氏度；檢測波長為250 nm。分別取對照品、供試品及陰性對照溶液各10μL，通過液相色譜儀進行檢測，理論板數(shù)以甘草酸銨峰計應不低于5000。

3 方法學考察

3.1 專屬性試驗

精密吸取對照品、供試品及陰性樣品溶液各10μL，按上述的色譜條件進行檢測并記錄液相譜圖（見圖1）。陰性樣品的色譜圖中，與對照品譜圖保留時間相同的位置未見干擾的色譜峰，結(jié)果表明方法專屬性良好，陰性無干擾。

3.2 線性關(guān)系考察

精密稱取甘草酸銨對照品（批號110731-201619純度：93.0%）10.83mg，置25ml量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，作為對照品儲備液。精密量取對照品儲備液3ml置10ml容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，分別取樣1ml、2ml、4ml、8ml、10置10ml容量瓶中加70%乙醇稀釋至刻度，精密量取對照品儲備液3ml置5ml容量瓶中，加70%乙醇稀釋至刻度，分別吸取上述溶液10μl測定峰面積，結(jié)果表明甘草酸銨的進樣量在0.1209～2.4173μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系，以對照品的濃度為X軸橫坐標，測得的峰面積為Y軸縱坐標，得到標準曲線，回歸方程為：y=738343x-9267.8，r=0.9999。

3.3 精密度試驗

儀器精密度：取上述制備方法制備的同一份對供試品溶液，同一儀器連續(xù)進樣6次，每次進樣量10μL，測定峰面積，計算各6次甘草酸銨峰面積值的RSD為0.9%。

3.4 穩(wěn)定性試驗

取供試品溶液同一批，在室溫條件下存放0h，2h，4h，8h，12h，24h的條件下進樣10μL，按甘草酸銨峰面積計算，RSD為1.1%，表明供試品溶液24h存放期內(nèi)基本穩(wěn)定。

3.5 重復性試驗

取相同批號的喘嗽寧片（0.6g/片）樣品，分別按上述供試品制備方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件分別進樣10μL，測定，6份樣品中的甘草酸銨含量RSD為1.1%，表明該方法的重復性良好。

3.6 加樣回收率試驗

精密稱取同一批樣品（已知含甘草酸銨1.64mg/g）6份各1.0g，分別精密加入對照品稱重10.83mg、10.80mg所制備的對照品儲備溶液4mL，按方法制備供試溶液，測定，計算加樣回收率，詳細見表1。

3.7 樣品測定

取收集的喘嗽寧片3批，按上述供試品制備方法的制得供試品溶液進行測定并依照外標法計算成品甘草酸銨含量，結(jié)果見表2。

4 討論

4.1 檢定波長選擇

本方法采用HPLC-DAD方法在200～400nm范圍內(nèi)對被測組分進行掃描并進行色譜峰純度檢測，結(jié)果表明，甘草酸銨在250 nm處有最大吸收且色譜峰純度良好，故本實驗的測測波長確定為紫外光250nm。

4.2 提取溶劑選用、提取方式考察

鑒于甘草藥材煎煮入藥，借鑒《中國藥典》（2015年版）甘草品種含量測定項下的制備方法，通過對50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇不同濃度提取溶劑的提取效力考察，比較了回流和超聲兩種提取方式及不同提取時間，依據(jù)實驗結(jié)果，確定加以70%乙醇加熱回流30min的方式作為本實驗供試品的提取制備方法。

4.3 結(jié)語

通過實驗確定的甘草酸銨的提取時間、提取溶劑、檢測波長、色譜柱類型、流動相條件，并進行了檢驗方法學的研究，該方法準確、快速、簡便，結(jié)果穩(wěn)定可靠，可有效對喘嗽寧片處方甘草藥材中活性成分進行質(zhì)量控制，為加強中藥復方制劑監(jiān)管，進一步提高質(zhì)量標準提供參考。

參考文獻

[1] 原衛(wèi)生部.衛(wèi)生部藥品標準[S].中藥成方制劑第十九冊，1992.

[2] 郭琪，程利娟，雷虹，等.高效液相色譜法測定甘草遠志合劑中甘草酸銨的含量[J].解放軍醫(yī)藥雜志，2013（11）：76-78.

[3] 李娟，賀競敏，張?zhí)K，等.兩種甘草酸含量測定方法對復方甘草片生產(chǎn)質(zhì)量的影響[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2012（18）：2820-2822.

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